白蘭蘭 駱倩倩 劉冉冉 張洪芹

1 濱州醫(yī)學院基礎醫(yī)學院組織學與胚胎學教研室 山東 煙臺 264003；2 煙臺市中心血站；3 濱州醫(yī)學院基礎醫(yī)學院形態(tài)學實驗室；4 濱州醫(yī)學院煙臺附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學科

原發(fā)性卵巢功能不全(primary ovarian insufficiency，POI)是指卵巢組織的功能過早衰竭，好發(fā)年齡≤40歲育齡期婦女，其特點是卵巢功能下降，促性腺激素升高，雌激素水平降低[1-3]?？紤]到該疾病不僅有一系列功能損傷，而且在大多數(shù)情況下沒有明確的結局，POI一詞被認為比卵巢早衰(premature ovarian failure，POF)更準確。在臨床上，隨著腫瘤發(fā)病率的增加及年輕化趨勢，因化療導致卵巢功能低下和不孕的患者日漸增多，成為 POI發(fā)病的一個重要原因[4-5]。順鉑(cis-platin，CP)是目前常用的化療藥物之一，其通過形成CP-DNA加合物從根本上限制了 DNA復制，損傷顆粒細胞、卵母細胞以及卵泡膜細胞，最終引起以卵泡閉鎖、細胞凋亡為特征的卵巢衰竭[6]。近年來，間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)移植治療成為臨床研究的熱點，為POI的臨床治療提供了新的希望。但目前MSCs，尤其是臍帶間間充質(zhì)干細胞(umbilical cord mesenchymalstem cells，UCMSCs)對POI的作用機理研究甚少。另外，我們的前期研究證實，干細胞恢復POI的卵巢功能可能與干細胞分泌因子調(diào)控顆粒細胞凋亡有關[7]，而在卵泡發(fā)育過程中卵泡膜細胞的功能同樣重要，卵泡膜細胞源性生長因子能夠促進顆粒細胞的增殖和抑制顆粒細胞的凋亡[8-9]，在卵泡閉鎖過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，這提示卵泡膜細胞在卵巢功能調(diào)控，尤其是卵泡閉鎖過程中的作用有臨床實際意義。表達于各期卵泡的卵泡膜細胞孤兒核受體NR4A1在不同刺激因子作用下，主要通過磷酸化作用調(diào)節(jié)細胞凋亡。有研究表明，在多囊卵巢綜合征中，NR4A1表達下調(diào)可能通過抑制凋亡或增加有絲分裂引起卵巢中小卵泡的卵泡膜細胞過度增殖[10-11]。但人UCMSCs對POI大鼠的治療作用及卵巢中卵泡膜細胞表達的NR4A1在此治療過程中的機制研究甚少。因此，我們以CP構建的化療性POI大鼠模型為對象，探討 NR4A1 在 UCMSCs治療POI過程中的作用機制，為臨床上UCMSCs 治療POI提供實驗依據(jù)，為POI患者減輕病癥痛苦。

1 材料與方法

1.1 材料 5周齡雌性wistar大鼠(濟南朋悅實驗動物繁育有限公司)，E2、FSH ELISA 試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司)，順鉑、蘇木精(sigma公司)，TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(Roche公司)，Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒(BD Biosciences公司)，NR4A1抗體(proteintech公司)，SDS-PAGE配膠試劑盒(碧云天科技有限公司)，低糖DMEM培養(yǎng)基、McCoy’s 5A培養(yǎng)基、膠原酶、青霉素、鏈霉素(GIBCO公司)，胎牛血清(AusGeneX公司)。

1.2 CP誘導的POI大鼠模型 將5周齡雌性wistar大鼠30只隨機分為對照組、POI組、POI+UCMSCs組，每組10只。對照組腹腔注射等量的0.9%生理鹽水，POI組腹腔注射CP(2 mg/kg，溶于0.9%生理鹽水)，注射7 d。POI+UCMSCs組待注射CP觀察1周后，尾靜脈注射UCMSCs懸液(1×106個/mL)。 注射1 周后，取大鼠的血清及卵巢組織進行后續(xù)的實驗。

