周 箴，徐云華，張菲菲，趙 藝，郭 林，付國(guó)龍，沈盛萍，冷雪嬌

1. 上海市胸科醫(yī)院，上海交通大學(xué)附屬胸科醫(yī)院，上海肺部腫瘤臨床醫(yī)學(xué)中心，上海 200030；2. 上海立迪生物技術(shù)股份有限公司，上海201203

肺癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一和最常見的癌癥死亡原因之一，被認(rèn)為是當(dāng)今世界上對(duì)人類健康危害最大的惡性腫瘤，其中以非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）最為常見，約占肺癌的80%[1]。臨床上晚期肺癌的主要治療方式包括化學(xué)治療（化療）、放射治療（放療）及分子靶向治療等。盡管有多種化療藥物和分子靶向藥物在臨床上得到應(yīng)用，但存在化療藥物效果不夠理想和分子靶向藥物易耐藥等問題。晚期肺癌患者的5年生存率仍很低，因此臨床上迫切需要尋找新的治療手段和治療靶點(diǎn)[2-4]。

近年來，腫瘤免疫治療技術(shù)發(fā)展迅速，其中以程序性死亡受體1（programmed death-1，PD-1）及其配體程序性死亡配體1（programmed death-ligand 1，PD-L1）為靶點(diǎn)的免疫檢查點(diǎn)抑制劑在肺癌臨床治療中取得了突破性的進(jìn)展，其機(jī)制是通過阻斷免疫細(xì)胞上的PD-1與腫瘤細(xì)胞上PD-L1的相互作用，從而解除T細(xì)胞活性的受抑狀態(tài)，促進(jìn)T細(xì)胞再活化，從而發(fā)揮抗腫瘤效果[5-8]。隨著2015年P(guān)D-1抑制劑納武單抗（nivolumab）和派姆單抗（pembrolizumab）獲批用于轉(zhuǎn)移性鱗狀NSCLC和非鱗狀NSCLC的治療，免疫治療在肺癌的治療中越來越受到重視。同時(shí)，國(guó)內(nèi)也陸續(xù)有自主研發(fā)的免疫檢查點(diǎn)抑制劑進(jìn)入臨床試驗(yàn)。

然而，PD-1/PD-L1免疫檢查點(diǎn)抑制劑的臨床療效僅為20%～45%，顯示出明顯的個(gè)體差異，并且存在由免疫介導(dǎo)產(chǎn)生的不良事件以及腫瘤快速進(jìn)展等情況[9-10]。因此，明確哪些患者能從PD-1/PD-L1免疫治療中獲益是一個(gè)亟需解決的問題。

來源于患者原代腫瘤組織的人源異種移植（patientderived tumor xenograft，PDX）模型與傳統(tǒng)細(xì)胞系異種移植（cell-derived xenograft，CDX）模型[11-12]及基因工程鼠模型不同，其直接采用患者腫瘤組織來建立皮下移植瘤模型，能更好地保留腫瘤在個(gè)體中特殊的功能性基因結(jié)構(gòu)及生物學(xué)標(biāo)志物，更接近個(gè)體化的臨床生物學(xué)特征，重現(xiàn)人類癌癥的復(fù)雜狀態(tài)，如腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性和腫瘤微環(huán)境等[13-14]，是目前國(guó)際公認(rèn)的最能代表人類腫瘤遺傳信息特征的小鼠異種移植瘤模型[15-17]，能為藥物的篩選及療效觀察提供更好的預(yù)測(cè)。近年來，PDX技術(shù)發(fā)展迅速，展現(xiàn)出其在藥物篩選、療效評(píng)估、臨床同期治療效果預(yù)測(cè)和臨床后期耐藥原因剖析上的重要作用。在一定條件下，PDX樣本對(duì)傳統(tǒng)化療藥物的有效率和耐藥率的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確度可達(dá)90%和97%[15]。近年來人源化免疫PDX模型均建立在PDX模型的基礎(chǔ)上，使之同時(shí)包含人類腫瘤細(xì)胞和免疫細(xì)胞；該模型是評(píng)價(jià)新型免疫治療劑效果的一個(gè)具有巨大潛力的轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)平臺(tái)[18-20]。長(zhǎng)久以來，以人類CD34+造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞（hematopoietic stem and progenitor cell，HSPC）為基礎(chǔ)的人源免疫系統(tǒng)重建是多數(shù)研究的重點(diǎn)[21-24]，但因?yàn)槟Ｐ褪褂玫男∈鬄槊庖呷毕菪∈?，缺少T細(xì)胞發(fā)育所必需的胸腺，所以該模型小鼠體內(nèi)無法形成成熟的T細(xì)胞，在細(xì)胞免疫和體液免疫方面均存在功能缺陷。此外，該模型構(gòu)建時(shí)間長(zhǎng)，構(gòu)建過程復(fù)雜；而且人臍帶血來源的CD34+HSPC多來自不同個(gè)體，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果不穩(wěn)定，因此該模型很難大規(guī)模應(yīng)用。

