鄭慶柱， 譚海運(yùn)， 高 雪， 紀(jì)雪峰， 田 俠

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院/青島市農(nóng)村環(huán)境工程研究中心，山東青島 266109；2.西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所，西藏拉薩 850000)

常見環(huán)境脅迫有干旱脅迫、鹽脅迫、低溫脅迫及重金屬脅迫等[1]，以干旱與鹽脅迫最為普遍。干旱是由氣候異常所造成的自然災(zāi)害，發(fā)生頻率高、影響范圍廣、危害性大[2]，嚴(yán)重危害農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，尤其西藏、新疆等干旱半干旱地區(qū)[3]，苗期干旱已威脅到藏區(qū)糧食安全和社會穩(wěn)定。土壤鹽漬化是我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)面臨的另一大難題，嚴(yán)重影響藏區(qū)青稞的幼苗生長。青稞(Hordeumvulgare)為禾本科大麥屬作物，主要分布在我國西藏自治區(qū)、青海省、四川省及甘肅省等地，是青藏高原的重要農(nóng)作物。由于青藏高原環(huán)境惡劣，青稞極易遭受干旱及鹽分等環(huán)境脅迫，因此研究青稞特別是青稞幼苗期對干旱與鹽脅迫的抗逆性對穩(wěn)定和提高藏區(qū)青稞產(chǎn)量具有重要意義。

逆境脅迫可引起植物光合機(jī)構(gòu)損傷及光合色素含量下降，降低其光合作用效率[4]。環(huán)境脅迫條件下植物體內(nèi)活性氧產(chǎn)生與清除的動態(tài)平衡被打破[5]，從而使植物抗氧化酶的活性發(fā)生變化。目前，關(guān)于植物在逆境脅迫下的生理生化機(jī)制研究已有報道，井大煒等發(fā)現(xiàn)，水分脅迫下楊樹幼苗光合作用減弱，超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)及過氧化氫酶(CAT)活性先升后降[6]；鞠樂等研究表明，水分脅迫下大麥SOD活性、丙二醛(MDA)含量、可溶性糖含量和蛋白含量顯著上升，POD與CAT活性則先升后降[7]；韓浩章等報道，鹽脅迫下香樟葉片光合速率下降，POD、POD活性先升后降[8]。盡管多種植物在環(huán)境脅迫下的光合特性與抗氧化酶活性的研究已有報道，但主要研究小麥、玉米幼苗、豌豆等適合丘陵與平原地帶種植的作物，針對適合青藏高原種植的青稞的抗逆性研究報道較少。

采用水培法培養(yǎng)青稞幼苗，通過向營養(yǎng)液中添加聚乙二醇(PEG-6000)及NaCl模擬干旱脅迫、鹽脅迫及鹽旱復(fù)合脅迫環(huán)境，研究3種脅迫條件下青稞光合能力、滲透調(diào)節(jié)能力及抗氧化酶活性變化規(guī)律，以期為青稞抗逆性育種和栽培技術(shù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試驗設(shè)計

試驗于2018年3—9月在青島農(nóng)業(yè)大學(xué)實驗室進(jìn)行，以藏青2000(西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院提供)為研究對象，水培法培養(yǎng)青稞幼苗。種子先用純水洗凈，再用15% H2O2浸泡15 min，最后用純水沖洗至無氣泡。將種子移至鋪有紗布和濾紙的托盤上，于20 ℃黑暗培養(yǎng)箱中催芽，種子露白后移植于石英砂中，每盆10株，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)。當(dāng)幼苗長出2張真葉時用1/3 Hoagland營養(yǎng)液培養(yǎng)，9 d后換為 1/2 Hoagland 營養(yǎng)液再培養(yǎng)至3張葉時，將所有幼苗盆栽分7組。培養(yǎng)箱溫度20 ℃/10 ℃(晝/夜)、光照度20 000 lx，光照周期14 h/10 h(晝/夜)，脅迫處理見表1。

