劉 巧， 張敏碩， 王小敏， 劉博揚(yáng)， 高夕彤， 李博文， 郭艷杰

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，河北保定 071001； 2. 河北省蔬菜產(chǎn)業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，河北保定 071001； 3.河北省農(nóng)田生態(tài)環(huán)境重點實驗室，河北保定 071001)

近年來新興起的植物修復(fù)(phytoremediation)技術(shù)，因具有投資少、不破壞場地結(jié)構(gòu)、不引起二次污染等優(yōu)點，被認(rèn)為是目前修復(fù)重金屬污染土壤最有前途和發(fā)展前景的治理技術(shù)[1]。該技術(shù)的運(yùn)用前提是找到對某種或某些重金屬有特殊富集能力的超富集植物(hyperaccumulator)。大部分重金屬在土壤中的生物有效性較低，能夠被植物利用的部分很少，而與一般植物相比，超富集植物具有超常的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)和富集重金屬的能力[2-3]，這就意味著超富集植物應(yīng)該能夠強(qiáng)烈活化和溶解根際環(huán)境的難溶態(tài)重金屬。通過一些試驗發(fā)現(xiàn)，在重金屬污染土壤上種植遏藍(lán)菜(Thlaspicaerulescens)，土壤孔隙應(yīng)用水溶態(tài)鋅的降低量僅占T.caerulescens總吸收量的1%[4]，即T.caerulescens吸收和積累的Zn絕大部分來自土壤中非可溶性部分；鉈超富集植物雨衣甘藍(lán)(Brassicaoleraceaacephala)和屈草花屬植物(Iberisintermedia)地上部吸收的鉈18%和21%來自根際土壤(0～2 cm土層)的植物有效態(tài)部分，而50%和40%來自非可溶性部分[5]。這些研究結(jié)果表明，超富集植物確實具有特殊的活化土壤中一般植物不能吸收利用的重金屬的能力，因而進(jìn)一步推測，超富集植物的這種特性是由其本身特殊的根系特性和根際環(huán)境造成的。在重金屬脅迫下，超富集植物根系分泌特殊的有機(jī)物，誘導(dǎo)緩效態(tài)或非有效態(tài)重金屬大量溶解和釋放；同時在植物根際，由于有較高濃度的碳水化合物、氨基酸、維生素和其他生長因子存在，成為微生物活動旺盛的區(qū)域。Abou-Shanab 等研究發(fā)現(xiàn)，Ni超積累植物香雪球(Allysummurale)的根際環(huán)境中可培養(yǎng)的細(xì)菌、放線菌和真菌數(shù)量以及耐Ni細(xì)菌和產(chǎn)酸細(xì)菌的比例均顯著高于非根際土壤[6]。微生物通過對重金屬元素進(jìn)行價態(tài)轉(zhuǎn)化或通過刺激植物根系的生長發(fā)育影響植物對重金屬的吸收，同時微生物能通過產(chǎn)生有機(jī)酸、提供質(zhì)子及與重金屬絡(luò)合的有機(jī)陰離子[7]，從而對土壤中重金屬的固定活化產(chǎn)生重要影響[8]。由于根際環(huán)境中的物理、化學(xué)、生物學(xué)特性或效應(yīng)直接影響重金屬的固定和活化狀態(tài)，關(guān)系到重金屬在土壤-植物系統(tǒng)中的遷移轉(zhuǎn)化行為，如今關(guān)于根際環(huán)境的研究已經(jīng)成為超富集植物一個新的研究熱點[9]。

