彭 容，楊麗君，鄧茂林

1. 成都大學附屬醫(yī)院營養(yǎng)科，成都 610081；2. 成都大學附屬醫(yī)院全科醫(yī)學科，成都610081

肥胖是指體內(nèi)脂肪堆積過多和（或）分布異常，是一種多因素的慢性代謝異常狀態(tài)；肥胖問題正以驚人的速度加速流行[1-3]。肥胖的流行與2型糖尿病以及心血管疾病和某些癌癥（如乳腺癌、結(jié)腸癌）的發(fā)病風險急劇增加密切相關(guān)[4-7]，肥胖還與死亡風險增加有關(guān)[3]。肥胖已成為全世界范圍內(nèi)嚴重影響人類健康和生活滿意度的危險因素。我國是超重和肥胖增速較快的國家之一。中國健康營養(yǎng)調(diào)查（China Health and Nutrition Survey，CHNS）的數(shù)據(jù)顯示，1991—2011年我國居民年齡調(diào)整后的總體肥胖率[以體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）≥28.0 kg/m2為肥胖標準]由3.75%上升至11.3%，20年間上升了近2倍[7]。肥胖及其并發(fā)癥給我國醫(yī)療衛(wèi)生保健系統(tǒng)已帶來了沉重負擔，而且將會繼續(xù)加重[8]。

隨著對肥胖的深入研究，已證實飲食結(jié)構(gòu)和營養(yǎng)成分的改變會引起體成分組成和代謝的改變，甚至影響某些易感基因的表達[9-10]。Müller等[11]指出飲食可以獨立于體質(zhì)量影響能量消耗，這一現(xiàn)象可能是膳食治療肥胖的關(guān)鍵。因此，膳食干預成為維持健康的一個重要方面。最近一項meta分析[12]發(fā)現(xiàn)，全球超過40%的人正在試圖減肥，而且主要通過飲食減肥。

參考Adam-Perrot等[13]和Feinman等[14]關(guān)于低碳水化合物飲食（low-carbohydrate diet，LCD）的定義，并結(jié)合《中國居民膳食營養(yǎng)素參考攝入量》2013修訂版[15]關(guān)于我國居民成年人碳水化合物的平均需要量（120 g/d）及推薦供能比（50%～65%），本研究的LCD定義為限制碳水化合物的攝入，并以脂肪取代部分碳水化合物提供的能量，即每日碳水化合物在飲食總能量攝入中的供能比控制在50%以下的飲食結(jié)構(gòu)。越來越多的研究[16-17]表明，LCD對減重有效，并且能改善心血管疾病風險。值得注意的是，先前的一些研究表明，干預對象的特征（年齡、性別、肥胖程度、空腹血糖水平）[18-19]、干預時間長短[20]、LCD中三大供能物質(zhì)的供能比[21-23]、LCD食物營養(yǎng)成分來源[24]不同，LCD的減重效果會不一樣。因此，本研究主要探討LCD對正常大鼠體質(zhì)量和肥胖大鼠體質(zhì)量的影響，以期為個性化膳食指導提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雄性 Sprague-Dawley（SD）大鼠 80只，清潔級，8周齡，體質(zhì)量240～260 g。大鼠均購自成都達碩實驗動物有限公司，生產(chǎn)許可證號為SCXK（川）2015-030，使用許可證號為SYXK（川）2014-189。適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，將所有實驗大鼠隨機分為3組：正常對照組（control diet group，CD組，n=10）、正常體質(zhì)量LCD干預組（LCD組，n=10）和傳統(tǒng)高脂飲食干預組（high-fat diet group，HFD組，n=60）。每周測量各組大鼠體質(zhì)量。

肥胖大鼠入選標準：在HFD組內(nèi)，按干預8周后體質(zhì)量增長量從高到低排序，排序在前1/2的30只大鼠與CD組比較，平均體質(zhì)量增加20%以上認為肥胖大鼠模型建立成功[25-26]。HFD組內(nèi)體質(zhì)量排序后1/2的30只大鼠從本研究中剔除。然后，將入選的30只HFD誘導的肥胖大鼠再隨機分為3組：一組繼續(xù)接受HFD（HFD組，n=10），另一組從HFD改為LCD（HFD-LCD組，n=10），余下的一組從HFD改為CD（HFD-CD組，n=10）。各組大鼠再繼續(xù)喂養(yǎng)8周，于實驗的第16周末全部處死。

