劉 琳 門婷婷 張文鳳 張建棣 米 佳 楊春華

1 濱州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院 山東 煙臺 264003；2 濱州醫(yī)學(xué)院護(hù)理學(xué)院；3 煙臺載通生物技術(shù)有限公司； 4 濱州醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥研究中心

蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)(western blot，WB)從發(fā)明以來已有40余年，至今為止依然是最傳統(tǒng)且應(yīng)用最廣的一種蛋白質(zhì)表達(dá)水平檢測技術(shù)[1-2]。但是其實(shí)驗(yàn)步驟復(fù)雜，一次性處理樣品能力有限，所得結(jié)果只能進(jìn)行半定量分析，因而限制了其在高通量樣本蛋白質(zhì)表達(dá)水平檢測中的應(yīng)用。斑點(diǎn)印跡分析法(dot blot analysis)通過簡化實(shí)驗(yàn)流程，可以完成高通量樣本蛋白質(zhì)表達(dá)水平的檢測，但是實(shí)驗(yàn)結(jié)果依然只能以半定量形式體現(xiàn)。酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)方法雖然可以完成高通量樣品中蛋白表達(dá)水平的快速檢測，但是由于ELISA是個級聯(lián)放大的過程，實(shí)驗(yàn)結(jié)果容易出現(xiàn)假陽性，造成實(shí)驗(yàn)誤差[3-4]。

為了解決以上問題，我們在傳統(tǒng)的斑點(diǎn)印跡分析法的基礎(chǔ)上，研發(fā)了全新的定量斑點(diǎn)印跡分析(quantitative dot blot analysis，QDB analysis)方法[5-6]。在斑點(diǎn)印跡法中，若想對蛋白表達(dá)水平進(jìn)行定量，需通過額外的圖像轉(zhuǎn)換過程實(shí)現(xiàn)對每個斑點(diǎn)的半定量分析。我們通過引入一種全新的96孔單元板用于QDB analysis，結(jié)合酶標(biāo)儀實(shí)現(xiàn)了對單個斑點(diǎn)的直接定量檢測，而不需額外的圖像轉(zhuǎn)換過程，即可快速實(shí)現(xiàn)對高通量樣本蛋白表達(dá)水平的半定量分析。如果在實(shí)驗(yàn)過程中采用標(biāo)準(zhǔn)蛋白作為對照而引入蛋白表達(dá)水平的標(biāo)準(zhǔn)曲線，還能夠?qū)崿F(xiàn)蛋白質(zhì)表達(dá)水平的絕對定量(即樣品中蛋白的真正表達(dá)水平)分析。

本研究采用了QDB analysis技術(shù)分別檢測了87只小鼠前列腺組織，以及8種人細(xì)胞系中管家蛋白tubulin的表達(dá)水平，結(jié)果表明，QDB analysis技術(shù)可應(yīng)用于高通量樣本蛋白質(zhì)表達(dá)水平的定量檢測，能夠得到可靠的結(jié)果，具有很高的實(shí)驗(yàn)效率，能顯著節(jié)約研究資源和工作時(shí)間，并且能夠?qū)F(xiàn)有的半定量免疫印跡方法轉(zhuǎn)變?yōu)檎嬲亩糠治龇椒ā?/p>

1 材料與方法

1.1 試劑與耗材 BCA蛋白濃度檢測試劑盒，ECL發(fā)光檢測試劑盒為美國賽默飛公司產(chǎn)品。兔抗tubulin 抗體(YT-0183)購自于Imunoway公司。tubulin重組蛋白為武漢華美達(dá)公司產(chǎn)品。QDB板由煙臺載通生物技術(shù)有限公司提供。

1.2 前列腺癌小鼠和野生小鼠 雄性8周齡前列腺癌(transgenic adenocarcinoma of the mouse prostate，TRAMP)小鼠和野生(wild type，WT)小鼠購自美國Jackson實(shí)驗(yàn)室[7]。小鼠飼養(yǎng)于SPF環(huán)境，并進(jìn)行交配繁殖，雄性子代經(jīng)PCR基因型鑒定后，鑒定結(jié)果陽性者為TRAMP小鼠，鑒定結(jié)果陰性者為WT小鼠，將TRAMP小鼠和WT小鼠分籠飼養(yǎng)，6只/籠飼養(yǎng)于獨(dú)立通風(fēng)換氣籠盒(IVC)內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)飼料，溫度為(23±2)℃。給予12 h光照、自由飲食飲水。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) 人細(xì)胞系HepG2、Hela、SGC-7901、MCF-7、LnCap、 W40、A549和293T購自于ATCC或者中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。使用DMEM培養(yǎng)基添加10%胎牛血清，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中于5% CO2，37℃條件下進(jìn)行培養(yǎng)。

