（西北民族大學生命科學與工程學院， 蘭州 730030）

主要組織相容性復合物（MHC）含有高度多態(tài)性基因，編碼受體參與免疫反應，其Ⅱ類區(qū)域編碼兩種同種型DR和DQ的抗原呈遞分子，這些高度多態(tài)性的細胞表面糖蛋白主要結(jié)合來自外源抗原的肽片段，并將它們呈遞給CD4+T細胞以引發(fā)免疫應答[1]。DQA基因定位于BTA23 q21[2]，且具有高度多態(tài)性[3]。研究表明，每個MHC等位基因?qū)σ活悵撛诳乖蟹磻?，具有更多不同MHC位點的個體和群體能夠更好地應對多種感染[4]。同時，來自哺乳動物的DQA多態(tài)性信息可用于遺傳改良計劃。

近幾年來，已有大量對于哺乳動物DQA基因多態(tài)性的研究結(jié)果，Koutsogiannouli等[5]對棕色野兔中的DQA基因座進行分析，結(jié)果顯示674個樣本出現(xiàn)了37個等位基因。Plasil等[6]對三種駱駝科動物樣本的DQA外顯子2進行多態(tài)性分析發(fā)現(xiàn)了三個等位基因。Goda等[7]為了研究棕熊（Ursus arctos）種群中DQA基因的遺傳多樣性，在32只棕熊確定了DQA的四個等位基因。Archie等[8]發(fā)現(xiàn)30頭非洲大象中存在DQA基因的6個等位基因，3只亞洲象中存在DQA的4個等位基因。Koutsogiannouli等[9]使用SSCP方法結(jié)合測序研究了四種地中海家羊（Ovis aries）的DQA2基因，總共檢測到46個DQA2等位基因。Gonge等[10]對印度大額牛進行研究發(fā)現(xiàn)，在大額牛中存在三個DQA等位基因。這些研究結(jié)果均證明了DQA基因具有高度多態(tài)性。

大通牦牛由于其遺傳性能穩(wěn)定、產(chǎn)肉性能較好、生活力強、抗逆性優(yōu)良且能適應高山高寒的草場，深受牦牛飼養(yǎng)地區(qū)的歡迎，這對于建立我國牦牛制種和供種體系，改良我國牦牛品種，提高牦牛生產(chǎn)力及牦牛業(yè)整體效益乃至當?shù)匦竽翗I(yè)整體效益具有重要的經(jīng)濟意義。本研究通過測定大通牦牛DQA2基因序列再拼接得到CDS區(qū)（Coding sequence）序列，利用生物信息學方法，對大通牦牛DQA2基因CDS區(qū)序列編碼的蛋白質(zhì)理化性質(zhì)、疏水性/親水性、N-糖基化位點、信號肽預測和蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)、二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)等進行分析，以期為大通牦牛DQA2基因結(jié)構(gòu)與功能研究提供參考以及為其抗病育種提供理論基礎。

表1 BoLA-DQA2基因引物信息表

1 材料與方法

1．1 試驗材料

從寧夏農(nóng)墾賀蘭山奶業(yè)有限公司采集中國大通牦牛尾靜脈血液各10mL，低溫保存，帶回實驗室后-20℃冷凍保存。采用傳統(tǒng)的酚-氯仿抽提法提取血液基因組DNA，提取的DNA用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1．2 引物設計

根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中牛的DQA2基因序列（登錄號：XM_024983852.1），利用NCBI在線軟件Primer-BLAST反向互補設計BoLA-DQA基因4對引物（表1），分別擴增四個外顯子序列和部分內(nèi)含子序列，引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

1．3 基因組DNA混合池的構(gòu)建和PCR擴增

隨機選取55頭大通牦牛DNA樣品，每50個樣品構(gòu)建一個DNA混合池，以混合池DNA為模板進行擴增。擴增體系為：PCR反應總體積20μL，其中混合DNA1μL，2×Power Taq PCR MasterMix（百泰克）11μL，上下游引物（10μmol/L）各0.4μL，滅菌超純水7.6μL。擴增條件為：94℃預變性 5min；94℃變性 30s，退火（退火溫度見表1）30s，72℃延伸30s，從第二步開始進行30個循環(huán)；最后72℃延伸10min；4℃保存。擴增產(chǎn)物利用1%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。

1．4 序列測定與分析

選取擴增效果良好的DQA2基因4個外顯子PCR擴增產(chǎn)物送至蘇州金唯智生物科技有限公司進行雙向測序，測序結(jié)果用MEGA6.0和Editseq軟件進行比對，獲得DQA2基因CDS區(qū)序列。

