劉凱凱，唐君瑋，袁廷柱，宋靜靜，劉洪軍，蓋珊珊，遲雯丹，于道德**

(1.山東省海洋生物研究院，山東青島 266104；2.山東省海水養(yǎng)殖病害防治重點實驗室，山東青島 266104；3.青島市淺海底棲漁業(yè)增殖重點實驗室，山東青島 266104；4.長島海洋生態(tài)文明綜合試驗區(qū)海洋經(jīng)濟促進中心，山東煙臺 265800)

0 引言

溶氧(Dissolved Oxygen,DO)作為水域環(huán)境的一個重要參數(shù)，與所有水域生物的生存密切相關(guān)。水體中的溶氧含量是影響水生生物生長發(fā)育的重要因子。溶氧含量過低時，底層魚類和其他活動性較強的無脊椎動物可以通過遷徙來逃避低氧環(huán)境，而活動性能力差的貝類更容易受到缺氧脅迫的影響；在溶氧回升后，某些受損害群落(如牡蠣礁)難以恢復(fù)到以前的狀態(tài)[1-2]。在長期的進化過程中，潮間帶的貝類形成了相應(yīng)的應(yīng)激機制，已成為最耐低氧的生物類群之一。

在過去的幾十年內(nèi)，由于人類活動的影響，水域的溶氧(尤其是海洋)已發(fā)生了明顯的變化，出現(xiàn)了大量的低氧區(qū)域(Oxygen Minimum Zones,OMZs)[3-4]。低氧(Hypoxia)泛指水體溶氧含量低于2.0 mL/L (相當于2.8 mg/L或者91.4 mmol/L)，并可細分為3個等級：(1)≤2.0 mL/L DO，氧氣不足，生物體開始表現(xiàn)出異常行為；(2)≤1.0 mL/L DO，輕度缺氧，生物開始出現(xiàn)死亡；(3)≤0.5 mL/L DO，嚴重缺氧，生物大量死亡。而缺氧(Anoxia)則是指氧分壓小于0.07 mL/L DO的水域，或者嚴格的無氧狀態(tài)(0 mL/L DO)[5-6]。

利用缺氧來檢測環(huán)境脅迫對貝類的負面影響具有很多優(yōu)勢，包括操作簡易、重復(fù)性高以及成本低等[7-8]。海洋貝類作為濾食動物，對環(huán)境保護的貢獻不容忽視。因此，研究貝類的缺氧脅迫不僅對于養(yǎng)殖業(yè)具有重要的實踐指導(dǎo)意義，同時對于整個海洋生態(tài)的維持和可持續(xù)發(fā)展更具有深遠的影響。

1 海洋缺氧的原因與發(fā)展趨勢

由自然界物理作用引起的水體溫度和鹽度的分層，以及溫鹽躍層的出現(xiàn)是導(dǎo)致近岸海底缺氧的主要原因，缺氧通?？梢鸬讞珓游锼劳觥Ｈ绻w能夠自然交換，或者說沒有分層現(xiàn)象，自然界就根本不會存在缺氧的區(qū)域[9]。近年來的研究表明，分層現(xiàn)象導(dǎo)致全球海洋上層和溫躍層氧氣含量減少[10-11]。這種自然發(fā)生的缺氧現(xiàn)象最早記錄于19世紀80年代，并且呈現(xiàn)出一定的周期性[12]。例如，發(fā)生在美國亞拉巴馬州莫比爾灣的“Jubilee”現(xiàn)象可以追溯到18世紀60年代。“Jubilee”現(xiàn)象就是一個典型的季節(jié)性缺氧，幾乎每年夏季發(fā)生一次，主要是由有機物的沉積造成的[13]。