目前僅有少量研究[25-26]使用外周血單核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）建立人源化免疫小鼠。PBMC包含已經(jīng)發(fā)育成熟的免疫細(xì)胞，細(xì)胞功能完善，而且模型制備時(shí)間短，可以較快獲得人CD3+T細(xì)胞。因此，本研究在此基礎(chǔ)上探索了PBMC人源化免疫PDX模型的方法，對(duì)采用PBMC建立人源化免疫肺癌PDX模型的可行性進(jìn)行了研究，并初步驗(yàn)證該模型用于評(píng)估PD-1抑制劑治療NSCLC的效果。

1 材料與方法

1.1 腫瘤樣本

樣本來源于2015年8月—2017年12月在上海交通大學(xué)附屬胸科醫(yī)院治療的晚期NSCLC患者的胸腔積液或活檢組織（多數(shù)為肺癌小活檢組織，少數(shù)為遠(yuǎn)處淋巴結(jié)活檢組織）。樣本入組標(biāo)準(zhǔn)為未見驅(qū)動(dòng)基因突變、基因重排或融合的晚期NSCLC。本項(xiàng)目獲上海市胸科醫(yī)院倫理委員會(huì)審查及批準(zhǔn)（KS1872）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雌性CB17-SCID小鼠（重癥聯(lián)合免疫缺陷小鼠），6～8周齡，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（京）2016-0006。雌性NCG小鼠（高度免疫缺陷小鼠），6～8周齡，購自南京大學(xué)-南京生物醫(yī)藥研究院，生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（蘇）2015-0001。所有小鼠均飼養(yǎng)于上海立迪生物技術(shù)股份有限公司SPF級(jí)動(dòng)物房的獨(dú)立通風(fēng)換氣（IVC）恒溫恒壓系統(tǒng)[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK（滬）2015-0015]，環(huán)境溫度20～26 ℃，濕度40%～70%，12 h/d明暗交替。在正式實(shí)驗(yàn)前，適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d。

1.3 PDX模型建立

在生物安全柜中，取新鮮的活檢組織樣品，置于冰上，加Hank's平衡鹽溶液洗滌2次，剔除非腫瘤組織。將腫瘤組織切成1 cm×1 cm×1 cm大小，植入CB17-SCID小鼠的一側(cè)背部近腋窩的皮下（記為P0代）。患者的胸腔積液采用微流控技術(shù)（ClearCell FX1系統(tǒng)，新加坡Clearbridge BioMedics公司）富集腫瘤細(xì)胞，每只小鼠接種約5×106細(xì)胞至小鼠背部皮下（記為P0代）。當(dāng)P0代腫瘤生長(zhǎng)至500～800 mm3時(shí)，取出腫瘤，采用上述活檢樣品的操作，進(jìn)行小鼠體內(nèi)傳代（記為P1代），隨后傳代依次記為P2代、P3代……。傳代期間對(duì)小鼠體質(zhì)量以及腫瘤大小進(jìn)行觀察，并凍存腫瘤樣品。

取PDX模型傳代腫瘤組織經(jīng)蘇木精-伊紅染色（hematoxylin and eosin staining，H-E staining，H-E染色）后行組織病理學(xué)觀察，驗(yàn)證其與患者原始腫瘤組織病理形態(tài)的相似性。

1.4 腫瘤的PD-L1表達(dá)檢測(cè)