表1 青稞3種脅迫處理方式

1.2 測定方法

1.2.1 葉綠素含量與相對水含量測定 葉綠素含量采用李合生的方法[9]測定。稱0.2 g頂展葉，剪碎，加入50 mL提取液中(V乙醇∶V丙酮=1 ∶1)，在溫度為25 ℃黑暗條件下提取 24 h，分別于440、645、663 nm處測吸光度，計算葉綠素含量。相對含水量根據(jù)Tambussi等的方法[10]測定。葉片測鮮質(zhì)量后于蒸餾水中浸泡24 h，取出測飽和鮮質(zhì)量，于溫度為 80 ℃ 條件下烘24 h后測干質(zhì)量，相對含水量=(鮮質(zhì)量-干質(zhì)量)/(飽和鮮質(zhì)量-干質(zhì)量)×100%。

1.2.2 氣體交換參數(shù)與葉綠素?zé)晒鈪?shù)測定 氣體交換參數(shù)采用Li-6400型便攜式光合儀(美國 LI-COR 公司)測定，包括青稞葉片凈光合速率(Pn)、氣孔導(dǎo)度(Gs)、胞間CO2濃度(Ci)和蒸騰速率(Tr)。溫度和光照用便攜式光合儀的溫控系統(tǒng)和人工光源，CO2濃度為360 μmol/mol，光照度為700 μmol/(m2·s)，09：00—11：30測定。葉綠素?zé)晒鈪?shù)采用FMS-2型脈沖調(diào)制式熒光儀(Hansatech，英國)測定，將葉片暗適應(yīng)20 min后測Fo和Fm。在3 000 μmol/(m2·s)強(qiáng)閃光下，測Fm′、Fs。PSⅡ最大光化學(xué)效率Fv/Fm=(Fm-Fo)/Fm、PSⅡ?qū)嶋H光化學(xué)效率ΦPSⅡ=(Fm′-Fs)/Fm′。

1.2.3 可溶性糖與可溶性蛋白含量測定 可溶性糖含量采用蒽酮比色法測定。取干樣粉0.1 g加入10 mL蒸餾水煮沸 30 min，冷卻過濾，復(fù)提2次，濾液定容50 mL。取提取液加入蒽酮-硫酸溶液混勻，沸水浴10 min，冷卻后在620 nm波長下測吸光度，計算可溶性糖含量?？扇苄缘鞍缀坎捎每捡R斯亮藍(lán)法[11]測定。稱鮮葉片0.5 g加蒸餾水研磨成勻漿，定容10 mL，室溫放置1 h，離心，取上清液加入考馬斯亮藍(lán)G-250，混勻放置2 min后用分光光度計在595 nm下測D值，計算可溶性蛋白含量。

1.2.4 再二醛(MDA)含量及抗氧化酶活性測定 MDA含量采用硫代巴比妥酸法測定。取0.5 g葉片加入5 mL 10% TCA，研磨后的勻漿離心10 min，取上清液2 mL加0.6%硫代巴比妥酸(TBA) 2 mL混合，100 ℃水浴10 min后冷卻離心取上清液在450、532、 600 nm 處測吸光度，根據(jù)公式C=6.45×(D532 nm-D600 nm)-0.56D450 nm計算MDA含量。

1.2.5 抗氧化酶活性測定 取葉片0.5 g于預(yù)冷研缽中，加1 mL磷酸緩沖液在冰浴上研磨成漿，加緩沖液定容至5 mL，4 ℃ 離心10 min，上清液即為粗酶液。超氧化物歧化酶(SOD)活性采用氮藍(lán)四唑(NBT)法，以抑制NBT光還原的50%為1個酶活性單位。過氧化物酶(POD)活性采用愈創(chuàng)木酚法，以1 min吸光度變化0.01/min為1個過氧化物酶活性單位。過氧化氫酶(CAT)活性采用紫外分光光度法，以吸光度變化0.01/min為1個酶活性單位。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 8.0處理數(shù)據(jù)，SPSS 19.0分析并用Duncan’s法進(jìn)行顯著性檢驗，顯著性水平為α=0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同脅迫處理對相對含水量的影響

不同脅迫處理對青稞幼苗葉片相對含水量的影響見圖1，不同脅迫均可導(dǎo)致相對含水量下降。DS3、SS3及CS3分別比CK降低3.1%、1.6%及9.4%，說明復(fù)合脅迫對植株影響最大，干旱脅迫次之，鹽脅迫影響最小。DS5、SS5及CS5較DS3、SS3及CS3均有明顯下降，分別降低14.0%、10.3%、13.8%，CS5最低，表明復(fù)合脅迫對青稞幼苗葉片相對含水量傷害最嚴(yán)重，脅迫時間越長影響越重。