人類活動導(dǎo)致水體富營養(yǎng)化，是造成水體缺氧的另一個重要原因。近岸水域由于陸源輸入大量的N、P和Si等營養(yǎng)物質(zhì)和大量可供微生物分解利用的有機物(包括城市生活污水、工業(yè)廢水、農(nóng)業(yè)化肥過量使用等)[14]，造成了水體富營養(yǎng)化，使缺氧現(xiàn)象發(fā)生在從未發(fā)生過的區(qū)域，這樣的區(qū)域被生態(tài)學(xué)家稱為“死亡區(qū)域”(Dead Zone)。目前，世界范圍內(nèi)共發(fā)現(xiàn)500多個死亡區(qū)域，共涉及245 000 km2的海域[15]。而且在每年的夏季(水溫最高時，分層最強)超過一半的區(qū)域都會發(fā)生缺氧現(xiàn)象，導(dǎo)致海洋底棲生物大量死亡[5-6]。水體缺氧已經(jīng)成為全球生態(tài)與環(huán)境問題的主要關(guān)注點之一。我國近海水體缺氧現(xiàn)象也日趨嚴重，在長江口、珠江口等區(qū)域已出現(xiàn)了季節(jié)性的缺氧[16-17]。

2 貝類對缺氧脅迫的適應(yīng)性進化

生活于潮間帶的海洋無脊椎動物每天都會經(jīng)歷一段低氧時期，降低代謝率是其對低氧脅迫的首要適應(yīng)性進化機制[18-19]。研究發(fā)現(xiàn)，美洲牡蠣(Crassostreavirginica)在低氧期的基礎(chǔ)代謝率僅為正常狀態(tài)的75%[20]，其主要通過可逆的蛋白磷酸化修飾來限制大多數(shù)酶和功能蛋白的活性，從而降低基礎(chǔ)代謝率[21]；當環(huán)境條件改善后，則可恢復(fù)相關(guān)酶類和功能蛋白的活性，從而維持機體的正常生理活動。其次，貝類適應(yīng)缺氧環(huán)境的另一個機制是通過消耗貯存的能源物質(zhì)(如糖原和天冬氨酸鹽類等)，改變其代謝途徑(如糖酵解)，并聯(lián)合底物水平的磷酸化而產(chǎn)生更多的能量供給機體[19]。例如翡翠股貽貝(Pernaviridis)就是通過肝糖原的糖酵解，產(chǎn)生更多的ATP來維持基礎(chǔ)代謝[22-23]。再次，就是改變糖酵解的終產(chǎn)物，避免乳酸過多而破壞機體的酸堿平衡。歐洲鳥尾蛤(Cerastodermaedule)會產(chǎn)生L-丙氨酸和D-乳酸鹽兩種糖酵解物質(zhì)，大大降低了代謝產(chǎn)物的酸性[24]，其中L-丙氨酸主要是通過轉(zhuǎn)氨作用產(chǎn)生，與天冬氨酸向琥珀酸的轉(zhuǎn)變相偶聯(lián)[19]。當環(huán)境達到缺氧狀態(tài)，貝類會進一步降低基礎(chǔ)代謝率和ATP的產(chǎn)生及利用，甚至可以降低到基礎(chǔ)水平的10%[25]。許多耗能過程都會受到不同程度的抑制，包括大分子物質(zhì)，如DNA、RNA和蛋白質(zhì)的合成等[19]。

3 缺氧對貝類免疫系統(tǒng)的影響

缺氧脅迫能夠影響貝類很多重要的生理和生化過程[19,26]。其中對免疫系統(tǒng)的影響最大，因此通過免疫指標的變化來檢測環(huán)境壓力對貝類的影響已成為該領(lǐng)域研究的熱點[27]。貝類作為無脊椎動物，體內(nèi)沒有特異性免疫細胞和相應(yīng)的抗體。貝類的免疫防御機制可分為細胞免疫與體液免疫，兩者相輔相成，共同抵御外來物質(zhì)的入侵，并對應(yīng)激做出免疫應(yīng)答。