通過免疫組織化學(xué)法（免疫組化）檢測(cè)肺癌PDX模型傳代腫瘤組織PD-L1的表達(dá)情況。收集P1～P2代PDX腫瘤組織檢查樣本，用10%甲醛溶液固定，經(jīng)過包埋、切片、脫蠟、抗原修復(fù)、背景封閉、PD-L1染色[ （E1L3N）XP?兔抗人PD-L1單抗，美國(guó)CST]、顯色等步驟進(jìn)行PD-L1免疫組化染色。按照染色程度評(píng)分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下：得分=染色密度評(píng)分（0～3分）×染色面積評(píng)分（0～3分）。若得分＜1分，則樣品PD-L1的表達(dá)為陰性（-）；若得分≥1分，則樣品PD-L1的表達(dá)為陽性。得分1～3分記為+，4～6分記為++，7～9分記為+++。

1.5 PDX模型人源化免疫重建

1.5.1 PDX腫瘤單細(xì)胞懸液的制備 將已建好的PDX模型傳代腫瘤（P1～P2代）自小鼠體內(nèi)取出，于生物安全柜中去除非腫瘤組織和壞死組織；將組織剪切成1～3 mm3，使用膠原酶于37 ℃消化腫瘤塊1～2 h；200×g離心3 min，去除上清液，收集細(xì)胞懸液。

1.5.2 PBMC的分離與培養(yǎng) 取正常人外周血，用密度梯度離心法分離PBMC，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液重懸，細(xì)胞密度調(diào)整至3×106/mL。將分離的PBMC加入經(jīng)絲裂霉素C處理的1×106/mL腫瘤細(xì)胞中，共培養(yǎng)6 d，培養(yǎng)液為含10 ng/mL IL-2和10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液。

1.5.3 細(xì)胞接種 收集共培養(yǎng)6 d后致敏的PBMC，與新鮮消化后的PDX腫瘤細(xì)胞按1:10的比例混合，接種約5.5 ×106細(xì)胞至NCG小鼠背部皮下。

1.5.4 免疫熒光檢測(cè) 待腫瘤組織長(zhǎng)至100 mm3后取出，用4%多聚甲醛溶液固定、30%蔗糖溶液脫水、OCT包埋劑包埋后，進(jìn)行冰凍切片，切片厚度為10 μm。用兔抗人CD45抗體（英國(guó)Abcam）作為一抗，Alexa Fluo 488標(biāo)記的羊抗兔IgG（英國(guó)Abcam）進(jìn)行二抗染色，DAPI進(jìn)行核染色。

1.6 采用人源化免疫PDX模型評(píng)估PD-1抑制劑療效

待人源化免疫重建PDX模型上腫瘤長(zhǎng)至約100 mm3時(shí)，將不同臨床樣本建立的模型小鼠分別隨機(jī)分成2組，即給藥組和對(duì)照組，每組6只。給藥組按20 mg/kg的劑量給予PD-1抑制劑信迪利單抗（sintilimab）注射液[信達(dá)生物制藥（蘇州）有限公司]，給藥頻率為每2 d 1次，腹腔注射，至實(shí)驗(yàn)結(jié)束（至少21 d），給予CO2窒息處死。對(duì)照組給予PBS。每周測(cè)量小鼠體質(zhì)量和腫瘤體積2次，腫瘤體積計(jì)算公式為V=0.5×ab2（a、b分別代表腫瘤的長(zhǎng)徑和短徑）；并計(jì)算腫瘤生長(zhǎng)抑制率（TGI，tumor growth inhibition）（%）=[1- （給藥組給藥后的腫瘤體積－給藥組首次給藥時(shí)的腫瘤體積） / （對(duì)照組給藥后的腫瘤體積－對(duì)照組首次給藥時(shí)的腫瘤體積） ]×100%。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用Graphpad 6.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行作圖及數(shù)據(jù)處理，定量資料用表示，采用t檢驗(yàn)比較組間差異。P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PDX模型建立

共獲得NSCLC患者44份活檢組織樣本和29份胸腔積液樣本，每份樣本接種1～2只小鼠。其中活檢組織樣本有15份建模成功，成功率為34.1%（15/44）；胸腔積液樣本有13份建模成功，成功率為44.8%（13/29）；總建模成功率為38.4%（28/73）。對(duì)成功建立的PDX模型進(jìn)行編號(hào)，其中來源于活檢組織的以LUPF開頭，來源于胸腔積液的以CTC開頭。