2.2 不同脅迫處理對光合特性的影響

2.2.1 對葉綠素和類胡蘿卜素含量的影響 從圖2可以看出，3種脅迫條件下葉綠素與類胡蘿卜素含量均呈增大趨勢，隨脅迫時間延長增大越顯著。與CK相比，DS3、DS5、SS3、SS5、CS3及CS5葉綠素含量分別增加25.8%、35.5%、2.7%、5.9%、12.4%及20.4%(圖2-A)，類胡蘿卜素含量分別增加 17.1%、26.3%、1.3%、2.6%、5.3%及7.9%(圖2-B)。表明干旱脅迫影響最大而鹽脅迫影響較小，青稞在逆境中可通過增加葉綠素含量提高光合效率，緩解光合機(jī)構(gòu)的傷害。

2.2.2 對氣體交換參數(shù)的影響 從圖3可以看出，3種脅迫均可使Pn、Gs、Ci與Tr顯著下降，且隨脅迫時間延長影響越顯著。與CK相比，DS3、DS5、SS3、SS5、CS3及CS5中Pn分別降低19.6%、42.2%、8.2%、24.8%、27.7%及47.4%(圖3-A)，Gs分別下降17.2%、42.2%、9.4%、20.3%、25.0%及57.8%(圖3-B)，Ci分別降低29.4%、49.7%、5.1%、9.7%、8.8%及17.2%(圖3-C)，Tr分別下降14.6%、31.0%、4.6%、18.0%、16.9%及36.7%(圖3-D)。

2.2.3 對葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響 脅迫對葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響見圖4，與CK相比，3種脅迫條件下Fv/Fm與ΦPSⅡ均顯著下降且下降趨勢相同，脅迫效應(yīng)隨脅迫時間延長而逐漸增強(qiáng)，其中DS5與CS5下降較明顯，分別下降14.0%、22.1%?？梢姀?fù)合脅迫對葉綠素?zé)晒鈪?shù)影響最大，干旱脅迫次之，鹽脅迫最小，表明復(fù)合脅迫對青稞葉片光合機(jī)構(gòu)損傷最嚴(yán)重，鹽脅迫最輕。

2.3 不同脅迫處理對可溶性糖與可溶性蛋白含量的影響

從圖5可以看出，不同脅迫處理條件下可溶性糖和可溶性蛋白含量較CK總體上顯著增加。DS3、DS5、SS3、SS5、CS3及CS5可溶性糖含量分別增加9.0%、45.1%、3.3%、24.3%、18.3%及74.4%(圖5-A)；可溶性蛋白含量分別增加7.9%、23.0%、4.8%、20.2%、25.2%及44.2%(圖5-B)，且隨脅迫時間增加可溶性糖和可溶性蛋白含量的累積效應(yīng)增強(qiáng)?？扇苄蕴桥c可溶性蛋白一起作為植物滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透壓，以適應(yīng)逆境脅迫。3種脅迫中復(fù)合脅迫影響最明顯，干旱脅迫次之，鹽脅迫最輕，表明在逆境中青稞葉片會進(jìn)行糖和蛋白積累以調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透壓，且脅迫越嚴(yán)重，其累積量越多，CS5可溶性糖與可溶性蛋白含量分別達(dá)到6.96%及98.14 mg/g，表明復(fù)合脅迫下青稞體內(nèi)滲透壓最低，需要更多滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)調(diào)節(jié)滲透壓，以減緩脅迫造成的傷害。

2.4 不同脅迫處理對青稞葉片MDA含量及抗氧化酶活性的影響

2.4.1 對MDA含量的影響 脅迫對青稞葉片MDA含量影響見圖6，3種脅迫均可使MDA含量顯著提高，其中復(fù)合脅迫提升幅度最大，鹽脅迫最小。與CK相比，DS3、SS3及CS3分別增加28%、12.9%及37.6%，復(fù)合脅迫累積量最多。DS5、SS5及CS5比DS3、SS3及CS3分別增加12.6%、15.2%及16.4%，復(fù)合脅迫增加最明顯。表明青稞受脅迫時體內(nèi)自由基增多，細(xì)胞發(fā)生膜脂過氧化作用，造成MDA大量累積，且脅迫時間越長，MDA積累量越多，CS5 MDA含量最高，達(dá)到14.9 μmol/g，說明復(fù)合脅迫下青稞受到的傷害最大。