1.4 組織和細(xì)胞蛋白質(zhì)提取 分離小鼠前列腺組織，將組織樣品在200 μL裂解液(7 M尿素，2 M硫脲，4% CHAPS，65 mM二硫蘇糖醇，40 mM Tris以及蛋白酶抑制劑)中用外科剪刀剪碎，使用組織勻漿儀勻漿1 min， 8 000×g離心5 min，收集上清。將細(xì)胞收集在裂解緩沖液中，使用移液器上下混勻20次，在4℃孵育30 min，8 000×g離心5 min，收集上清。采用BCA蛋白濃度檢測試劑盒檢測蛋白濃度，用于后續(xù)分析。

1.5 WB 配制10%的SDS-PAGE膠，每孔上樣10 μg蛋白樣品，80～120 V進(jìn)行跑膠；采用100 V，60 min將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜；洗膜，5% 脫脂牛奶封閉40 min；孵育一抗(1∶2 000)，4℃過夜；PBS清洗3次，每次5 min；孵育二抗(1∶3 000)，室溫下1 h；PBS清洗3次，每次5 min；在膜上滴加ECL發(fā)光液后檢測。

1.6 QDB analysis技術(shù) 在蛋白提取液中加入5×SDS loading buffer，再加入DTT 至終濃度50 mM，煮沸5 min。將QDB 板懸空放置于合適的支架上。將樣品按照等體積(1～3 μL)方式滴加在QDB 板單元孔底部膜的中心位置，同時(shí)以等量的BSA蛋白樣品作為對照，每個樣品重復(fù)3次。QDB板于37℃干燥15 min，放入底部平整的空盒中，加入適量transfer buffer(沒過板底部的膜即可)輕輕晃動，充分濕潤。將transfer buffer倒出，倒入TBST(沒過板底部的膜即可)，室溫?fù)u床上洗5 min。將TBST倒出，倒入5%脫脂奶粉進(jìn)行封閉，室溫?fù)u床上封閉1 h。放入底部平整的空盒中，加入TBST，反復(fù)晃動將管壁上可能沾染的抗體洗去，棄掉清洗液將QDB板放入干凈96孔板(QDB板底部為開放性，需完全放入96孔板里，與96孔板共用每個孔)，每孔加入一抗100 μL，室溫?fù)u床孵育2 h。將QDB 板放入底部平整的空盒中，加入TBST，反復(fù)晃動將管壁上可能沾染的抗體洗去，棄掉清洗入空盒，再在空盒中加入TBST，室溫?fù)u床洗滌3次，每次5 min。將QDB 板放入干凈96 孔板，每孔加入100 μL二抗，室溫?fù)u床孵育1 h。將QDB 板放入空盒，再在空盒中加入TBST，搖床上室溫洗滌3 次，每次5 min。在一干凈96 孔板中每孔加入100 μL ECL 發(fā)光液備用。從空盒中取出QDB板，并輕輕甩去除多余的TBST。將QDB板放入已加入ECL發(fā)光液的96 孔板，選擇帶蓋讀盤模式于酶標(biāo)儀中檢測發(fā)光強(qiáng)度。

2 結(jié)果

2.1 QDB analysis技術(shù)對小鼠前列腺組織中tubulin蛋白表達(dá)水平的相對定量檢測

2.1.1 小鼠組織中tubulin抗體特異性的檢測與線性相關(guān)性分析 分別取12周齡、16～18周齡、20～30周齡的WT小鼠和TRAMP小鼠各1只，取其前列腺組織，將所有小鼠的前列腺組織混合在一起，提取蛋白質(zhì)，進(jìn)行WB跑膠后，使用tubulin抗體進(jìn)行免疫分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1A所示，可見結(jié)果中有且只有1條條帶，條帶對照marker與tubulin分子量大小相吻合， 證明所使用的tubulin抗體具有非常良好的特異性。