1.3 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定血清中雌激素(E2)、卵泡刺激素(Follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH)水平 將3組大鼠的血液樣品4℃靜置過夜，3 000 r/min離心15 min后取上清，根據(jù)E2、FSH的ELISA說明書檢測各組血清中E2、FSH的水平。

1.4 蘇木精‐伊紅(hematoxylin-eosin)染色 將3組大鼠的卵巢組織經(jīng)固定、脫水、透明、包埋、石蠟切片，制備成5 μm厚的切片，經(jīng)烤片、脫蠟、蘇木精及伊紅染色后進行封片，并在光學顯微鏡下觀察卵巢的形態(tài)學改變。

1.5 TUNEL細胞凋亡試劑盒檢測卵巢中細胞的凋亡情況 將3組大鼠卵巢組織制備成15 μm的冰凍切片，室溫過夜，根據(jù)TUNEL細胞凋亡試劑盒的說明書進行凋亡檢測，并用DAPI復染細胞核，在熒光顯微鏡下觀察卵泡膜細胞的凋亡情況。

1.6 大鼠卵泡膜間質(zhì)細胞(theca-interstitial cells，TICs)的體外培養(yǎng)、鑒定 選用5周齡雌性wistar大鼠，4%水合氯醛麻醉后，取出大鼠的卵巢組織，在體視顯微鏡下用針頭將卵泡刺破，使顆粒細胞流出，收集剩余組織，用5 mg/mL的膠原酶在37℃溫箱消化1 h，然后用McCoy’s 5A培養(yǎng)液(McCoy’s 5A培養(yǎng)基、10%胎牛血清、1%青、鏈霉素)1 500 r/min 離心5 min，在6孔板中用McCoy’s 5A培養(yǎng)液進行離體培養(yǎng)。通過檢測細胞色素P450c17α(cytochrome P450, family 17, subfamily A, polypeptide 1，Cyp17a1)及卵泡刺激素受體(follicle-stimulating hormone receptor，F(xiàn)SHR)的表達對離體培養(yǎng)的TICs進行鑒定[12-14]。

1.7 western blot檢測NR4A1的表達變化 將TICs隨機分為對照組、CP組、CP+UCMSCs組，CP組、CP+UCMSCs組分別用濃度為4 mg/L的CP，濃度為4 mg/L的CP及McCoy’s 5A培養(yǎng)液∶UCMSCs懸液(1×106個/mL)的體積比按照1∶1處理22 h，收集各組細胞，用RIPA裂解法分離蛋白樣品，并用蛋白上樣緩沖液進行處理，經(jīng)過電泳、轉膜、牛奶封閉等用NR4A1抗體(1∶1 000)4℃孵育過夜。次日用羊抗兔辣根過氧化物酶標記的HRP(1∶5 000)室溫孵育1 h后，用Tanon 5200進行ECL曝光，并利用Image J軟件進行統(tǒng)計學分析。

1.8 Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒檢測CP及UCMSCs處理后TICs的凋亡情況 將TICs用CP及UCMSCs處理后，胰酶消化后收集各組的TICs，PBS洗滌2次，加入500 μL的Binding buffer將細胞重懸，加入Annexin V和FITC各5 μL，混勻。室溫避光反應15 min，在1 h內(nèi)進行流式細胞儀的檢測。

2 結果

2.1 三組大鼠血清中E2、FSH 水平和卵巢的形態(tài)學改變 卵巢的形態(tài)學改變及血清中E2、FSH水平反映了卵巢的功能。如圖1和表1、2所示，與對照組相比，POI組大鼠卵巢中各級卵泡的數(shù)目明顯減少，而“類黃體樣”結構明顯增多，UCMSCs處理后卵巢中卵泡的數(shù)目明顯增加(P<0.05)。與對照組相比，POI組血清中E2水平明顯下降(P<0.01)、FSH水平升高(P<0.05)。與POI組相比，POI+UCMSCs組各級不同發(fā)育階段的卵泡數(shù)量明顯增多，血清中E2水平升高、FSH水平降低(P<0.05)。

