曹 梅，胡 珊，崔 瑜，尹 恒，張晶晶，樊秦娥，劉雪琴

(十堰市太和醫(yī)院湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，湖北 十堰 442000)

盆腔炎(PID)是由多種細菌感染引起的女性上生殖道炎癥，通常涉及子宮，輸卵管和卵巢，嚴重影響女性生活質(zhì)量，可導(dǎo)致嚴重的后遺癥，如輸卵管性不孕，異位妊娠和慢性盆腔疼痛[1-2]。研究表明[3]，盆腔炎是卵巢癌的潛在危險因素，尤其是亞洲女性，最常見的病原體為淋病奈瑟球菌、沙眼衣原體、解脲脲支原體,此外金黃色葡萄球菌、大腸桿菌也與盆腔炎的發(fā)病有關(guān)[4]。目前臨床上對盆腔炎的主要治療方法是抗生素治療，其中阿奇霉素單藥治療或阿奇霉素與甲硝唑聯(lián)合治療具有良好的治療效果[5]。此外，包括頭孢曲松，頭孢西丁，多西環(huán)素和甲硝唑在內(nèi)的幾種抗生素也對盆腔炎癥提供了良好的抗菌效果和較高的臨床治愈率。但細菌耐藥性和藥物副作用是臨床使用抗生素不可忽視的問題，因此，迫切需要找到新的補充和替代治療盆腔炎的藥物。加味大黃牡丹皮湯由大黃10 g、牡丹皮10 g、桃仁10 g、赤白芍10 g、紅藤25 g、忍冬藤20 g、敗醬草15 g、酒延胡索15 g、丹參10 g，生甘草6 g組成，方中大黃和牡丹皮具有良好的抗炎作用；桃仁促進血液循環(huán)，消除血瘀；冬瓜仁排膿消腫；芒硝軟堅散積，諸藥合用蕩熱祛瘀[6-7]。本研究采用急性盆腔炎大鼠模型，研究加味大黃牡丹皮湯對大鼠子宮、卵巢的保護作用及NF-κB信號通路的影響，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器CryoStarTMNX70型病理冰凍切片機(美國賽默飛世爾公司)；9700型PCR擴增儀(美國ABI公司)；SD-987型數(shù)顯電子天平(德國默克公司)；奧林巴斯CKX53型顯微鏡(日本奧林巴斯公司)；EPS-300 /HE90 /VE-186型電泳系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)；ImagePro plus6.0圖像分析軟件(美國賽默飛世爾科技公司)。

1.2 試藥加味大黃牡丹皮湯購自重慶市中醫(yī)院中藥房；潑尼松(廣東眾生藥業(yè)股份有限公司，批號20110107)；黃體酮(浙江仙琚制藥有限公司，批號：20180124)；大腸桿菌(北納生物科技有限公司，菌種號22162)；金黃色葡萄球菌(北納生物科技有限公司，菌種號38113)；解脲脲原體(北納生物科技有限公司，菌種號23011)；IL-6、IL-8、TNF-αELISA檢測試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司，批號：112311、150279、152279)；兔抗大鼠NF-κBp65、IκB-α多克隆抗體(美國Sigma公司，批號：9323、9121)；Trizol試劑盒(美國Santa Cruz公司，批號：112311)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及實時熒光定量PCR試劑盒(美國ABCAM公司，批號：RQ118A)；引物序列(美國Invitrogen公司，批號：SC-522、KB-118、CA-445)。

1.3 實驗動物取成年雌性健康SD大鼠40只，體質(zhì)量(200±20)g，由重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，動物證書號：SCXK2012-0042。在受控溫度和濕度的環(huán)境下，將大鼠圈養(yǎng)在12 h光照/黑暗循環(huán)且相對濕度在60%～65%的環(huán)境中，自由進食和飲水。本實驗經(jīng)由重慶醫(yī)科大學(xué)動物保護委員會批準，符合美國國立衛(wèi)生研究院實驗動物飼養(yǎng)和管理指南。

1.4 分組與造模方法在40只SD大鼠中隨機選取10只作為對照組，剩余30只SD大鼠建立模型。參照文獻[7]制備大鼠急性盆腔炎模型，大鼠在造模前1周皮下注射10 mg黃體酮，并適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，通過腹膜內(nèi)注射20%的氨基甲酸乙酯麻醉，用注射器插入子宮腔并沿著子宮壁來回拉動造成子宮內(nèi)膜組織損傷。制備0.3 mL的多病原體溶液(金色葡萄球菌1×108CCU/mL、大腸桿菌1×108CCU/L、解脲脲原體1×108CCU/L)，將溶液注射進大鼠卵巢后倒置大鼠5 min。該感染過程每2天進行1次，共進行4次，每次感染后用70%酒精進行表面消毒。對照組大鼠采取同樣操作，用同等體積的生理鹽水代替多病原體溶液，且不用注射器造成子宮內(nèi)膜損傷。大鼠造模成功后，隨機分為模型組、加味大黃牡丹皮湯組、阿奇霉素組，每組10只。第1次感染8 d后，加味大黃牡丹皮湯組大鼠灌胃給予加味大黃牡丹皮湯提取物6 g/kg體質(zhì)量，阿奇霉素組大鼠灌胃給予阿奇霉素1.7mg/kg體質(zhì)量，模型組和對照組大鼠灌胃給予相同體積的生理鹽水。