將所獲得的混合蛋白提取物依據(jù)不同的上樣量(混合蛋白提取物上樣品分別為0.1、0.25、0.5、1、1.5、3、6 μg，并用BSA將總蛋白上樣量補(bǔ)齊為6 μg)，滴加在QDB板的核心部位，經(jīng)QDB analysis技術(shù)檢測分析獲得化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度，以混合蛋白提取物上樣量為橫坐標(biāo)，化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)作圖(圖1B)。酶標(biāo)儀所讀取的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度與混合蛋白提取物上樣量有良好的線性關(guān)系，其相關(guān)系數(shù)R為0.993 7，由于實(shí)驗(yàn)中所使用的抗體僅識別混合物中的tubulin蛋白，因此，實(shí)驗(yàn)所得化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的大小即可表示混合蛋白提取物中tubulin蛋白含量的多少，即QDB analysis技術(shù)將組織中的tubulin蛋白表達(dá)水平轉(zhuǎn)化為可以直接讀取的定量數(shù)值。

A.WB檢測小鼠前列腺組織中的tubulin蛋白表達(dá)，其中BSA泳道為對照組；B.QDB技術(shù)分析混合蛋白提取物上樣量與化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度值的線性相關(guān)性。
圖1 小鼠前列腺組織tubulin抗體特異性的檢測及線性相關(guān)性的分析

2.1.2 WT和TRAMP小鼠中tubulin蛋白表達(dá)水平的定量檢測 分別取12周齡(19只)、16～18周齡(13只)、20～30周齡(8只)的WT小鼠以及12周齡(19只)、16～18周齡(18只)、20～30周齡(10只)TRAMP小鼠共87只。分離小鼠的前列腺組織，提取組織蛋白，使用QDB analysis技術(shù)檢測每只小鼠前列腺組織中tubulin蛋白的表達(dá)水平。所有小鼠前列腺組織中tubulin蛋白的表達(dá)水平見圖2A。按照不同周齡區(qū)間對小鼠前列腺組織中tubulin蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，見圖2B。結(jié)果顯示，不管是WT小鼠還是TRAMP小鼠的前列腺組織中tubulin蛋白表達(dá)水平都隨著年齡增加而增加，其中WT小鼠周齡達(dá)到20～30周后，其前列腺組織中tubulin蛋白的表達(dá)水平與12周齡小鼠比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而TRAMP小鼠周齡達(dá)到16～18周以后，其前列腺組織中tubulin蛋白的表達(dá)水平便與12周齡小鼠比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

A. 87只小鼠前列腺組織中的tubulin蛋白表達(dá)水平；B. 12周齡、16～18周齡、20～30周齡小鼠前列腺組織中tubulin蛋白的平均表達(dá) 水平統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果。與12周齡相比，***P<0.001。
圖2 QDB analysis技術(shù)定量檢測小鼠前列腺組織中的tubulin蛋白表達(dá)水平

2.2 QDB analysis技術(shù)對人細(xì)胞系中tubulin蛋白表達(dá)水平的絕對定量檢測

2.2.1 tubulin抗體特異性的檢測與線性相關(guān)性分析 分別收集105個HepG2、Hela、 SGC-7901、MCF-7、LnCap、 SW40、A549和293T細(xì)胞，并混合在一起，提取混合細(xì)胞蛋白后，進(jìn)行WB跑膠，使用tubulin抗體進(jìn)行免疫印跡分析。結(jié)果如圖3A所示，可見結(jié)果中有且只有1條條帶，條帶對照marker與tubulin分子量大小相吻合， 證明所使用的tubulin抗體對于人細(xì)胞樣品具有非常良好的特異性。

與“2.1.1”中實(shí)驗(yàn)相類似，通過QDB analysis技術(shù)檢測混合細(xì)胞蛋白提取物上樣量與化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度之間的線性相關(guān)性。結(jié)果如圖3B所示，酶標(biāo)儀所讀取的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度與混合細(xì)胞蛋白提取物上樣量有良好的線性關(guān)系，其相關(guān)系數(shù)R為0.9931。即QDB analysis技術(shù)將細(xì)胞中的tubulin蛋白含量轉(zhuǎn)化為可直接讀取的定量數(shù)值。但是該方法所得到的定量數(shù)值只可應(yīng)用于tubulin蛋白表達(dá)水平的相對定量，而無法體現(xiàn)細(xì)胞中所含有的tubulin蛋白的絕對定量表達(dá)水平。