通過H-E染色發(fā)現(xiàn)，PDX模型腫瘤與患者原始腫瘤的細(xì)胞病理形態(tài)相似（圖1），表明PDX模型能夠很好地保持臨床腫瘤的細(xì)胞形態(tài)特征。

圖1 患者臨床樣本與PDX模型腫瘤樣本的病理學(xué)觀察（H-E染色，×100）Fig 1 Pathological observation of clinical samples and PDX tumors (H-E staining, ×100)

2.2 免疫組化法檢測(cè)PD-L1的表達(dá)

對(duì)成功建立的28個(gè)肺癌PDX模型中的16個(gè)PDX模型P1～P2代進(jìn)行PD-L1表達(dá)檢測(cè)，共發(fā)現(xiàn)6個(gè)PD-L1表達(dá)陽性的模型（表1，圖2）。

圖2 免疫組化法檢測(cè)PDX模型腫瘤的PD-L1表達(dá)Fig 2 PD-L1 expression in the tumors from PDX models by immunohistochemistry

表1 PDX模型腫瘤的PD-L1表達(dá)檢測(cè)結(jié)果Tab 1 Results of PD-L1 expression in PDX models

2.3 PDX模型人源化免疫重建

將新鮮消化后的PDX腫瘤細(xì)胞重懸，與致敏的PBMC混合后，接種至NCG小鼠皮下。28 d后，取人源化免疫PDX模型中的腫瘤組織，行CD45免疫熒光染色，檢測(cè)腫瘤組織中是否含有人源免疫細(xì)胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)CD45染色陽性的免疫細(xì)胞散在分布于腫瘤組織中，而未混合人PBMC的PDX模型中，未檢測(cè)到免疫細(xì)胞（圖3）。

本 研 究 分 別 選 擇 了 CTC15035、CTC160049、LUPF143的PDX模型腫瘤細(xì)胞來構(gòu)建人源化免疫PDX腫瘤模型，其中CTC15035和CTC160049為PD-L1不同陽性表達(dá)水平的PDX腫瘤模型，LUPF143為PD-L1表達(dá)陰性的PDX腫瘤模型。人源化免疫PDX腫瘤模型的編號(hào)與原PDX模型編號(hào)保持一致。

圖3 人源化免疫PDX模型腫瘤組織的CD45免疫熒光染色（×200）Fig 3 CD45 immunof l uoresence staining in the tumor tissue of PDX model with humanized immunity (×200)

2.4 采用PBMC人源化免疫肺癌模型評(píng)估PD-1抑制劑的效果

CTC15035模型PD-L1表達(dá)呈強(qiáng)陽性（++），給予PD-1抑制劑后，腫瘤生長(zhǎng)明顯被抑制，初次給藥后21 d PD-1抑制劑的TGI為82.6%；CTC160049模型PD-L1表達(dá)呈陽性（+），同樣看到PD-1抑制劑對(duì)腫瘤有一定的抑制作用，初次給藥后21 d PD-1抑制劑的TGI為11.9%；LUPF143模型PD-L1表達(dá)陰性（-），至初次給藥后42 d仍未觀察到PD-1抑制劑對(duì)腫瘤的抑制作用（圖4）。

圖4 PD-1抑制劑在人源化免疫腫瘤模型中的效果評(píng)價(jià)Fig 4 Evaluation of PD-1 inhibitors in PDX models with humanized immunity

3 討論

近年來，腫瘤免疫治療技術(shù)發(fā)展迅速，其中以PD-1/PD-L1為靶點(diǎn)的免疫檢查點(diǎn)抑制劑已在肺癌臨床治療中取得了突破性的進(jìn)展，PD-1抑制劑派姆單抗和納武單抗已在中國(guó)獲批用于轉(zhuǎn)移性NSCLC的一線/二線治療。但是，PD-1/PD-L1免疫檢查點(diǎn)抑制劑的臨床療效有限。

本研究建立了能用于評(píng)估PD-1/PD-L1免疫檢查點(diǎn)抑制劑療效的人源化免疫肺癌PDX動(dòng)物模型，對(duì)于肺癌的抗腫瘤免疫治療的轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究具有重要意義，為腫瘤免疫及其微環(huán)境的研究提供了一個(gè)動(dòng)物模型的研究平臺(tái)。