3.1 缺氧對細胞免疫的影響

雙殼貝類的血淋巴細胞具有多種功能，包括免疫防御、營養(yǎng)物質(zhì)的消化和轉(zhuǎn)運、排泄以及貝殼的修復(fù)、礦化等[28]。異物侵入機體能夠刺激血淋巴細胞介導(dǎo)的吞噬作用[29]。在血淋巴細胞吞噬過程中，同時會釋放一些水解酶和溶菌酶，這樣能夠幫助滅活其他部位的入侵病原菌[30]。因此，血淋巴細胞的任何參數(shù)，包括比容、數(shù)量、分布、吸附能力、吞噬活性、相關(guān)溶酶體酶活性以及血淋巴產(chǎn)生的活性氧等都成為檢測環(huán)境脅迫對免疫系統(tǒng)影響程度的重要指標[27,31]。

缺氧脅迫幾乎能夠影響到與血淋巴細胞相關(guān)的所有的功能，整合作用導(dǎo)致雙殼貝類血淋巴細胞的免疫活性大大降低[32]，進而是雙殼貝類的免疫功能受到抑制，對病原體的易感性也隨之增加，是貝類死亡的主要原因[33]。

3.1.1 缺氧對血細胞總數(shù)的影響

貝類的免疫防御反應(yīng)中，血淋巴細胞對病原菌和異物的吞噬作用是其主要的防御機制。血細胞總數(shù)(THC)增加不僅僅包括血淋巴細胞的增殖，還包括從組織中遷徙到血淋巴循環(huán)中的細胞數(shù)量。相反地，貝類血淋巴細胞溶解或從血淋巴移入組織，將會導(dǎo)致THC降低，從而降低其防御能力，更容易受到病原菌的攻擊[34]。實驗表明，低氧脅迫24 h，雞簾蛤(Chameleagallina)的THC就開始急劇降低，并持續(xù)4 d左右[31]。缺氧條件下，翡翠貽貝(Pernaviridis)血淋巴中的THC顯著低于正常溶氧組[35]。THC的降低可能是貝類血淋巴細胞溶解以及大量血淋巴細胞移入組織所致，在這一點上與其他脅迫類似[34,36]。

3.1.2 缺氧對細胞吞噬作用的影響

貝類血淋巴細胞的吞噬作用是其抵御外來微生物的第一道防線，有時也是最重要的免疫手段[34,37-38]。實際上，除免疫功能外，血淋巴細胞的吞噬作用在神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)上也發(fā)揮重要作用[39]。因此，血淋巴細胞的吞噬活性通常被作為評估貝類對環(huán)境脅迫耐受力的生物指標[40-41]。

貝類血細胞的粘附能力是其發(fā)揮免疫功能的前提和基礎(chǔ)。細胞的粘附能力依賴于自身細胞膜和細胞骨架結(jié)構(gòu)的完整性[42]，在粘附分子與配體介導(dǎo)的細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的調(diào)控下，改變細胞形態(tài)而發(fā)生粘附[43]。由于此過程為耗能過程，依賴于細胞自身能量儲備，在低氧期細胞能量的重新分配使得用于粘附的能量大大降低，從而降低了血細胞的粘附能力。在粘附發(fā)生后，通過細胞骨架變化調(diào)控偽足形成的過程等是發(fā)生吞噬作用的基礎(chǔ)，此過程為耗能過程，需要聯(lián)合ATP的生成，但是在缺氧條件下不能獲得足夠的能量，因此吞噬活性大大降低[44]。利用血液涂片發(fā)現(xiàn)，受缺氧脅迫的雞簾蛤(Chameleagallina)的血淋巴細胞完全不能吞噬酵母細胞。缺氧導(dǎo)致血細胞吞噬活性的降低，除了與耗能關(guān)聯(lián)外，還可能與血淋巴細胞膜受體的改變相關(guān)[27]。

3.1.3 缺氧對活性氧的影響

活性氧(Reactive Oxygen Species，ROS)及其中間產(chǎn)物(Reactive Oxygen Intermediate Species，ROIs)是血淋巴細胞在吞噬過程中伴隨呼吸爆發(fā)現(xiàn)象產(chǎn)生的，是貝類免疫的重要組成部分[45]。貝類產(chǎn)生的ROS包括超氧化物陰離子、過氧化氫、羥基自由基、超鹵化物等。在受到病原菌感染時，貝類的血淋巴細胞會產(chǎn)生更多的ROS，過多的ROS會造成細胞的膜損傷，DNA斷裂，酶抑制和氨基酸過氧化等毒性效應(yīng)[46]。而在缺氧脅迫下，牡蠣血淋巴細胞產(chǎn)生ROS的能力大大降低，僅為正常情況的1/3[32]。從生存的角度考慮，是為了降低基礎(chǔ)代謝率犧牲了抗氧化酶的活性[47]，同時也可以減少ROS對自身組織的損傷以及修復(fù)所需的大量能量。