1.5 標本采集與測定方法各組大鼠第1次感染8 d后皮下注射戊巴比妥30 mg/kg體質(zhì)量進行麻醉，腹主動脈取血5 mL，收集右側(cè)子宮和卵巢保存于-80℃冰箱中，將左側(cè)子宮和卵巢浸入10%福爾馬林溶液中，頸椎脫臼處死大鼠。(1)組織學(xué)評價：將大鼠左側(cè)子宮和卵巢進行石蠟包埋，切成2 μm切片，用蘇木精和伊紅(HE)染色，光鏡下(×200)檢查每個載玻片的三個組織結(jié)構(gòu)和病變特點，通過評估炎癥細胞的浸潤程度(0分～3分)，對每個子宮和卵巢的炎癥進行評分[8]。(2)酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)：將大鼠血液靜置30 min，離心后取上層血清，按ELISA試劑盒按說明書步驟檢測血清中IL-6、IL-8、TNF-α的含量。(3)蛋白質(zhì)印跡法(Western-Blot)檢測NF-κBp65、IκBα蛋白表達水平：將子宮和卵巢組織在含有1%苯甲基磺酰氟的RIPA裂解液中勻漿，勻漿后取上清液，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離等量的蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上，并在4℃下與NF-κB/IκBα一抗(1∶1 000)孵育過夜，洗滌后添加辣根過氧化物酶的二抗(1∶1 000)溫育2 h。二抗孵育后顯色、曝光、顯影。并以β-actin 為內(nèi)參計算相對光密度值(ROD)。(4)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)：通過Trizol試劑提取大鼠子宮和卵巢組織中的總RNA(20 mg)，按試劑盒說明書操作進行，用氯仿處理RNA，在4℃，12 000 r/min離心20 min,并用75%乙醇沉淀，將來自子宮樣品的總RNA(1 μg)在20 μL的反應(yīng)體積中進行逆轉(zhuǎn)錄，將合成的cDNA保存在-20℃中，并使用SYBR Premix Ex Taq II(TaKaRa)進行定量實時PCR測得各組大鼠子宮中NF-κBp65、IκBα RNA的表達水平。子宮組織中的NF-κBp65的序列為：上游5′-CAAGATGGTCGCTCGTAATT-3′，下游5′-ACGGCATTGCTGATCTGGAT-3′；IκB-α的序列為：上游5′-ACTCCCATAAGCCTGCTGAT-3′,下游5′-ATGCCCTTGGGTTGATCGTG-3′；β-actin 的序列為：上游 5′-TGACCCAACTTGCAGCTCCA-3′，下游 5′-TCATCCACATGAACTAGGTC-3′。擴增條件：95℃持續(xù)10 s用于變性，55℃持續(xù)10 s用于復(fù)性，72℃持續(xù)15 s用于延長。β-actin擴增條件：95℃持續(xù)1 min用于變性，57℃持續(xù)45 s用于復(fù)性，72℃持續(xù)45 s用于延長，在每個循環(huán)結(jié)束時檢測熒光信號。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠子宮和卵巢的組織學(xué)切片比較模型組大鼠子宮和卵巢可見大量炎癥細胞，包括大量中性粒細胞和淋巴細胞浸潤，表明上生殖道炎癥的發(fā)生。與對照組比較，模型組、加味大黃牡丹皮湯組和阿奇霉素組大鼠子宮和卵巢炎癥細胞的組織學(xué)半定量評分升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，加味大黃牡丹皮湯組、阿奇霉素組大鼠子宮和卵巢中性粒細胞和淋巴細胞的浸潤減少，子宮和卵巢炎癥細胞組織學(xué)半定量評分降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，表示，見圖1-2。

表1 各組大鼠子宮、卵巢炎癥細胞組織學(xué)半定量評分比較 分)

注：與對照組比較：▲P<0.05；與模型組比較：▲#P<0.05。

2.2 各組大鼠血清中IL-6、IL-8、TNF-α含量比較與對照組比較，模型組、加味大黃牡丹皮湯組和阿奇霉素組大鼠血清中IL-6、IL-8、TNF-α含量升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，加味大黃牡丹皮湯組和阿奇霉素組大鼠血清中IL-6、IL-8、TNF-α含量降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

對照組

模型組

加味大黃牡丹皮湯組

阿奇霉素組

圖1 子宮組織病理檢測結(jié)果(HE染色,×200)