印度芥菜(Brassicajuncea)是目前篩選出來的一種生長快、生物量較大的Cd、Zn、Pb忍耐-富集型植物，在植物修復(fù)中具有較大的應(yīng)用潛力[10-11]。有關(guān)印度芥菜的研究目前主要集中在其吸收富集重金屬的能力和修復(fù)重金屬污染土壤效率以及強(qiáng)化吸收措施等方面[12-13]。而對于印度芥菜根際環(huán)境特征，即印度芥菜吸收富集重金屬的機(jī)制研究還不夠完善。因此，本試驗運(yùn)用2因素(Cd、Pb)5水平回歸正交設(shè)計，采用根袋試驗法，種植對重金屬有富集作用的印度芥菜，同時設(shè)非富集植物油菜為參比植物，通過對比分析的方法，初步探討在Cd、Pb復(fù)合污染堿性土壤條件下印度芥菜的根際環(huán)境特征。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試植物 供試植物為印度芥菜(Brassicajuncea)，品種為WildGardenPungentMix，從國外購買。參比植物為青幫油菜，購于河北省保定市農(nóng)資科技市場。

1.1.2 供試土壤 供試土壤為河北農(nóng)業(yè)大學(xué)西校區(qū)標(biāo)本園的潮褐土(0～20 cm土層)。土壤基本理化性質(zhì)見表1。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗方案 試驗方案采用Cd、Pb 2因素5水平回歸正交設(shè)計，共11個處理，每個處理設(shè)3次重復(fù)，重金屬Cd、Pb分別以(CH3COO)2Cd·2H2O和(CH3COO)2Pb·2H2O固體粉末形式施入土壤，具體添加量見表2。

表1 供試土壤基本理化性質(zhì)

注：pH值在水土比為1 g ∶2.5 mL的條件下測定得到。

表2 供試土壤重金屬添加量

注：p代表因素數(shù)；m代表重復(fù)數(shù)；x1、x2分別代表各因素的編碼值。

1.2.2 試驗布置 采用上、下口徑分別為13、10 cm，高10 cm的塑料盆盛過3 mm篩的風(fēng)干土，每盆裝土800 g，重金屬按照試驗方案擬定的處理量裝盆，同時每盆施入0.26 g尿素和0.32 g磷酸二胺作底肥。將重金屬、底肥和土壤混勻，用300目的尼龍網(wǎng)做成根袋，將200 g混勻土裝入根袋作為根際土，600 g混勻土裝入塑料盆內(nèi)，置于根袋外圍作為非根際土，在60%田間持水量下平衡1個月后播入印度芥菜種子，每盆定苗6株(植物全部在根袋內(nèi)定植)，生長約60 d后收獲。參比植物油菜的處理方式與印度芥菜相同。

1.2.3 樣品的采集和處理 采集根袋內(nèi)土樣，取適量風(fēng)干后過篩備用。

1.3 分析方法

1.3.1 土壤理化指標(biāo)的測定 供試土壤的基本理化性質(zhì)采用常規(guī)分析方法[14]測定。

1.3.2 土壤重金屬含量分析 土壤中重金屬Cd、Pb總量用王水-高氯酸消解，消解液過濾后，原子吸收法[15]測定；土壤中有效態(tài)Cd、Pb含量采用二乙基三胺五乙酸(DTPA)提取劑[0.005 mol/L DTPA+0.1 mol/L三乙胺(TEA)+0.01 mol/L CaCl2]浸提-原子吸收法[16]測定。

1.3.2 土壤pH值的測定 稱取過2 mm篩風(fēng)干土樣 10.00 g 于50 mL燒杯中，加入0.01 mol/L CaCl2溶液25 mL(土水比為1 g ∶2.5 mL)，攪拌1～2 min，并放置30 min后用 PHS-3C數(shù)字酸度計直接測定pH值。

1.3.3 土壤中微生物數(shù)量的測定 土壤微生物(細(xì)菌、放線菌、真菌)數(shù)量采用平板稀釋法測定。細(xì)菌、放線菌和真菌分別采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、高氏一號培養(yǎng)基和查氏培養(yǎng)基培養(yǎng)[17]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有結(jié)果均為3次重復(fù)的平均值，采用Excel 2003作圖，SPSS 11.5軟件進(jìn)行方差分析、相關(guān)分析和多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 Cd、Pb復(fù)合污染處理印度芥菜和油菜根際土壤中有效態(tài)Cd、Pb含量