A. WB檢測混合細(xì)胞提取物中的tubulin蛋白表達(dá)，其中BSA泳道為對照組；B. QDB analysis技術(shù)分析混合細(xì)胞蛋白提取物上樣量與化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的線性相關(guān)性。
圖3 人細(xì)胞系中tubulin抗體特異性的檢測及線性相關(guān)性的分析

2.2.2 tubulin蛋白表達(dá)水平標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定 為了完成tubulin蛋白表達(dá)水平的絕對定量，需要引入tubulin蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線。將tubulin重組蛋白依據(jù)不同的上樣量滴加在QDB板的核心部位，經(jīng)QDB analysis檢測后獲得化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度，以重組蛋白的上樣量為橫坐標(biāo)，化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)作圖，得圖4。酶標(biāo)儀所讀取的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度與tubulin重組蛋白上樣量有良好的線性關(guān)系，其相關(guān)系數(shù)R為0.9937。通過該標(biāo)準(zhǔn)曲線，只要獲得樣品的化學(xué)發(fā)光數(shù)值，即可擬合出樣品中所含有tubulin蛋白的絕對含量。例如，所檢測樣品的化學(xué)發(fā)光值為5×106，從tubulin蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線即可對應(yīng)得到上樣樣品中tubulin蛋白的含量為33.78 ng。

2.2.3 人細(xì)胞系中tubulin蛋白表達(dá)水平的絕對定量檢測 利用“2.2.2”中獲得的tubulin蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可將QDB analysis方法所檢測到的不同細(xì)胞提取物產(chǎn)生的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度轉(zhuǎn)換為樣品中tubulin蛋白的絕對表達(dá)水平，如圖5A所示。以HepG2細(xì)胞為例，可知每1 μg細(xì)胞提取物中即含有tubulin蛋白110 fmol。因所收獲細(xì)胞的數(shù)量已知，也可以進(jìn)一步計(jì)算出每個細(xì)胞中tubulin蛋白的含量，如圖5B所示。

A. QDB analysis技術(shù)檢測不同細(xì)胞提取物產(chǎn)生的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度轉(zhuǎn)換為樣品中tubulin蛋白的絕對表達(dá)水平；B. QDB analysis技術(shù)進(jìn)一步計(jì)算出不同細(xì)胞系每個細(xì)胞中tubulin蛋白的含量。
圖5 QDB analysis技術(shù)檢測不同細(xì)胞系tubulin蛋白的絕對含量

3 討論

在本研究中，我們采用了一種新的蛋白質(zhì)表達(dá)水平定量檢測技術(shù)—QDB analysis技術(shù)檢測了組織和細(xì)胞中管家蛋白tubulin蛋白的表達(dá)水平。通過該技術(shù)，對87個小鼠前列腺組織樣品的同步上樣和檢測，發(fā)現(xiàn)tubulin蛋白的表達(dá)水平隨著小鼠年齡的增加而增加；通過引入標(biāo)準(zhǔn)蛋白曲線，發(fā)現(xiàn)人細(xì)胞系中tubulin蛋白的絕對表達(dá)水平在90～140 fmol/μg之間。此外，已有實(shí)驗(yàn)室將QDB analysis技術(shù)應(yīng)用于單克隆細(xì)胞的篩選和抗體效價(jià)的測定[8-9]。QDB analysis技術(shù)解決了科研工作者在進(jìn)行蛋白的表達(dá)水平分析時(shí)蛋白表達(dá)水平定量困難，高通量樣本檢測工作量大的難題，縮短了實(shí)驗(yàn)整體時(shí)間，提高了實(shí)驗(yàn)效率，尤其是通過引入標(biāo)準(zhǔn)曲線，將傳統(tǒng)的半定量方法轉(zhuǎn)換為絕對定量方法，有助于建立蛋白表達(dá)水平檢測標(biāo)準(zhǔn)，相信未來會在臨床疾病診斷、食品安全檢測中得到廣泛應(yīng)用。