所有實驗動物均飼養(yǎng)于標準塑料籠（475 mm×350 mm×200 mm）中，溫度為（22±2） ℃，相對濕度為（55±5） %，光/暗循環(huán)為12 h/12 h。每籠5只，所有大鼠都可以自由進食和飲水。在飼養(yǎng)期間，每日對動物進行2次健康狀況觀測。本實驗由成都大學倫理委員會批準，按照《動物福利倫理審查實驗室動物指南》（GB/T 35892—2018）執(zhí)行。

1.2 盲法和隨機化分組

實驗人員在動物飼養(yǎng)、處理數(shù)據(jù)和作出排除決定時，對各種飼料種類未預先告知。含有飼料的編碼小瓶由不參與實驗的第3人制備。整個實驗期間由不同的人完成實驗分組、喂養(yǎng)和數(shù)據(jù)分析。80只大鼠從1到80進行編號，并對每個編號使用Microsoft Excel隨機化函數(shù)RAND創(chuàng)建隨機數(shù)字，然后對隨機數(shù)字按數(shù)值從大到小進行排序，隨機數(shù)字最大的前10個數(shù)字對應(yīng)編號的大鼠被分至第1組（CD組），隨機數(shù)字第11～20位對應(yīng)編號的大鼠被分至第2組（LCD組），剩下的60只大鼠為第0組（HFD組）。8周后，根據(jù)第0組內(nèi)（n=60）的體質(zhì)量水平，剔除30只大鼠，再用同樣的方法分為3組，分別為第3組（HFD組，n=10）、第4組（HFD-LCD組，n=10）和第5組（HFD-CD組，n=10）。

1.3 飼料

CD組正常對照飼料由成都達碩實驗動物有限公司提供。主要成分包括優(yōu)質(zhì)玉米、優(yōu)質(zhì)小麥、豆粕、苜蓿粉、氯化膽堿、復合酶、植酸酶、賴氨酸、甲硫氨酸、蘇氨酸、氯化鈉、磷酸氫鈣以及各種礦物質(zhì)和維生素等。正常對照飼料每100 g提供的能量為1 402 kJ，其中三大供能物質(zhì)供能比分別為脂肪15%、碳水化合物60%、蛋白質(zhì)25%。

根據(jù)人群研究[27]，長期LCD的脂肪供能比最高可達60%；另有一些研究[21]發(fā)現(xiàn)LCD的蛋白質(zhì)供能比和脂肪供能比分別維持在25%～30%和55%～60%，可能對體成分的改善有益。此外，為了排除蛋白質(zhì)供能比的影響，本研究中的LCD蛋白質(zhì)供能比與正常對照飼料保持一致。因此，本研究中LCD每100 g提供的能量為1 904 kJ，其中三大供能物質(zhì)的供能比分別為脂肪60%、碳水化合物15%、蛋白質(zhì)25%，主要成分包括大豆、菜籽油、雞蛋、魔芋粉、維生素和礦物質(zhì)等。

本研究中的HFD主要用于建立肥胖大鼠模型。之前的研究[28-30]發(fā)現(xiàn)，高脂飼料的配方中脂類含量越高，特別是豬油的比例越高，造模所需時間越短。因此，在保持蛋白質(zhì)供能比不變的情況下，本研究使用的HFD每100 g提供的能量為1 954 kJ，其中三大供能物質(zhì)的供能比分別為脂肪70%、碳水化合物5%、蛋白質(zhì)25%，配方是在正常對照飼料的基礎(chǔ)上添加豬油、雞蛋、菜籽油、乳清蛋白粉、大豆、糖、維生素和礦物質(zhì)等。

1.4 能量攝入水平和食物效率的計算

每天記錄各籠飼料投放量和飼料剩余量，計算大鼠平均每日能量攝入量（kJ/d） =大鼠每日飼料攝入量×飼料單位質(zhì)量所提供的能量。食物效率（g/kJ）=1周大鼠體質(zhì)量增加量 /大鼠1周攝入能量。

1.5 血生化檢測

在實驗第8周末和第16周末，所有大鼠禁食8 h，用便攜式全血酮體分析儀（北京宜城生物電子技術(shù)有限公司）測定大鼠尾全血β- 羥基丁酸酯（β-hydroxybutyrate，β-HB）濃度，評估營養(yǎng)性酮癥的狀態(tài)。