1．5 生物信息學分析

對BoLA-DQA2基因進行生物信息學分析，所用到的網(wǎng)站及軟件見表2。

表2 BoLA-DQA2基因生物信息學分析方法

2 結(jié)果與分析

2．1 大通牦牛DQA2基因編碼蛋白質(zhì)理化特性預測與分析

表3 大通牦牛 DQA2基因編碼蛋白質(zhì)理化特性

蛋白質(zhì)的基本性質(zhì)包括相對分子質(zhì)量、氨基酸組成和等電點等，利用Expasy服務器上的protparam程序預測大通牦牛DQA2基因編碼蛋白質(zhì)理化特性（表3）。大通牦牛DQA2基因編碼253個氨基酸，20種氨基酸所占比例見圖1，可以看出亮氨酸（Leu）最多，占整個氨基酸組成的10.3%，色氨酸（Trp）最少，占1.2%。基因編碼產(chǎn)物不穩(wěn)定指數(shù)大于40，表明該基因編碼產(chǎn)物不穩(wěn)定[11]。

圖1 大通牦牛DQA2基因編碼蛋白質(zhì)氨基酸組成

2．2 大通牦牛 DQA2基因編碼蛋白質(zhì)疏水性/親水性預測和分析

運用Expasy服務器上的Protscale程序預測大通牦牛DQA基因編碼蛋白質(zhì)的疏/親水性，結(jié)果（圖2）顯示該蛋白質(zhì)第234位蘇氨酸（Thr）疏水性最強(+3.122) ，第51位的谷氨酸（Glu）和第52位的苯丙氨酸（Phe）親水性最強（－1.900）。整個編碼產(chǎn)物中，親水氨基酸占55.28%，疏水氨基酸占45.72%，平均分值為-0.021，表現(xiàn)為親水性，由此可推斷大通牦牛DQA2基因編碼的蛋白質(zhì)是一種可溶性蛋白質(zhì)。

圖2 大通牦牛DQA2基因編碼蛋白質(zhì)的疏水性/親水性預測

2．3 大通牦牛 DQA2基因編碼蛋白質(zhì) N-糖基化位點的預測和分析

蛋白質(zhì)糖基化是指在蛋白質(zhì)合成的同時或合成后，在酶的催化下寡糖鏈被連接在特定的糖基化位點，形成糖蛋白。利用CBS在線分析軟件Net NGlyc 1.0對DQA的N-糖基化位點進行預測得出(圖3)，大通牦牛DQA2基因編碼蛋白質(zhì)具有4個潛在的N-糖基化位點，分別為Asn31、Asn96、Asn260、Asn369。

圖3 大通牦牛 DQA2基因編碼蛋白質(zhì) N-糖基化位點預測

2．4 大通牦牛DQA2基因編碼蛋白質(zhì)信號肽分析

信號肽位于蛋白質(zhì)N端，一般由16～26個氨基酸殘基組成[12]。大通牦牛 DQA基因編碼蛋白質(zhì)信號肽分析結(jié)果（圖4）顯示，DQA2基因編碼蛋白質(zhì)的分值曲線較為典型，其中C值和Y值趨向于+1，S值在剪切位點之前較高而在剪切位點之后變低。大通牦牛DQA基因在第1～23位氨基酸之間存在信號肽，其切割點位于23～24位的氨基酸之間（信號肽剪切點主要根據(jù)Y最大值大于0.5來判斷）。

圖4 大通牦牛DQA2基因編碼蛋白質(zhì)信號肽分析

2．5 大通牦牛DQA2基因編碼蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)域分析

利用TMHMM程序分析其跨膜結(jié)構(gòu)域，從結(jié)果（圖5）可以看出，DQA2編碼的蛋白質(zhì)共存在1個典型的跨膜螺旋區(qū)，氨基酸序號為216-239。由此可推測，大通牦牛DQA2基因CDS區(qū)所編碼的蛋白質(zhì)為跨膜蛋白。

圖5 大通牦牛DQA2基因編碼蛋白質(zhì)的跨膜區(qū)域預測結(jié)果

2．6 大通牦牛DQA2基因編碼蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)預測與分析

蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)是指多肽鏈主鏈折疊產(chǎn)生的由主鏈內(nèi)和主鏈間周期性氫鍵維系的有規(guī)則構(gòu)象，這些構(gòu)象借助各種次級鍵共同構(gòu)成其三級結(jié)構(gòu)。大通牦牛DQA基因編碼蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預測結(jié)果（圖6）顯示，二級結(jié)構(gòu)組分中α-螺旋（Hh）占13.44%，β-折疊（Ee）占31.62%，無規(guī)則卷曲（Cc）占54.94%。其中Hh＜45%，Ee＞20%，因此判斷大通牦牛DQA基因編碼蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)為混合型[13]。其三級結(jié)構(gòu)見圖7。該蛋白質(zhì)存在較多的無規(guī)則卷曲，結(jié)構(gòu)較為復雜，該結(jié)果同時也表明了大通牦牛DQA2編碼的蛋白質(zhì)由α-螺旋、β-折疊和無規(guī)則卷曲組成，與二級結(jié)構(gòu)預測結(jié)果一致。