2.1.1 印度芥菜和油菜根際土壤中有效態(tài)Cd含量 從表3可以看出，在本試驗的11個處理中，隨著土壤中Cd添加量的增加，印度芥菜和油菜根際土壤中有效態(tài)Cd含量均顯著增加(P<0.05)，印度芥菜、油菜根際土壤中有效態(tài)Cd含量最大值分別達(dá)到了141.78、117.01 mg/kg。但相比較而言，除處理5外，其余處理印度芥菜根際土壤中有效態(tài)Cd含量明顯高于同處理下油菜根際土壤，是同處理下油菜根際土壤中有效態(tài)Cd含量的1～6倍，這就表明，與普通植物相比，印度芥菜根系或其根系分泌物對土壤中難溶態(tài)Cd有很強(qiáng)的活化作用。處理5中雖然外源Cd的添加量達(dá)到了最大值 200 mg/kg，但印度芥菜根際土壤中有效態(tài)Cd含量與油菜根際土壤相差不多，從數(shù)值上看，印度芥菜根系對土壤中Cd并未表現(xiàn)出較強(qiáng)的活化效應(yīng)。這可能是由于植物根際土壤中Cd的生物有效性受到了共存元素Pb的影響，Pb會奪取Cd在土壤中的吸附位而提高土壤中Cd的生物有效性，或者取代根中吸附的Cd，提高根中滯留Cd的活性，使Cd進(jìn)一步向地上部轉(zhuǎn)移[18]。同時研究認(rèn)為，植物對重金屬的吸收及重金屬的毒性與其在土壤中存在的有效態(tài)含量有密切的相關(guān)性[19]。印度芥菜是公認(rèn)的Cd富集植物，并且吸收的Cd有71%～82%富集在地上部[20]，這使得土壤中大量有效態(tài)Cd被印度芥菜吸收并富集在地上部；而油菜對Cd的吸收和富集能力相對較差，土壤中有效態(tài)Cd不能被油菜大量吸收而留在土壤中。因此在處理5下印度芥菜和油菜根際土壤中有效態(tài)Cd含量相差不多，同時這間接反映了印度芥菜通過根際效應(yīng)確實對土壤中難溶態(tài)Cd具有很強(qiáng)的活化和吸收富集能力，這對于修復(fù)重金屬Cd污染土壤具有重要意義。

2.1.2 印度芥菜和油菜根際土壤中有效態(tài)Pb含量 從表3可以看出，隨著土壤中Pb添加量的增加，各處理印度芥菜和油菜根際土壤中有效態(tài)Pb含量均顯著增加(P<0.05)。當(dāng)外源Pb的添加量為最大值1 000 mg/kg時，印度芥菜和油菜根際土壤中有效態(tài)Pb含量也都達(dá)到了最大值，分別為 828.25 mg/kg 和601.02 mg/kg。這可能是由于在重金屬脅迫下，植物根系分泌了一些物質(zhì)，如檸檬酸、蘋果酸、乙酸、乳酸等，這些可物質(zhì)與Pb離子形成可溶性絡(luò)合物，進(jìn)而抑制Pb跨膜運(yùn)輸，增加Pb在根際土壤中的移動性[21]，也可能是由于根際土壤中微生物的活動作用對Pb的活化有顯著影響，但其作用機(jī)制還有待進(jìn)一步深入研究。除處理3外，其余各處理印度芥菜根際土壤中有效態(tài)Pb含量都明顯高于同處理下油菜根際土壤，是相同處理下油菜根際土壤中有效態(tài)Pb含量的1～3倍，說明印度芥菜根系對土壤中Pb也有較強(qiáng)的活化效應(yīng)。處理3中印度芥菜根際土壤中有效態(tài)Pb含量與油菜根際土壤相比低11.68%，這可能和植物的特性以及Cd、Pb在土壤中復(fù)雜的相互作用有關(guān)。印度芥菜吸收土壤中的有效態(tài)Pb并將其主要富集在根系[12]，而中低濃度的Cd(Cd添加量為12.82 mg/kg)處理對油菜吸收Pb具有拮抗作用[22]，從而使得根際土壤中有效態(tài)Pb含量大于印度芥菜根際土壤。這同樣也反映了印度芥菜對土壤中難溶態(tài)Pb的活化和吸收能力強(qiáng)于普通油菜。