對照組

加味大黃牡丹皮湯組

阿奇霉素組

圖2 卵巢組織病理檢測結(jié)果(HE染色,×200)

表2 各組大鼠血清中IL-6、IL-8、TNF-α的含量比較

注：與正常對照組比較：▲P<0.05；與模型組比較：#P<0.05。

2.3 各組大鼠子宮組織中NF-κBp65、IκBα相對蛋白表達水平比較與對照組比較，模型組大鼠子宮組織中NF-κBp65、IκBα相對蛋白表達水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，加味大黃牡丹皮湯組和阿奇霉素組大鼠子宮組織中NF-κBp65、IκBα相對蛋白表達水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表3、圖3。

表3 各組大鼠子宮組織中NF-κBp65、IκBα相對蛋白表達水平比較

注：與正常對照組比較,▲P<0.05；與模型組比較,#P<0.05。

2.4 各組大鼠卵巢組織中NF-κBp65、IκBα相對蛋白表達水平比較與對照組比較，模型組大鼠卵巢組織中NF-κBp65、IκBα相對蛋白表達水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，加味大黃牡丹皮湯組和阿奇霉素組大鼠卵巢組織中NF-κBp65、IκBα相對蛋白表達水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表4。

圖3 各組大鼠子宮組織中NF-kBp65、IκBα蛋白表達電泳圖

表4 各組大鼠子宮組織中NF-κBp65、IκB-α相對蛋白表達水平比較

注：與正常對照組比較：▲P<0.05；與模型組比較：#P<0.05。

3 討論

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認為盆腔炎癥主要病因是盆腔組織中細菌或萄球菌、大腸桿菌、解脲脲原體在內(nèi)的病原體的直接或間接感染[9]。研究表明中性粒細胞浸潤到脂多糖誘導(dǎo)的子宮內(nèi)膜炎小鼠的子宮內(nèi)膜，當(dāng)大量中性粒細胞達到感染部位的組織時，會導(dǎo)致組織損傷并導(dǎo)致上生殖道結(jié)構(gòu)性疾病[10-11]。本研究病理結(jié)果顯示模型組大鼠子宮和卵巢中可見大量的中性粒細胞和淋巴細胞浸潤到上生殖道，通過對炎癥細胞的組織學(xué)半定量評分比較發(fā)現(xiàn)，模型組的評分最高，提示急性盆腔炎大鼠模型制備成功。在經(jīng)加味大黃牡丹皮湯和阿奇霉素治療后中性粒細胞和淋巴細胞的浸潤相對減少，加味大黃牡丹皮湯組和阿奇霉素組組織學(xué)半定量評分降低，提示加味大黃牡丹皮湯對急性盆腔炎大鼠具有較好的抗炎作用。在炎性細胞因子中起主要作用的是TNF-α、IL-6、IL-8等[12]，其中TNF-α是炎癥過程中最早和最重要的炎癥介質(zhì)，它能夠激活中性粒細胞和淋巴細胞，增加血管內(nèi)皮細胞的通透性[13]；IL-6可誘導(dǎo)T細胞活化、增殖和分化，B細胞分化和抗體產(chǎn)生，參與機體的免疫反應(yīng)，是炎癥反應(yīng)的誘發(fā)因素[14]；IL-8可破壞內(nèi)皮細胞，使微循環(huán)血瘀，組織壞死，并引起器官功能損害[15]。這些炎癥細胞因子在血清中的水平隨病原體感染和局部Toll樣受體識別免疫原而增加。有研究表明[16]，大黃可以通過降低血清中炎癥細胞因子如IL-6、IL-8和TNF-α的水平，起到對盆腔炎模型大鼠良好的治療效果。

NF-κB是促進參與炎癥和免疫反應(yīng)的基因轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵因子[17-18]。在大多數(shù)靜息細胞中，NF-κB因子和IκB因子共價結(jié)合并位于細胞質(zhì)中。當(dāng)這些細胞表面的Toll樣受體識別病原體后，導(dǎo)致IκB因子磷酸化而降解，同時NF-κB因子將易位至細胞核并與NF-κB基因的順式原件發(fā)生反應(yīng)相結(jié)合，促進其表達[19]。NF-κBp65和IκBα分別是子宮和卵巢中NF-κB因子和IκB因子的代表[20]，因此選擇其作為檢測NF-κB途徑是否在本次研究中被激活的指標。

本研究發(fā)現(xiàn)加味大黃牡丹皮湯對急性盆腔炎具有保護作用，能夠減少中性粒細胞和淋巴細胞的浸潤，抑制細胞因子IL-6、IL-8、TNF-α的過量產(chǎn)生,此外大鼠子宮內(nèi)多次感染病原體后，NF-κB信號通路被激活，大黃牡丹湯發(fā)揮其抗炎作用，具有阻斷NF-κB通路活化的作用。