圖6 大通牦牛 DQA 基因編碼蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預測

圖7 大通牦牛DQA2基因編碼蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預測

2．7 大通牦牛DQA2基因編碼蛋白質(zhì)功能預測

表4 DQA2基因編碼的蛋白質(zhì)功能分析

通過蛋白功能預測分析，DQA2基因編碼的蛋白質(zhì)主要功能包括：信號受體活性、催化活性、運載體、調(diào)節(jié)代謝過程、細胞定位及免疫系統(tǒng)過程等（表4），由此推斷DQA2基因編碼的蛋白質(zhì)有細胞間信號轉(zhuǎn)導、調(diào)節(jié)細胞代謝及參與免疫系統(tǒng)過程的功能。

3 討論

在哺乳動物中，DQA2基因?qū)儆谟懈叨榷鄳B(tài)性的基因組，對DQA2基因進行生物信息學分析有助于對動物種群資源保護、物種的多樣性等方面進行探討[14]。DQA2基因與牛乳房炎的抗性和易感性有關[15]，通過對其生物信息學分析產(chǎn)生的結(jié)果對實際生產(chǎn)有一些幫助。

在DQA2基因編碼的19種氨基酸中，有26個營養(yǎng)價值最高的亮氨酸（Leu），而對蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)發(fā)揮重要作用的半胱氨酸（Cys）為4個，說明大通牦牛DQA2基因編碼蛋白質(zhì)中的半胱氨酸高度保守。許多膜整合蛋白質(zhì)是兼性分子，它們的多肽鏈可橫穿膜一次或多次，以疏水區(qū)跨越脂雙層的疏水區(qū)，與脂肪酸鏈共價結(jié)合，而親水的極性部分位于膜的內(nèi)外表面。這種蛋白質(zhì)跨越脂雙層，被稱為跨膜蛋白，主要分單個跨膜的α-螺旋、多個α-螺旋和β-螺旋3種特殊的結(jié)構(gòu)類型，其在細胞信號傳導過程中發(fā)揮著物質(zhì)運輸、信息識別、保護等作用[16]。跨膜蛋白的標志是在多肽鏈中出現(xiàn)多個親水區(qū)與疏水區(qū)間隔的現(xiàn)象[17]，由于跨膜蛋白存在著等同受體的作用，對于大通牦牛DQA2基因編碼蛋白質(zhì)疏水性/親水性預測和分析，有利于理解其性質(zhì)與功能。本研究中發(fā)現(xiàn)DQA2基因編碼的蛋白中親水性氨基酸占比超過50%，推測為可溶性蛋白。通過TMHMM軟件在線預測，發(fā)現(xiàn)該蛋白存在明顯的跨膜螺旋區(qū)，為跨膜蛋白。

蛋白質(zhì)的糖基化是最重要的翻譯后修飾之一，與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的關系密切。蛋白質(zhì)糖基化修飾能夠影響多肽的構(gòu)象，使多肽鏈具有一定剛性，達到增強蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的作用，進而調(diào)控在組織和細胞中的定位、功能和活性[18]，糖基化位點發(fā)生變化可能與疾病的發(fā)生有關[19]。大通牦牛DQA2基因編碼蛋白質(zhì)具有4個潛在的N-糖基化位點，分別為 Asn31、Asn96、Asn260、Asn369。

同源建模是一種根據(jù)蛋白結(jié)構(gòu)保守穩(wěn)定性遠大于蛋白氨基酸序列的理論預測蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的方法，如果氨基酸序列相似性達30%以上，則可用已知蛋白結(jié)構(gòu)作為模板模擬蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)[20,21]。信號肽是蛋白多肽鏈中用于指導蛋白質(zhì)跨膜轉(zhuǎn)移(定位)的N-末端的氨基酸序列，一般由15～30個氨基酸組成，蛋白成熟后信號肽將被剪切掉。本研究中大通牦牛DQA基因在第1～23位氨基酸之間存在信號肽，其切割點位于23～24位的氨基酸之間。功能分析發(fā)現(xiàn)，DQA2基因編碼的蛋白質(zhì)可與受體結(jié)合，參與免疫系統(tǒng)過程，推測其與物種的抗病性相關，不過這還有待進一步研究。并且其有催化活性和運載體的功能，說明其參與細胞間信號和物質(zhì)的傳遞，這與蛋白結(jié)構(gòu)域和跨膜結(jié)構(gòu)預測結(jié)果相一致。

本研究通過生物信息學和基因組學得出的大通牦牛DQA2基因功能和結(jié)構(gòu)，可以為今后更好地研究大通牦牛的抗病育種提供重要的理論依據(jù)。