第16周末，大鼠處死后，剖開腹部，暴露后腔靜脈；然后用5 mL注射器緩慢地從靜脈中抽取5 mL血液。其中2 mL血液樣品送成都大學附屬醫(yī)院實驗室采用Beckman Coulter AU5821全自動生化分析儀（美國）檢測空腹血糖（fasting plasma glucose，F(xiàn)PG）、三酰甘油（triacylglycerol，TAG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）和低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）。剩余血液樣品分離血清后，-20 ℃保存。

1.6 內(nèi)臟脂肪稱重

第16周末，測量大鼠體質(zhì)量（body weight，BW）；待處死后，分離腹部皮下脂肪（abdominal subcutaneous fat，ASF）、腎周脂肪（perirenal fat，PF）和附睪脂肪（epididymal fat，EF），并稱重。內(nèi)臟脂肪總量（total visceral fat，TVF） 為 ASF、PF、EF三 者 之 和， 計 算 TVF/BW的值。

1.7 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠的體質(zhì)量、能量攝入和食物效率

第6周，LCD組實驗鼠體質(zhì)量顯著低于HFD組（P=0.000），但LCD組與CD組實驗鼠體質(zhì)量間差異無統(tǒng)計學意義（P=0.085）。第8～16周，HFD-LCD組大鼠體質(zhì)量增長速度顯著減緩，甚至緩于HFD-CD組；第16周末，HFD-LCD組大鼠體質(zhì)量顯著低于HFD-CD組和HFD組（均P＜0.05），與CD組和LCD組間差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）（圖1A）。

從能量攝入情況看，實驗16周期間，LCD組能量攝入均低于HFD組。第8周末LCD組與CD組能量攝入量差異無統(tǒng)計學意義（P=0.067）；第16周末，LCD組能量攝入量較CD組高（P=0.000）；第8～16周，HFD-LCD組能量攝入均顯著高于CD組和LCD組（均P＜0.05），與HFD組能量攝入間差異無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）（圖1B）。

從食物效率情況看，第2～8周，LCD組的食物效率低于HFD組和CD組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；第8～16周，肥胖大鼠的3個亞組中HFDLCD組的食物效率顯著低于其他2組（均P＜0.05）（圖1C）。

圖1 各組大鼠的體質(zhì)量、能量攝入水平和食物效率Fig 1 Body weight, energy intake and food efficiency of each group

2.2 內(nèi)臟脂肪水平

第16周末，在正常體質(zhì)量大鼠中，LCD組和CD組內(nèi)臟脂肪ASF、EF、PF和TVF/BW間的差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）；在肥胖大鼠中，HFD-LCD組EF顯著低于HFD組和HFD-CD組（均P＜0.05），但ASF、PF和TVF/BW在這3組間差異均無統(tǒng)計意義（均P＞0.05）（表1）。

表1 膳食干預對正常體質(zhì)量和肥胖大鼠內(nèi)臟脂肪的影響Tab 1 Effect of dietary intervention on visceral fat in normal weight rats and obese rats

2.3 血生化指標的變化

第8周末和第16周末，LCD組的β-HB水平均顯著高于CD組（均P＜0.05），與HFD組間差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。第16周末，肥胖大鼠中HFD組的β-HB水平最高，HFD-LCD組次之，HFD-CD最低，3組間差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）（表2）。

第16周末，LCD組TC顯著高于CD組（P=0.001），HDL-C顯著低于CD組（P=0.021），但與HFD組間差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）；LCD組的FPG、TAG和LDL-C水平與CD組間差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），但2組均顯著低于HFD組（均P＜0.05）。在肥胖大鼠中，HFD-LCD組TAG顯著低于其他2組（均P＜0.05），HDL-C顯著高于其他2組（均P＜0.05）；FPG、TC顯著低于HFD組（均P＜0.05），但與HFD-CD組間差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）；3組的LDL-C水平間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（表2）。

表2 膳食對正常體質(zhì)量和肥胖大鼠β-HB水平和糖脂代謝指標的影響Tab 2 Effects of diet on β-HB level and glycolipid metabolism in normal weight rats and obese rats