傳統(tǒng)的PD-1/PD-L1免疫檢查點(diǎn)抑制劑療效臨床前評(píng)價(jià)的指標(biāo)體系是采用鼠源同系動(dòng)物模型或人源腫瘤細(xì)胞系異種移植動(dòng)物模型，但這些腫瘤模型存在著諸多缺陷。比如鼠源同系動(dòng)物模型的免疫系統(tǒng)和人的免疫系統(tǒng)存在一定的差異，不能反映藥物在人體里的免疫作用機(jī)制。人源腫瘤細(xì)胞系在長(zhǎng)期體外培養(yǎng)條件下，表現(xiàn)出均一的組織學(xué)特征，其生物學(xué)特性和分子特征已經(jīng)和原發(fā)腫瘤相差甚遠(yuǎn)。利用新鮮腫瘤標(biāo)本，將腫瘤組織塊異種移植至免疫缺陷小鼠皮下，建立PDX模型，最大限度地保留了腫瘤的原有特性，是目前腫瘤新藥研究及轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究最理想的動(dòng)物模型[15,27]。許多實(shí)驗(yàn)研究[28-31]表明，PDX腫瘤組織經(jīng)過連續(xù)傳代，仍然保持與原始腫瘤相似的腫瘤特性，如腫瘤標(biāo)志物、蛋白表達(dá)譜、基因組水平、藥物敏感性等。免疫系統(tǒng)人源化小鼠就是指通過移植人的造血干細(xì)胞或免疫組織、細(xì)胞，在小鼠體內(nèi)重建人類免疫系統(tǒng)。近年來人們建立了有效的免疫系統(tǒng)人源化小鼠模型，應(yīng)用于人類免疫應(yīng)答及相關(guān)疾病的研究。這種人源化小鼠模型還可應(yīng)用于感染、腫瘤、移植等多個(gè)領(lǐng)域[12,32]。

本課題先在SCID小鼠上建立人肺癌PDX腫瘤動(dòng)物模型，并將成熟的人PBMC與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)，然后將共培養(yǎng)后的PBMC再與新鮮消化的腫瘤細(xì)胞混合直接注射于NCG小鼠皮下，使人的PBMC在小鼠腫瘤局部出現(xiàn)，成為腫瘤浸潤(rùn)的免疫細(xì)胞，同時(shí)創(chuàng)建了腫瘤免疫微環(huán)境，由此建立了人源化免疫的肺癌PDX模型。本方法克服了通過尾靜脈注射PBMC[33-34]可能導(dǎo)致的宿主免疫排斥反應(yīng)，同時(shí)保證了免疫治療藥物藥效方面數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。

臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)（KEYNOTE-042研究）[35]表明：PD-1抑制劑如帕博利珠單抗（pembrolizumab）治療必須有伴隨診斷，僅PD-L1表達(dá)≥1%的患者可以從治療中獲益，并且PD-L1表達(dá)水平越高，受益越多。我們選用PD-1抑制劑信迪利單抗對(duì)不同PD-L1表達(dá)水平的人源化免疫肺癌PDX模型進(jìn)行腫瘤干預(yù)，觀察藥物療效，以此驗(yàn)證我們建立的該模型能在動(dòng)物體內(nèi)評(píng)估PD-1/PD-L1免疫檢查點(diǎn)抑制劑的療效。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示：PD-L1表達(dá)陽性的人源化免疫肺癌PDX模型的腫瘤生長(zhǎng)能被PD-1抑制劑抑制，并且PD-L1表達(dá)水平越高，TGI越大；但是，本實(shí)驗(yàn)挑選的模型數(shù)量較少，證據(jù)尚不充分，有待在更多的不同PD-L1表達(dá)水平的模型加以驗(yàn)證。

本研究的PBMC人源化免疫肺癌PDX動(dòng)物模型可能可以幫助指導(dǎo)臨床用藥，比如預(yù)測(cè)NSCLC患者能否從PD-L1/PD-1免疫治療中獲益，以及研究是否有預(yù)測(cè)PD-1/PD-L1抑制劑臨床療效的其他生物學(xué)標(biāo)志物；同時(shí)，該模型可以作為預(yù)測(cè)其他免疫治療方法臨床療效的新平臺(tái)。