A.三組大鼠卵巢木精‐伊紅染色圖像(× 100)；B. 三組大鼠卵巢中各級卵泡數(shù)目比較；C. 三組大鼠血清中E2水平比較；D. 三組大鼠血清中FSH水平比較。*P<0.05，**P<0.01。
圖1 三組大鼠血清中 E2、FSH水平及卵巢形態(tài)學的改變

表1 三組大鼠卵巢中各級卵泡數(shù)目比較

注：與對照組比較，*P<0.05；**P<0.01，與POI組比較，#P<0.05，##P<0.01。

表2 三組大鼠血清中E2、FSH水平

注： 與對照組比較，*P<0.05；**P<0.01，與POI組比較，#P<0.05。

2.2 大鼠卵巢中細胞的凋亡情況 在卵泡閉鎖過程中，顆粒細胞比卵泡膜細胞更容易凋亡。如圖2和表3所示，三組大鼠卵巢中均有顆粒細胞凋亡的發(fā)生。并且與對照組相比，POI組大鼠卵巢中凋亡細胞的數(shù)目明顯增多(P<0.01)。POI+UCMSCs組顆粒細胞凋亡的數(shù)目明顯減少(P<0.01)，這提示UCMSCs能夠明顯減少顆粒細胞的凋亡。

A. 三組大鼠卵巢中凋亡的顆粒細胞TUNEL染色圖像(400×)，綠色顯示的是FITC標記的凋亡細胞，藍色顯示的是DAPI復染的細胞核；B.三組大鼠卵巢中凋亡的顆粒細胞數(shù)目比較，**P<0.01。
圖2 三組大鼠卵巢中凋亡的顆粒細胞數(shù)目分析

表3 三組大鼠卵巢中凋亡的顆粒細胞數(shù)目比較

注：與對照組比較，**P<0.01，與POI組比較，##P<0.01。

2.3 TICs的形態(tài)學改變、鑒定及NR4A1的表達變化 如圖3所示，對體外離體培養(yǎng)的TICs的形態(tài)及特異性標記分子Cyp17a1表達的觀察發(fā)現(xiàn)，P1代TICs呈長梭形，免疫熒光和western blot結果顯示TICs細胞質(zhì)中Cyp17a1表達陽性，而FSHR表達陰性。另外，在TICs的細胞核中有NR4A1的表達。其中FSHR、NR4A1、Cyp17a1、GAPDH的分子量分別是78、64、50、36 kd。通過western blot對CP及UCMSCs處理后NR4A1的表達變化進行分析發(fā)現(xiàn)，CP處理后，TICs表達的NR4A1水平降低(P<0.01)，而CP+UCMSCs組NR4A1表達水平有所升高(P<0.05)(表4)。

A.TICs的形態(tài)觀察，P1代TICs呈長梭形(200×)；B～C. 免疫熒光和western blot結果顯示TICs細胞質(zhì)中Cyp17a1表達陽性，而FSHR表達陰性；D～E. western blot檢測CP及UCMSCs處理后TICs的NR4A1的表達變化，*P<0.05，**P<0.01。
圖3 TICs的形態(tài)學特點、特異性分子Cyp17a1、FSHR的表達(400×)及CP及UCMSCs對TICs的NR4A1表達水平的影響

表4 CP及UCMSCs處理后TICs的NR4A1灰度值分析

注： 與對照組比較，**P<0.01，與CP組比較，#P<0.05。

2.4 CP及UCMSCs處理后TICs的凋亡情況 如圖4和表5所示，CP處理后能夠增加TICs的凋亡情況，而CP+UCMSCs組凋亡比例明顯下降(P<0.01)。

表5 三組TICs凋亡細胞數(shù)目分析

注：與對照組比較，##P<0.01，與CP組比較，**P<0.01。

A～C. 流式細胞儀分別檢測對照組、CP組、CP+UCMSCs組TICs各期凋亡細胞的數(shù)目；D. 三組TICs的凋亡細胞數(shù)目進行統(tǒng)計學分析，**P<0.01。
圖4 CP及UCMSCs處理后TICs的凋亡情況