2.4 多元線性回歸分析

運用多元線性回歸分析大鼠體質(zhì)量與膳食結(jié)構(gòu)及β-HB水平的關(guān)系。將CD組、LCD組、HFD組作為一類（正常體質(zhì)量大鼠），HFD-CD組、HFD-LCD組、HFD組作為一類（肥胖大鼠）分別進行多元線性回歸。分別以CD組、HFD-CD組β-HB水平為參照，將2類大鼠分為CD組的0～1倍、1～2倍、＞2倍3個亞組，以及HFD-CD組的0～1倍、1～2倍、＞2倍3個亞組。

在正常體質(zhì)量大鼠中，HFD組、LCD組與CD組相比， 其β（95%CI） 值 分 別 為 43.49（5.67～ 81.31）、-7.86（-46.67～30.94），表示HFD組的體質(zhì)量平均高于CD組43.49 g，且有統(tǒng)計學意義，而LCD組與CD組體質(zhì)量間差異無統(tǒng)計學意義。將β-HB水平作為連續(xù)變量，發(fā)現(xiàn)其對體質(zhì)量的影響無統(tǒng)計學意義（β=4.93，P=0.870）；以β-HB水平為CD組的0～1倍作為對照組，β-HB水平為CD組的1～2倍和＞2倍時，其對體質(zhì)量的作用均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）（表3）。

表3 第8周正常體質(zhì)量大鼠體質(zhì)量與膳食結(jié)構(gòu)、β-HB水平關(guān)系的多元線性回歸Tab 3 Multiple linear regression of the relationship between body weight and dietary structure or β-HB level in normal body weight rats in the 8th week

在肥胖大鼠中，以HFD組為對照，HFD-LCD和HFD-CD飲食干預均可顯著降低大鼠體質(zhì)量（均P＜0.05），HFD-LCD組下降更明顯（β=-88.56）。與β-HB水平為HFD-CD組的0～1倍比較，β-HB水平為HFD-CD組的1～2倍時大鼠體質(zhì)量顯著降低（β=-34.92，P=0.006），而β-HB水平為HFD-CD組的＞2倍時體質(zhì)量無明顯變化（P=0.430）（表 4）。

表4 第16周肥胖大鼠體質(zhì)量與膳食結(jié)構(gòu)、β-HB水平關(guān)系的多元線性回歸Tab 4 Multiple linear regression of the relationship between body weight and dietary structure or β-HB level in obese rats in the 16th week

3 討論

LCD在減重方面有很好的應(yīng)用前景，但是在個體化應(yīng)用過程中，先前的一些研究的結(jié)果并不一致；其可能的原因是體質(zhì)量狀態(tài)不同對飲食結(jié)構(gòu)的反應(yīng)也不同。

3.1 膳食結(jié)構(gòu)

Frommelt等[21]證明，LCD中蛋白質(zhì)和脂肪供能比例不同可能導致實驗大鼠體內(nèi)的營養(yǎng)性酮癥狀態(tài)以及體質(zhì)量和代謝相關(guān)指標發(fā)生不同改變；因此，本研究中的3種膳食結(jié)構(gòu)均保持蛋白質(zhì)功能比不變。Morens等[31]證明，盡管正常體質(zhì)量大鼠與肥胖大鼠在LCD干預下，體質(zhì)量增長相似，但當校正體質(zhì)量后，正常體質(zhì)量大鼠較肥胖大鼠腹膜后的脂肪量更高。我們的研究結(jié)果同樣證明，不同體質(zhì)量狀態(tài)的大鼠對膳食結(jié)構(gòu)的反應(yīng)是不一致的。在正常體質(zhì)量大鼠中，LCD飲食不會影響體質(zhì)量，但會升高部分血脂代謝指標；相反，LCD飲食干預肥胖大鼠（即HFDLCD組）可以減緩肥胖大鼠體質(zhì)量增加和降低局部體脂積累，同時有利于降低肥胖大鼠的血糖和血脂。但HFDLCD組與CD組比較，HFD-LCD組內(nèi)臟脂肪含量和FPG仍偏高，血脂水平（TC、TAG、HDL-C和LDL-C）差異無統(tǒng)計學意義。由此可見，肥胖大鼠能從HFD飼料轉(zhuǎn)變?yōu)長CD飼料干預中獲益（包括體質(zhì)量、內(nèi)臟脂肪含量和糖脂代謝指標），但與正常大鼠比較時，內(nèi)臟脂肪和糖代謝指標仍然沒有達到正常水平。本研究結(jié)果中，糖脂代謝參數(shù)的改善可能更直接地與內(nèi)臟脂肪的損失有關(guān)。Lara-Castro等[27]的研究表明，肥胖與胰島素抵抗有關(guān)；然而，個體胰島素敏感性差異只有8%可以用BMI的差異來解釋。胰島素敏感性的個體差異很大程度上可能獨立于全身性肥胖的程度[32-33]。胰島素抵抗的可能原因為腹部脂肪組織的增加可以促進游離脂肪酸和脂肪細胞衍生蛋白（如纖溶酶原激活物抑制劑-1、腫瘤壞死因子α、瘦素、脂聯(lián)素等）的分泌，從而引起胰島素抵抗綜合征。