表3 Cd、Pb復(fù)合污染處理印度芥菜和油菜根際土壤中有效態(tài)Cd、Pb含量

注：同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示處理間在5%水平上差異顯著。

2.2 Cd、Pb復(fù)合污染處理印度芥菜和油菜根際土壤pH值的變化

土壤pH值是影響土壤重金屬元素生物有效性的主要因子。目前研究認(rèn)為，根際土壤pH值的變化主要是由根系呼吸作用釋放CO2以及在離子的主動吸收和根尖細(xì)胞伸長過程中分泌質(zhì)子和有機(jī)酸所致[23]。從圖1可以看出，隨著Cd、Pb的加入，除處理4和處理11印度芥菜根際土壤pH值都有所降低外，其余處理土壤pH值無明顯變化，這可能是由于試驗用的土壤為pH值8.28的石灰性土壤，對印度芥菜根系分泌的有機(jī)酸等有很強(qiáng)的緩沖性。除處理8和處理10外，油菜根際土壤pH值隨著Cd、Pb的加入有增加趨勢，但各處理間差異不明顯，這可能是由于在Cd、Pb復(fù)合污染脅迫下，重金屬對油菜根系H+的分泌具有抑制作用[24]，使得pH值有所升高，降低了重金屬的遷移能力，減弱其毒性，同時增強(qiáng)了油菜耐重金屬的能力[25]。在相同Cd、Pb復(fù)合污染處理下，印度芥菜根際土壤pH值均明顯低于油菜根際土壤，成對t檢驗結(jié)果顯示，差異達(dá)到極顯著性水平。這說明，與一般植物相比，富集植物印度芥菜自身根系能夠釋放質(zhì)子和有機(jī)酸，導(dǎo)致根際酸化，pH值有所降低，這對于根際土壤重金屬保持較高的生物有效性或促進(jìn)重金屬活化是非常有利的，從“2.1”節(jié)的結(jié)果分析也可以看出，在大多處理下印度芥菜根際土壤有效態(tài)重金屬含量明顯高于油菜根際土壤。

2.3 Cd、Pb復(fù)合污染處理印度芥菜和油菜根際土壤微生物的數(shù)量分析

2.3.1 印度芥菜和油菜根際土壤細(xì)菌數(shù)量的變化 從表4可以看出，印度芥菜和油菜根際土壤細(xì)菌的數(shù)量與Cd、Pb復(fù)合污染的處理濃度有關(guān)。印度芥菜根際土壤細(xì)菌數(shù)量的變幅為1.04×108～3.54×108個/g，平均為2.36×108個/g；油菜根際土壤細(xì)菌數(shù)量的變幅為0.72×107～4.40×107個/g，平均為2.66×107個/g。印度芥菜根際土壤細(xì)菌數(shù)量約為同處理油菜根際土壤的4～26倍，兩者差異較大，通過成對t檢驗顯示，差異達(dá)極顯著性水平。這可能是由于印度芥菜特有的根際環(huán)境效應(yīng)，造成土壤中細(xì)菌生長所需的有機(jī)物質(zhì)增加，從而導(dǎo)致了對Cd、Pb非敏感性細(xì)菌數(shù)量的上升，也可能是由于重金屬的脅迫效應(yīng)造成細(xì)菌的生理生化特性發(fā)生變異，從而使數(shù)量增加。

2.3.2 印度芥菜和油菜根際放線菌數(shù)量的變化 在Cd、Pb復(fù)合污染處理下，印度芥菜和油菜根際土壤中放線菌的數(shù)量明顯小于細(xì)菌(表4)。印度芥菜根際土壤中放線菌數(shù)量的變幅為2.37×106～5.44×106個/g，平均為3.81×106個/g；油菜根際土壤中放線菌數(shù)量的變幅為0.89×106～3.37×106個/g，平均為1.69×106個/g。印度芥菜根際土壤放線菌數(shù)量均比同處理油菜根際放線菌數(shù)量要高，但二者差異不大。