3.2 缺氧對體液免疫的影響

在缺氧脅迫下，貝類除了細胞免疫方式外，血淋巴中的體液因子也發(fā)揮重要的防御作用。參與體液免疫的活性因子主要包括：溶酶體酶、過氧化氫酶、抗菌肽等。

3.2.1 缺氧對溶酶體酶活性的影響

缺氧同樣可影響貝類溶酶體酶的活性。溶酶體酶由血淋巴細胞合成，并在吞噬過程中通過脫顆粒的方式釋放入血淋巴循環(huán)中，參與體液免疫[48]。雙殼貝類溶酶體酶包括溶菌酶、β-葡糖苷酸酶、酸性磷酸酶、堿性磷酸酶、脂肪酶、氨基肽酶、乳酸脫氫酶和淀粉酶等。其中，酸性磷酸酶和β-葡糖苷酸酶是后生動物典型的兩種溶酶體酶，而溶菌酶則具有免疫防御功能，可對抗多種革蘭氏陰性和陽性細菌[49]。研究發(fā)現(xiàn)，缺氧能夠?qū)е掠矚じ?Mercenariamercenaria)血細胞和血淋巴循環(huán)中溶菌酶、酸性磷酸酶等活性明顯降低[27,50]。但是，作為誘導(dǎo)型酶的β-葡糖苷酸酶在缺氧脅迫時活性增加，可能該酶參與了抑制缺氧狀態(tài)下厭氧細菌(硫酸還原菌等)的大量繁殖[4]。菲律賓蛤仔(Ruditapesphilippinarum)在受低氧脅迫時間越長的條件下，乳酸脫氫酶(LDH)和琥珀酸脫氫酶(SDH)的活力逐漸降低，而堿性磷酸酶(AKP)活力逐漸增大，不同的酶活在低氧條件下表現(xiàn)出不同的變化規(guī)律[51]。

3.2.2 缺氧對抗氧化防御系統(tǒng)的影響

抗氧化酶系統(tǒng)也是無脊椎動物非特異性免疫的重要組成部分。過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)等抗氧化酶類與抗氧化因子(如谷胱甘肽等)共同組成了抗氧化酶系統(tǒng)，共同作用于體內(nèi)氧化還原反應(yīng)產(chǎn)生的氧自由基，用于清除體內(nèi)多余的活性氧，以維持體內(nèi)氧化還原平衡。王化敏等[52]研究結(jié)果表明，隨著低氧脅迫時間的延長，4種殼色的菲律賓蛤仔(Ruditapesphilippinarum)的硫氧化還蛋白過氧化物酶(TPx)和銅鋅超氧化物歧化酶(Cu-ZnSOD)表達量均表現(xiàn)出先升高后恢復(fù)的趨勢，而CAT和錳超氧化物歧化酶(Mn-SOD)表達量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。紫貽貝(Mytilusgalloprovincialis)在2 mg·L-1的低氧環(huán)境下脅迫24 h后，肌肉組織的CAT、SOD基因表達量顯著降低[53]。這表明低氧會誘導(dǎo)貝類體內(nèi)抗氧化酶表達量發(fā)生變化，而抗氧化酶表達量的高低，能夠反映出動物對低氧耐受能力的差異[52]。