3.2 營養(yǎng)性酮癥

Bielohuby等[34]已經(jīng)證明，極低碳水化合物和低蛋白質(zhì)飲食（碳水化合物供能比15%、蛋白質(zhì)供能比10%、脂肪供能比75%）顯著增加大鼠血清β-HB水平（＞5倍），而極低碳水化合物和中等蛋白質(zhì)飲食（碳水化合物供能比15%、蛋白質(zhì)供能比20%、脂肪供能比65%）引起輕度β-HB水平升高（2倍）。本研究結(jié)果基本與Bielohuby等人的一致：LCD組和HFD組的β-HB水平分別是CD組的1.81倍和1.88倍（第8周末）；在肥胖大鼠中，HFD-LCD組和HFD組分別是HFD-CD組的2.03倍和3.04倍。

最新的研究[35-38]已經(jīng)證實LCD具有減重作用。但不同配方在減重效果方面也可能不同[21]。研究表明，LCD的不同作用可能在于碳水化合物、脂肪和蛋白質(zhì)的能量供能比不一致。低碳水化合物飲食中蛋白質(zhì)/脂肪供能比更低的膳食結(jié)構(gòu)可能更不利于減重和導致糖脂代謝紊亂，而蛋白質(zhì)供能比25%～30%和脂肪供能比55%～60%的LCD可能更有助于減重和減少脂肪積累[21]。因此，評估營養(yǎng)性酮癥狀態(tài)可能是評價膳食減重作用的一個關(guān)鍵指標。

3.3 多元線性回歸

我們運用多元線性回歸進一步分析正常體質(zhì)量大鼠和肥胖大鼠的體質(zhì)量分別與膳食結(jié)構(gòu)和營養(yǎng)性酮癥狀態(tài)的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，膳食結(jié)構(gòu)和營養(yǎng)性酮癥狀態(tài)在正常體質(zhì)量大鼠和肥胖大鼠中的作用是不一致的。在正常體質(zhì)量大鼠中，HFD引起大鼠體質(zhì)量增加，LCD對體質(zhì)量的影響無統(tǒng)計學意義，結(jié)合之前的研究結(jié)果——LCD干預正常體質(zhì)量大鼠使得內(nèi)臟脂肪反而增加，提示LCD可能不適用于正常體質(zhì)量個體減重或維持較低體質(zhì)量，甚至可能有增加內(nèi)臟脂肪的危險。在肥胖大鼠中，LCD使大鼠體質(zhì)量下降。由此推測，不同基礎(chǔ)體質(zhì)量的干預對象對飲食干預有不同的反應(yīng)。

另外，我們發(fā)現(xiàn)LCD誘導的營養(yǎng)性酮癥狀態(tài)（β-HB水平）可能是肥胖大鼠體質(zhì)量的影響因素。β-HB水平對體質(zhì)量的影響可能僅在一定范圍內(nèi)，即β-HB水平維持在喂食正常對照飼料的肥胖大鼠（HFD-CD組）的1～2倍可能是有益的。

綜上所述，不同宏量營養(yǎng)物質(zhì)對機體體質(zhì)量可能有不同的作用，不同體質(zhì)量狀態(tài)對膳食的反應(yīng)也可能不一致。因此，在運用LCD作為減重飲食時，要注意脂肪和蛋白質(zhì)的供能比需在適宜的范圍，并定期檢測營養(yǎng)性酮癥的狀態(tài)。另本研究僅為動物實驗，在人群中是否會得到相同結(jié)論，還需在人群中進行干預性或觀察性試驗加以驗證，進一步探討不同LCD營養(yǎng)成分對不同體質(zhì)量狀態(tài)人群的體質(zhì)量和代謝的作用，為個性化膳食指導提供依據(jù)。