長鏈非編碼RNA（Long non-coding RNAs，lncRNAs）是一大類不編碼蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄本，雖然已知一些lncRNAs在哺乳動物細胞中具有重要功能，但大部分lncRNAs的功能仍有待深入研究。因此，大規(guī)模、無偏差地篩選功能性lncRNA基因座對該領(lǐng)域的發(fā)展至關(guān)重要。此外，由于任何一種方法都可能同時受到假陽性和假陰性的影響，因此使用多種正交策略來探索lncRNA功能顯然是有價值的。

近日，加利福尼亞大學Jonathan S. Weissman團隊在知名期刊Nature Biotechnology在線發(fā)表了一篇題為“Fitness effects of CRISPR/Cas9-targeting of long noncoding RNA genes”的文章，作者對2018年11月5日北京大學生物醫(yī)學前沿創(chuàng)新中心、北京未來基因診斷高精尖創(chuàng)新中心魏文勝課題組在Nature Biotechnology雜志在線發(fā)表了題為“Genome-wide screening for functional long noncoding RNAs in human cells by Cas9 targeting of splice sites”的研究論文進行了深入的討論。

魏文勝研究團隊構(gòu)建了特異性靶向基因剪接位點的新型CRISPR文庫，以高通量的方式產(chǎn)生基因外顯子缺失或者內(nèi)含子滯留，運用這一策略，首次實現(xiàn)了全基因組水平上對于LncRNA功能的高效篩選。Weissman團隊認為盡管該方法是對用于描述lncRNA功能的策略的重要補充，但也有一些重要的事項值得注意。Weissman團隊發(fā)現(xiàn)一些證據(jù)表明，由于拷貝數(shù)擴增區(qū)域中的核酸酶活性或蛋白質(zhì)編碼基因的重疊，這些篩選中的大部分hits（每個細胞系中至少30-39%）很可能是假陽性。此外，Weissman團隊認為魏文勝團隊選擇的驗證方法不夠正交，無法識別這種假陽性。

Weissman團隊分析了魏文勝團隊文章中對慢性髓性白血病細胞K562中篩選結(jié)果，他們觀察到，通過靶向剪接位點確定的許多top hits集中在基因組的特定區(qū)域，其中22個位于22號染色體的一個區(qū)域。這些發(fā)現(xiàn)包括BMS1P20，一種在魏文勝團隊的研究中特別強調(diào)的lncRNA編碼基因。該區(qū)域位于著絲粒和斷點簇區(qū)基因位點之間，是一個經(jīng)過拷貝數(shù)擴增的基因組區(qū)域。由于這種作用是由于Cas9核酸酶活性產(chǎn)生許多雙鏈斷裂而觸發(fā)的DNA損傷反應所致，因此Weissman團隊在使用CRISPRi方法檢測時發(fā)現(xiàn)無論是蛋白質(zhì)編碼還是靶向篩選lncRNA基因座中均未觀察到該區(qū)域的hits富集。

Weissman團隊又檢查位于非擴增區(qū)篩選出的hits時，他們發(fā)現(xiàn)這些hits富含重疊蛋白質(zhì)編碼基因的lncRNA基因座。盡管此類lncRNA可能獨立于蛋白質(zhì)編碼基因活性，但仍需要進一步的實驗來確定其的功能。

Weissman團隊觀察到在HeLa細胞篩選中排名靠前的兩個hits基因，CASC19和CCAT1（一種lncRNA），先前已被證明可調(diào)節(jié)直腸癌MYC基因座上的染色質(zhì)環(huán)癌細胞，與HeLa細胞中第8號染色體上的人乳頭瘤病毒18（HPV18）整合位點相鄰.盡管更高分辨率的分析發(fā)現(xiàn)該基因座內(nèi)的區(qū)域最多包含34個重復序列，但ENCODE拷貝數(shù)數(shù)據(jù)（log2R<0.3）不能明顯擴增該區(qū)域。在Jia團隊的siRNA和互補DNA過表達實驗以及作者的CRISPRi篩選實驗發(fā)現(xiàn)，CCAT1還調(diào)節(jié)了HeLa細胞的生長，表明表型不是由于拷貝數(shù)效應。最終作者認為仍然需要進一步的正交方法來建立CCAT1/CASC19 lncRNA基因座在HeLa細胞中的獨特功能。

最后Weissman團隊總結(jié)每種干擾lncRNA功能的方法都會產(chǎn)生假象，需要仔細過濾以最小化這些影響，然后才能得出關(guān)于該方法的結(jié)論。其他團隊也記錄了由于拷貝數(shù)增加而導致假陽性的可能性。即使在整倍體區(qū)域，CRISPR介導的雙鏈DNA斷裂也可引起可測量的生長缺陷，尤其是在p53野生型細胞中。更廣泛地說，這些結(jié)果強調(diào)了使用全正交方法驗證敲除結(jié)果的重要性。Weissman團隊認為使用配對的sgRNA缺失外顯子以靶向剪接供體/受體位點的sgRNA進行初步篩選不夠正交。如果通過不同類型的干擾獲得的結(jié)果存在真正的差異，則進一步的分析加上對方法本身的理解，實際上可以揭示出新的重要的機理見解。