2.3.3 印度芥菜和油菜真菌數(shù)量的變化 由表4可知，在Cd、Pb復(fù)合污染處理下，印度芥菜和油菜根際土壤中真菌的數(shù)量比細(xì)菌、放線菌少。印度芥菜根際土壤中真菌數(shù)量的變幅為2.25×105～6.50×105個/g，平均為4.46×105個/g；油菜根際土壤中真菌數(shù)量的變幅為2.57×104～3.60×104個/g，平均為2.91×104個/g。印度芥菜根際土壤真菌數(shù)量約為同處理油菜根際真菌數(shù)量的3～24倍，通過成對t檢驗顯示，差異達(dá)極顯著水平。

由表4還可以看出，在Cd、Pb復(fù)合污染處理下，印度芥菜和油菜根際土壤中，均為細(xì)菌數(shù)量最多，數(shù)量級分別為108個/g和107個/g，其次是放線菌，數(shù)量級均為106個/g，真菌數(shù)量最小，數(shù)量級分別為105個/g和104個/g。但相比較而言，印度芥菜根際土壤中細(xì)菌和真菌的數(shù)量顯著高于油菜，這是由于富集植物印度芥菜在其根系分泌物作用下，降低了根際土壤環(huán)境的pH值，促進(jìn)了細(xì)菌和真菌的生長[26]，同時根系分泌物為土壤微生物提供了生長所需的碳源和能源物質(zhì)，從而促進(jìn)了根際微生物的生長，并提高了其活性，部分減緩了重金屬對土壤微生物的抑制作用[27]。這與前人的一些研究結(jié)果相類似，如Delorme等報道Zn超富集植物遏藍(lán)菜(Thlaspicaerulescens)比非富集植物紅車軸草(Trifoliumpratense)根際土壤具有更多的耐重金屬細(xì)菌和真菌[28]。李廷強(qiáng)等的研究結(jié)果也表明，超富集生態(tài)型東南景天根際土壤中細(xì)菌和真菌數(shù)量顯著高于非超富集生態(tài)型[29]。這說明印度芥菜特殊的根際特征為土壤中微生物的生長和繁殖提供了適應(yīng)的生存環(huán)境，導(dǎo)致對重金屬脅迫適應(yīng)性強(qiáng)的微生物種群和群落結(jié)構(gòu)形成，這些耐性微生物在印度芥菜根際重金屬的活化和溶解過程中起重要作用，并且試驗表明，起作用的耐性微生物主要是細(xì)菌和真菌，放線菌的作用不是主要的。有關(guān)這些耐性微生物的分離鑒定及其在印度芥菜根際土壤重金屬活化和溶解過程中的作用機(jī)制還需進(jìn)一步深入研究。

表4 不同Cd、Pb復(fù)合污染處理印度芥菜和油菜根際土壤微生物的數(shù)量

3 結(jié)論

本研究中，在Cd、Pb復(fù)合污染條件下，印度芥菜對土壤中難溶態(tài)Cd、Pb具有很強(qiáng)的活化和溶解能力。富集植物印度芥菜根際土壤pH值顯著低于同處理油菜，根際土壤中細(xì)菌和真菌的數(shù)量顯著高于同處理油菜，對于放線菌數(shù)量，二者之間差異不大，細(xì)菌和真菌在印度芥菜根際重金屬的活化和溶解過程中起主要作用。因此，與普通植物相比，富集植物印度芥菜根系向根際分泌一些質(zhì)子、金屬結(jié)合體[金屬硫蛋白(MTs)、植物螯合肽(PCs)]或有機(jī)物如有機(jī)酸等，導(dǎo)致根際土壤酸化，pH值降低，同時在重金屬脅迫下，印度芥菜根際土壤中耐性細(xì)菌和真菌的數(shù)量增加，甚至可能導(dǎo)致一些特殊的微生物區(qū)系存在。在根系分泌物和根際微生物的共同作用下所形成的特殊根際環(huán)境，使印度芥菜具有能夠強(qiáng)烈活化和溶解土壤中重金屬的能力，是其能夠超富集重金屬的根本原因。