2.4.2 對抗氧化酶活性的影響 從圖7可以看出，不同處理脅迫下SOD活性均顯著增加，與CK相比，DS3、DS5、SS3、SS5、CS3及CS5分別增加85.3%、45.3%、72.9%、26.5%、110.1%及66.5%，復(fù)合脅迫最強(qiáng)；隨脅迫時間延長，3種脅迫SOD活性均下降(圖7-A)。當(dāng)青稞受脅迫時，體內(nèi)活性氧自由基增加，為了清除新增活性氧自由基，使活性氧的新增量與清除量維持動態(tài)平衡，故SOD活性增強(qiáng)；當(dāng)傷害程度超過它自身所能承受的閾值時，則導(dǎo)致SOD活性減弱，不能有效緩解青稞受到的傷害。3種脅迫POD活性顯著增強(qiáng)，與CK相比，DS3、SS3及CS3分別增加23.0%、11.9%及24.1%。DS5、SS5及CS5比DS3、SS3及CS3分別增加18.0%、17.0%及29.2%，CS5最高，為412.32 U/(g·min)，說明POD活性隨脅迫時間延長而增強(qiáng)。復(fù)合脅迫影響最顯著，POD活性最強(qiáng)，干旱脅迫次之，鹽脅迫影響最小(圖7-B)。3種脅迫CAT活性大幅增強(qiáng)，與CK相比，DS3、DS5、SS3、SS5、CS3及CS5分別增加28.6%、 60.0%、11.4%、40.0%、37.1%及94.3%，復(fù)合脅迫下CAT活性最強(qiáng)，干旱脅迫次之，鹽脅迫最輕(圖7-C)?？傊?種脅迫下SOD活性隨脅迫時間延長而減弱，POD、CAT活性隨脅迫時間延長而增強(qiáng)，表明當(dāng)青稞受脅迫時，POD與CAT活性變化趨勢一致，協(xié)同增強(qiáng)植株抗氧化作用，以清除體內(nèi)多余的活性氧自由基，減緩植株受到的損害。

3 討論與結(jié)論

3.1 干旱和鹽脅迫對相對含水量的影響

相對含水量是反映植物體內(nèi)水分狀態(tài)的重要指標(biāo)，可指示其水分虧缺程度。研究表明，在逆境中植物葉片相對含水量降低，吳際友發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫下紅椿幼苗相對含水量降低[12]；楊國會發(fā)現(xiàn)，隨NaCl濃度增加，甘草相對含水量持續(xù)下降[13]。本研究3種脅迫條件下青稞葉片相對含水量均下降，表明3種脅迫條件對青稞幼苗均有明顯損傷，復(fù)合脅迫傷害最重。

3.2 干旱和鹽脅迫對光合特性的影響

環(huán)境脅迫可影響植物葉綠素含量[14]，本研究發(fā)現(xiàn)，3種脅迫條件下青稞葉綠素含量均增加，與前人研究結(jié)果[15-16]一致，表明當(dāng)脅迫濃度較低時，植物可加快葉綠素合成以增強(qiáng)光合作用，適應(yīng)環(huán)境脅迫，此為植物積極應(yīng)對逆境的生理響應(yīng)。逆境脅迫下植物葉片相對含水量降低，水是光合作用的原料，缺水可直接影響光合作用，也可導(dǎo)致葉片氣孔關(guān)閉，限制CO2進(jìn)入，從而間接降低光合作用效率，故3種脅迫對光合參數(shù)影響顯著。本研究發(fā)現(xiàn)，3種脅迫下青稞幼苗Pn、Gs、Ci與Tr均顯著下降，與前人研究結(jié)果[17]一致。水分脅迫可降低植物凈光合速率，主要由于氣孔限制[18]，也有報道水分脅迫時植物凈光合速率降低的原因是非氣孔限制[19]。Ci是分析凈光合速率降低原因的重要指標(biāo)，本研究3種脅迫下Ci與Pn均明顯下降，表明逆境脅迫下青稞光合能力下降是由氣孔因素引起的，屬于氣孔限制。葉綠素?zé)晒鈪?shù)也能較好地反映植物生理狀況，本研究發(fā)現(xiàn)3種脅迫下青稞葉片F(xiàn)v/Fm與ΦPSⅡ均下降，該結(jié)果與前人研究結(jié)論[19-20]一致，表明光合效率與傷害程度呈負(fù)相關(guān)。

