王麗婷 王成祥 孫洪亮 王雁林 李清春

濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科 山東 濱州 256603

空卵泡綜合征(Empty follicle syndrome, EFS)是一種生殖障礙，盡管卵泡發(fā)育和雌二醇(E2)水平明顯正常，但在進(jìn)行體外受精(In vitro fertilization, IVF)治療過(guò)程中，對(duì)患者進(jìn)行誘導(dǎo)排卵后反復(fù)抽吸和沖洗成熟的卵泡，也無(wú)法獲取卵母細(xì)胞。EFS是否真正存在一直有爭(zhēng)議，部分學(xué)者認(rèn)為EFS是由取卵過(guò)程中出現(xiàn)的操作失誤及藥物活性低下所致，有些學(xué)者則認(rèn)為EFS是由卵泡發(fā)育障礙而導(dǎo)致的早期卵泡閉鎖，還有一部分人認(rèn)為這可能與遺傳或基因突變相關(guān)。雖然文獻(xiàn)報(bào)道EFS發(fā)生率僅為0.045%～7%，但對(duì)其病因尚未有確切解釋，且對(duì)這種婦女成功生育的治療目前尚未有報(bào)道，嚴(yán)重影響了這部分患者的輔助生殖助孕結(jié)局及治療前景。本文通過(guò)對(duì)1例EFS患者進(jìn)行基因檢測(cè)和家系分析，探究促黃體生成素/絨毛膜促性腺激素受體(Luteinizing hormone / chorionic gonadotropin receptor，LHCGR)基因異常與EFS發(fā)生的關(guān)系，并對(duì)該類患者經(jīng)輔助生殖助孕后治療前景進(jìn)行了討論。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取某院生殖醫(yī)學(xué)中心1例31歲女性不孕癥患者，經(jīng)過(guò)一系列檢查女方初步診斷為：原發(fā)性不孕癥、雙側(cè)輸卵管周圍粘連，疑為卵巢抵抗綜合征。男方診斷為：原發(fā)性不育癥、畸精子癥。根據(jù)夫妻雙方病情分析，行IVF超長(zhǎng)方案助孕治療，對(duì)患者穿刺取卵過(guò)程中未見(jiàn)卵母細(xì)胞及顆粒細(xì)胞，結(jié)合患者以前的病史，我們考慮患者可能為EFS，但是什么原因引起的患者空卵泡，是不是有可能存在某些基因異常。在取得患者同意并簽署知情同意書(shū)后，我們將患者外周血送復(fù)旦大學(xué)出生缺陷研究中心，進(jìn)行相關(guān)基因檢測(cè)并對(duì)患者進(jìn)行家系分析。

本研究的患者在實(shí)驗(yàn)前對(duì)本次實(shí)驗(yàn)?zāi)康募斑^(guò)程均有充分的了解，患者表示自愿參與本次實(shí)驗(yàn)，并簽署知情同意書(shū)，符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)要求并經(jīng)倫理委員會(huì)審批通過(guò)。

1.2 研究方法 對(duì)患者進(jìn)行基因檢測(cè)，遺傳分析和靶向基因測(cè)序使用QIAamp DNA血液迷你試劑盒(QIAamp DNA Blood Mini Kit)從外周血中提取基因組DNA(QIAamp DNA Blood Mini Kit)(德國(guó)齊根市)。使用Illumina HiSeq 3000平臺(tái)對(duì)患者的exome進(jìn)行測(cè)序。在LHCGR中檢測(cè)到c.1823T>C，p.L608P(Leu608Pro)突變。用以下引物進(jìn)行Sanger測(cè)序證實(shí)該候選基因：正向引物ATGCTTGGAGGATGGCTCTT；反向引物TTTTAGTGGGCAGTGTCA。

對(duì)該患者(先證者)的親屬進(jìn)行調(diào)查，了解每位親屬的生育情況，是否有與患者同類的親屬，并將家系調(diào)查結(jié)果繪成家系圖進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 基因突變檢測(cè)結(jié)果 患者LHCGR基因第11號(hào)外顯子處，在圖1箭頭所指位置處存在純合突變：chr2:48915113A>G，c.1823T>C，p.Leu608Pro，突變使LHCGR蛋白在第608位由亮氨酸(Leucine, Leu)突變?yōu)楦彼?Proline ,Pro)，屬于純合突變。而父母在此位點(diǎn)屬于雜合突變，先證者弟弟(46，XY。未育)屬于純合突變，先證者妹妹(育有1女孩、1男孩)屬于雜合突變(圖2)。根據(jù)已有文獻(xiàn)報(bào)道，LHCGR 基因純合突變可導(dǎo)致EFS，可作為臨床上EFS診斷的一個(gè)分子指標(biāo)。且根據(jù)以往研究報(bào)道，具有 LHCGR 基因突變的患者較難獲得卵子。本次檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)患者在 LHCGR 基因上存在純合突變，經(jīng)驗(yàn)證符合孟德?tīng)栠z傳規(guī)律。該基因純合突變被高度懷疑是患者無(wú)卵母細(xì)胞及顆粒細(xì)胞的致病原因。

