長鏈非編碼RNA（Long non-coding RNAs，lncRNAs）是一大類不編碼蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄本，雖然已知一些lncRNAs在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中具有重要功能，但大部分lncRNAs的功能仍有待深入研究。因此，大規(guī)模、無偏差地篩選功能性lncRNA基因座對(duì)該領(lǐng)域的發(fā)展至關(guān)重要。此外，由于任何一種方法都可能同時(shí)受到假陽性和假陰性的影響，因此使用多種正交策略來探索lncRNA功能顯然是有價(jià)值的。

近日，加利福尼亞大學(xué)Jonathan S. Weissman團(tuán)隊(duì)在知名期刊Nature Biotechnology在線發(fā)表了一篇題為“Fitness effects of CRISPR/Cas9-targeting of long noncoding RNA genes”的文章，作者對(duì)2018年11月5日北京大學(xué)生物醫(yī)學(xué)前沿創(chuàng)新中心、北京未來基因診斷高精尖創(chuàng)新中心魏文勝課題組在Nature Biotechnology雜志在線發(fā)表了題為“Genome-wide screening for functional long noncoding RNAs in human cells by Cas9 targeting of splice sites”的研究論文進(jìn)行了深入的討論。

魏文勝研究團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了特異性靶向基因剪接位點(diǎn)的新型CRISPR文庫，以高通量的方式產(chǎn)生基因外顯子缺失或者內(nèi)含子滯留，運(yùn)用這一策略，首次實(shí)現(xiàn)了全基因組水平上對(duì)于LncRNA功能的高效篩選。Weissman團(tuán)隊(duì)認(rèn)為盡管該方法是對(duì)用于描述lncRNA功能的策略的重要補(bǔ)充，但也有一些重要的事項(xiàng)值得注意。Weissman團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)一些證據(jù)表明，由于拷貝數(shù)擴(kuò)增區(qū)域中的核酸酶活性或蛋白質(zhì)編碼基因的重疊，這些篩選中的大部分hits（每個(gè)細(xì)胞系中至少30-39%）很可能是假陽性。此外，Weissman團(tuán)隊(duì)認(rèn)為魏文勝團(tuán)隊(duì)選擇的驗(yàn)證方法不夠正交，無法識(shí)別這種假陽性。

Weissman團(tuán)隊(duì)分析了魏文勝團(tuán)隊(duì)文章中對(duì)慢性髓性白血病細(xì)胞K562中篩選結(jié)果，他們觀察到，通過靶向剪接位點(diǎn)確定的許多top hits集中在基因組的特定區(qū)域，其中22個(gè)位于22號(hào)染色體的一個(gè)區(qū)域。這些發(fā)現(xiàn)包括BMS1P20，一種在魏文勝團(tuán)隊(duì)的研究中特別強(qiáng)調(diào)的lncRNA編碼基因。該區(qū)域位于著絲粒和斷點(diǎn)簇區(qū)基因位點(diǎn)之間，是一個(gè)經(jīng)過拷貝數(shù)擴(kuò)增的基因組區(qū)域。由于這種作用是由于Cas9核酸酶活性產(chǎn)生許多雙鏈斷裂而觸發(fā)的DNA損傷反應(yīng)所致，因此Weissman團(tuán)隊(duì)在使用CRISPRi方法檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)無論是蛋白質(zhì)編碼還是靶向篩選lncRNA基因座中均未觀察到該區(qū)域的hits富集。

Weissman團(tuán)隊(duì)又檢查位于非擴(kuò)增區(qū)篩選出的hits時(shí)，他們發(fā)現(xiàn)這些hits富含重疊蛋白質(zhì)編碼基因的lncRNA基因座。盡管此類lncRNA可能獨(dú)立于蛋白質(zhì)編碼基因活性，但仍需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來確定其的功能。

Weissman團(tuán)隊(duì)觀察到在HeLa細(xì)胞篩選中排名靠前的兩個(gè)hits基因，CASC19和CCAT1（一種lncRNA），先前已被證明可調(diào)節(jié)直腸癌MYC基因座上的染色質(zhì)環(huán)癌細(xì)胞，與HeLa細(xì)胞中第8號(hào)染色體上的人乳頭瘤病毒18（HPV18）整合位點(diǎn)相鄰.盡管更高分辨率的分析發(fā)現(xiàn)該基因座內(nèi)的區(qū)域最多包含34個(gè)重復(fù)序列，但ENCODE拷貝數(shù)數(shù)據(jù)（log2R<0.3）不能明顯擴(kuò)增該區(qū)域。在Jia團(tuán)隊(duì)的siRNA和互補(bǔ)DNA過表達(dá)實(shí)驗(yàn)以及作者的CRISPRi篩選實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，CCAT1還調(diào)節(jié)了HeLa細(xì)胞的生長，表明表型不是由于拷貝數(shù)效應(yīng)。最終作者認(rèn)為仍然需要進(jìn)一步的正交方法來建立CCAT1/CASC19 lncRNA基因座在HeLa細(xì)胞中的獨(dú)特功能。

最后Weissman團(tuán)隊(duì)總結(jié)每種干擾lncRNA功能的方法都會(huì)產(chǎn)生假象，需要仔細(xì)過濾以最小化這些影響，然后才能得出關(guān)于該方法的結(jié)論。其他團(tuán)隊(duì)也記錄了由于拷貝數(shù)增加而導(dǎo)致假陽性的可能性。即使在整倍體區(qū)域，CRISPR介導(dǎo)的雙鏈DNA斷裂也可引起可測(cè)量的生長缺陷，尤其是在p53野生型細(xì)胞中。更廣泛地說，這些結(jié)果強(qiáng)調(diào)了使用全正交方法驗(yàn)證敲除結(jié)果的重要性。Weissman團(tuán)隊(duì)認(rèn)為使用配對(duì)的sgRNA缺失外顯子以靶向剪接供體/受體位點(diǎn)的sgRNA進(jìn)行初步篩選不夠正交。如果通過不同類型的干擾獲得的結(jié)果存在真正的差異，則進(jìn)一步的分析加上對(duì)方法本身的理解，實(shí)際上可以揭示出新的重要的機(jī)理見解。