3.3 干旱和鹽脅迫對可溶性糖與蛋白含量的影響

可溶性蛋白易溶于水且親水性較強(qiáng)，可提高植物吸水動力，可溶性糖對植物細(xì)胞膜和原生質(zhì)體具有一定的保護(hù)作用，二者均為植物滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)。當(dāng)植物處于干旱或鹽等滲透脅迫時，組織細(xì)胞內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)可不斷累積以增加細(xì)胞滲透壓，提高自身保水能力適應(yīng)逆境條件。逆境脅迫下植物體內(nèi)積累的可溶性糖與可溶性蛋白越多，其抗逆性就越強(qiáng)[21-22]。本研究3種脅迫下青稞幼苗體內(nèi)可溶性糖與可溶性蛋白含量均明顯積累，與前人研究結(jié)果[23-24]一致。表明青稞幼苗在受到滲透脅迫時，其體內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)會迅速累積，以抵御外界環(huán)境脅迫，緩解所受傷害。

3.4 干旱和鹽脅迫對MDA含量及抗氧化酶活性的影響

干旱條件下馬鈴薯葉片MDA含量升高[25]，鹽脅迫下胡盧巴幼苗MDA含量上升[26]。本研究3種脅迫條件下青稞幼苗葉片MDA含量均顯著增加，復(fù)合脅迫MDA含量最高，表明復(fù)合脅迫對青稞幼苗的傷害最大，膜脂受損程度最嚴(yán)重。植物生長過程中可產(chǎn)生活性氧自由基，正常條件下活性氧的產(chǎn)生與清除維持動態(tài)平衡，SOD、POD及CAT等抗氧化物酶相互協(xié)調(diào)，確保植物體內(nèi)活性氧自由基維持在較低水平，防止細(xì)胞受損。當(dāng)遭受環(huán)境脅迫時，活性氧產(chǎn)生與清除的平衡狀態(tài)被破壞，活性氧自由基在植物體內(nèi)加速累積。SOD是植物體清除活性氧的第1道防線，它可將活性氧自由基轉(zhuǎn)化為H2O2與O2，CAT與POD負(fù)責(zé)清除H2O2，減緩脅迫條件下活性氧對植物體的傷害。干旱與鹽脅迫下，植物利用酶促反應(yīng)可將其體內(nèi)過多的活性氧清除，以增強(qiáng)抵抗能力，SOD、POD及CAT活性也顯著提高，以增強(qiáng)活性氧清除能力[27-28]。本研究干旱脅迫和鹽脅迫條件下SOD、POD及CAT活性均顯著提高，其中復(fù)合脅迫活性最高，表明復(fù)合脅迫下活性氧自由基最多，受傷害最嚴(yán)重。隨脅迫時間延長，SOD活性均先升后降，POD及CAT活性均上升，酶活性在3種脅迫條件下變化趨勢相同，表明青稞幼苗體內(nèi)SOD、POD及CAT對干旱脅迫和鹽脅迫的應(yīng)答方式基本一致。

干旱脅迫、鹽脅迫及鹽旱復(fù)合脅迫對青稞幼苗葉片相對含水量、光合特性、可溶性糖與可溶性蛋白含量、MDA含量及抗氧化酶活性均有顯著影響，且鹽旱復(fù)合脅迫最顯著，隨脅迫時間延長，脅迫效應(yīng)越顯著。3種脅迫下，青稞幼苗葉片相對含水量降低；葉綠素含量升高，但由氣孔限制造成青稞幼苗光合能力下降，光合效率降低；體內(nèi)可溶性糖與可溶性蛋白等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)迅速累積，以抵御外界環(huán)境脅迫，緩解自身所受到的傷害；MDA含量顯著增加，SOD、POD及CAT活性顯著提高。青稞幼苗葉片中抗氧化酶系統(tǒng)在3種脅迫下應(yīng)答方式基本一致，隨脅迫時間延長，青稞幼苗SOD活性先增強(qiáng)后減弱，POD與CAT活性逐漸增強(qiáng)。