3 討論

目前MSCs已應用于多種疾病的治療過程中，并取得了一定的治療效果。POI患者常因閉經(jīng)或不孕進行臨床就診，目前還沒有有效的方法恢復患者的卵巢功能，對患者的家庭及社會產(chǎn)生明顯的影響。因此本研究以CP誘導形成的POI大鼠動物模型為研究對象，對UCMSCs治療POI的治療作用和可能的作用機制進行探討。我們通過對CP和UCMSCs處理過的卵巢形態(tài)學改變及激素水平進行對比發(fā)現(xiàn)，UCMSCs能夠恢復POI卵巢中的各級卵泡的數(shù)目和血清中激素水平。這提示UCMSCs能夠恢復POI卵巢的功能，但其具體的作用機制尚不清楚。POI發(fā)生最重要的機制是卵泡功能障礙和以卵泡閉鎖、細胞凋亡為特征的卵巢衰竭，卵泡耗竭[15]。在卵泡閉鎖過程中，顆粒細胞比卵泡膜細胞更容易凋亡，顆粒細胞層在閉鎖的發(fā)展期急劇減少，而卵泡膜細胞過度增生。在閉鎖末期，顆粒細胞幾乎消失，卵泡膜細胞被纖維母細胞取代。這提示顆粒細胞的凋亡是卵泡閉鎖的首要指征，卵泡膜細胞改變是卵泡閉鎖發(fā)生的重要指征。本實驗中動物體內(nèi)卵巢的凋亡結果顯示，顆粒細胞在三組大鼠的卵巢中均有凋亡的發(fā)生，而卵泡膜細胞未發(fā)生凋亡。在動物體內(nèi)卵泡膜細胞的凋亡不易被檢測到，但卵泡膜細胞過度增生并被纖維母細胞取代的現(xiàn)象在POI卵巢中可被觀察到，有研究通過masson染色發(fā)現(xiàn)在POI卵巢的類黃體樣結構中有明顯的纖維存在[16]。我們之前研究發(fā)現(xiàn)MSCs通過調(diào)節(jié)顆粒細胞的凋亡而發(fā)揮其治療作用[17]。在卵泡發(fā)育過程中卵泡膜細胞的功能同樣重要，卵泡膜細胞源性生長因子能夠促進顆粒細胞的增殖和抑制顆粒細胞的凋亡[8,18]，在卵泡閉鎖過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，這提示卵泡膜細胞在卵巢功能調(diào)控，尤其是卵泡閉鎖過程中的作用有臨床實際意義。表達于各期卵泡卵泡膜細胞的NR4A1在不同刺激因子作用下，主要通過磷酸化作用調(diào)節(jié)細胞凋亡。非磷酸化的NR4A1 表達于細胞核，而在一些刺激信號的作用下，NR4A1 發(fā)生磷酸化，表達于細胞核和細胞質(zhì)中。在其他組織發(fā)生凋亡過程中，磷酸化的 NR4A1 從細胞核移位至細胞質(zhì)，定位于線粒體，與 Bcl-2 結合使其構象發(fā)生改變，與此同時，線粒體釋放細胞色素 C 進入細胞質(zhì)，最終胱天蛋白酶(caspase)作為細胞凋亡的標志物，通過激活其他 caspase 分子，引發(fā)一系列級聯(lián)反應[19-20]。本實驗的免疫熒光和western blot結果顯示在TICs中有NR4A1的表達，并且經(jīng)CP及UCMSCs處理后TICs表達的NR4A1水平明顯發(fā)生改變。TICs經(jīng)CP處理后，其細胞凋亡明顯增加，并且NR4A1的表達明顯下降，而UCMSCs處理明顯減少了TICs的凋亡數(shù)目，其表達的NR4A1水平也有所增加。這提示TICs表達的NR4A1在POI發(fā)生以及UCMSCs治療過程中發(fā)揮重要的作用。有文獻指出MSCs通過旁分泌的作用恢復POI卵巢的功能[21-22]。因此，我們認為：UCMSCs通過旁分泌的作用，調(diào)節(jié)TICs表達的NR4A1水平，繼而減少卵泡膜細胞的凋亡細胞數(shù)目，增加卵泡膜細胞對顆粒細胞凋亡的調(diào)節(jié)作用，改善POI卵巢的功能。