2.2 家系分析結(jié)果 對(duì)患者親本樣品的基因檢測(cè)分析(圖2)表明，父本和母本均為雜合突變，可生育后代；其中一位可生育后代的妹妹也是雜合子突變，而患者及其弟弟(46，XY)屬于純合突變，均未能生育后代；表明LHCGR在該位點(diǎn)雜合突變不影響生育后代，純合突變患者影響生育。在一個(gè)卵泡發(fā)育正常、E2水平和血漿人絨毛膜促性腺激素(hCG)水平在正常范圍內(nèi)的育齡婦女中，在重復(fù)周期中不能獲得卵母細(xì)胞的原因，可能是卵巢反應(yīng)不良或hCG注射失敗，也可能是某些基因缺陷導(dǎo)致。

T/C：雜合突變；C/C：純合突變。
圖2 LHCGR基因突變患者家系圖

3 討論

EFS是一種生殖障礙，盡管卵泡發(fā)育和E2水平明顯正常[1]，但在進(jìn)行IVF治療過(guò)程中，對(duì)患者進(jìn)行誘導(dǎo)排卵后反復(fù)抽吸和沖洗成熟的卵泡，也無(wú)法獲取卵母細(xì)胞[2]。根據(jù)取卵當(dāng)天β-hCG的水平，將EFS分為“真”EFS(GEFS)和“假”EFS(FEFS)[3]。

關(guān)于GEFS發(fā)病機(jī)制知之甚少，但可能涉及特定的遺傳因素。曾有報(bào)道指出，與取回卵母細(xì)胞的患者相比，復(fù)發(fā)性EFS患者顆粒細(xì)胞中一些促凋亡基因的表達(dá)增加，其表達(dá)產(chǎn)物中負(fù)責(zé)正常卵泡生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)錄本(如PAPP-A，MAPK 3)明顯減少[4]。Onalan等[5]曾報(bào)道了兩個(gè)患有先天性耳聾的姐妹因不明原因不孕接受了三個(gè)IVF周期的病例：盡管她們卵巢反應(yīng)正常，取卵時(shí)血漿hCG水平也正常，但沒(méi)有取到卵母細(xì)胞或卵丘-冠狀復(fù)合體。當(dāng)對(duì)她們進(jìn)行第二次hCG注射時(shí)依然提取不到卵母細(xì)胞。Yariz等[6]通過(guò)研究同樣的兩個(gè)姐妹發(fā)現(xiàn)在編碼LHCGR的基因中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)突變(p.N400S)，該突變與GEFS相關(guān)，并作為隱性性狀遺傳。這種突變導(dǎo)致了LH信號(hào)傳遞途徑的不可逆阻斷，這也解釋了為什么重復(fù)給藥hCG是無(wú)效的。另有研究人員提出EFS的危險(xiǎn)因素與卵巢儲(chǔ)備不足相似，提示EFS病因可能包括卵巢老化[7]。

LHCGR是G蛋白偶聯(lián)受體(G protein coupled receptor, GPCR)家族的成員[8]，主要表達(dá)在卵巢的卵泡膜細(xì)胞上，也存在于顆粒細(xì)胞(Granulosa cell, GC)和卵丘細(xì)胞(Cumulus cell, CC)上，特別是在接近排卵的優(yōu)勢(shì)卵泡中[9-10]。LHCGR主要通過(guò)G蛋白激活腺苷酸環(huán)化酶，增加環(huán)磷酸腺苷(Cyclic adenosine monophosphate, cAMP)水平，導(dǎo)致PKA激活。通過(guò)蛋白激酶A(protein kinase A, PKA)依賴的途徑持續(xù)激活細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(Extracellular signal regulated kinase, ERK1/2)導(dǎo)致卵母細(xì)胞成熟，排卵和黃體生成[11]。LHCGR主要在性腺中表達(dá)，在E2的產(chǎn)生、排卵和黃體形成中起重要作用。

雖然以前認(rèn)為具有LHCGR突變的婦女即使通過(guò)IVF治療，也沒(méi)有使用自己的卵母細(xì)胞從而獲得懷孕的機(jī)會(huì)，但最近有報(bào)道指出對(duì)該類患者進(jìn)行雙重扳機(jī)和延長(zhǎng)扳機(jī)與取卵間隔時(shí)間后，獲得了卵母細(xì)胞和高質(zhì)量胚胎，然后進(jìn)行冷凍胚胎移植，其中一患者成功地生下了雙胞胎，另一患者成功產(chǎn)下一名男嬰[19]。這些患者除了卵母細(xì)胞獲取困難外，在體外受精、胚胎發(fā)育以及妊娠期均未發(fā)現(xiàn)明顯異常。這是首次報(bào)道存在致病性LHCGR變異的婦女，通過(guò)輔助生殖技術(shù)治療后，成功的獲取卵母細(xì)胞進(jìn)而獲得自己的孩子，也進(jìn)一步闡明LHCGR突變雖干擾排卵，但對(duì)受精和胚胎發(fā)育沒(méi)有影響[19]。這也給存在致病性LHCGR變異的患者帶來(lái)了新的生育希望。

致謝：感謝復(fù)旦大學(xué)出生缺陷研究中心王磊教授團(tuán)隊(duì)在患者血樣本基因檢測(cè)方面給予的幫助。