3.3 缺氧對化學(xué)遞質(zhì)的影響

缺氧脅迫幾乎影響到貝類細胞免疫和體液免疫的所有參數(shù)，但是確切的機制尚不明了。缺氧可能導(dǎo)致應(yīng)激反應(yīng)綜合征或全身適應(yīng)綜合征(General Adaptation Syndrome,GAS)，從而影響到血淋巴細胞的功能性反應(yīng)。貝類雖然僅具有簡單的神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)，但是面對環(huán)境脅迫，同樣會啟動類似脊椎動物的應(yīng)激反應(yīng)系統(tǒng)：即促腎上腺皮質(zhì)釋放激素(Corticotropin-releasing Hormone,CRH)—促腎上腺皮質(zhì)激素(Adrenocorticotropin Hormone,ACTH)—生物胺(Biogenic Amines)神經(jīng)內(nèi)分泌軸，分泌以兒茶酚胺類物質(zhì)為主的應(yīng)激激素(主要是去甲腎上腺素，腎上腺素和多巴胺)[39,54-55]。研究發(fā)現(xiàn)，去甲腎上腺素(Noradrenalin,NA)作為貝類中最重要的兒茶酚胺類，同樣是由血淋巴細胞合成并釋放入血淋巴中發(fā)揮作用[54]。NA能夠抑制雙殼貝類特定的免疫反應(yīng)，例如吞噬作用[56]和活性氧ROS的產(chǎn)生[57]。因此，缺氧狀態(tài)可能首先作用于神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)，通過誘導(dǎo)NA的釋放從而抑制血淋巴細胞的活性。這從側(cè)面也說明了，在低等的無脊椎動物中，仍然存在復(fù)雜的免疫系統(tǒng)和神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)之間的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)[58]。

3.4 缺氧對免疫相關(guān)基因表達的影響

在缺氧脅迫下，貝類部分基因的表達和蛋白的合成過程會受到抑制，例如呼吸作用、糖/脂類代謝、免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)過程[59]。但是，某些特定基因的表達量也會出現(xiàn)上調(diào)趨勢。在缺氧脅迫24 d后，牡蠣肝糖原磷酸化酶mRNA的表達量上調(diào)，目的就是通過以無氧糖酵解的方式降解肝糖原來維持機體對能量的需求[60-61]。其中，缺氧脅迫對活性氧產(chǎn)生相關(guān)基因以及維持機體氧化還原平衡基因表達的抑制效應(yīng)，與環(huán)境污染物(烴基化合物)[62]、感染寄生蟲[63]以及殺蟲劑[64]等環(huán)境脅迫的作用類似。

4 展望

綜上所述，缺氧脅迫對貝類免疫系統(tǒng)的影響深遠，影響貝類血淋巴細胞的所有免疫參數(shù)，并降低貝類的免疫監(jiān)視作用，引起貝類免疫應(yīng)激并造成免疫損傷。除此之外，缺氧條件(尤其是在靜水條件下)還會增加貝類機會性致病菌的繁殖，進一步降低水體的氧氣含量，例如厭氧的硫酸鹽還原菌能夠?qū)е滤虻乃嵝曰约傲蚧锏姆e累[65]。而水體pH值的改變會破壞貝類酸堿平衡，導(dǎo)致貝類更易感染病菌而大量死亡，破壞海洋生態(tài)系統(tǒng)的平衡。

除自然因素外，人為活動是造成水體缺氧的主要原因。近年來，由于經(jīng)濟的發(fā)展與市場需求，水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的集約化程度越來越高，規(guī)模越來越大，由此造成的水體富營養(yǎng)化使貝類因缺氧大量死亡，造成巨大的經(jīng)濟損失，制約了水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。因此應(yīng)當采取適當?shù)谋Ｗo措施，減小海洋缺氧區(qū)域面積，維護海洋生態(tài)健康，促進人與自然的和諧相處。除此之外，研究貝類在缺氧環(huán)境中的免疫應(yīng)答具有重要的實踐意義。相關(guān)的研究已有很多報道，但細胞免疫與體液免疫之間的協(xié)同關(guān)系以及不同細胞之間的協(xié)作機制尚不明確，與其他環(huán)境因子(如藻毒素、有機污染物等)共同對貝類造成影響的研究相對較少，貝類抗逆基因的篩選與抗逆、抗病品種的培育等都是這方面研究的新方向。