許慧瑤， 薛建云， 盧玉棟， 鄭文賀

（1. 福建師范大學(xué) 化學(xué)與材料學(xué)院，福建省先進材料化工基礎(chǔ)重點實驗室，福建 福州350117；2. 福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院，福建 福州350004）

地錦草（Euphorbiae humifusa）為雙子葉植物綱大戟目大戟科大戟屬地錦草科[1]，又有鋪地草、血見愁、乳汁草、地瓣草等40多個別名[2]，是一種療效顯著的中草藥，也是維吾爾族藥材和蒙藥材。地錦草生命力旺盛，在路邊庭院間隨處可見，除廣東、廣西外，分布遍及全國各地，來源廣泛，資源豐富[3]。地錦草主要含槲角素甙類、山奈素甙類以及其他黃酮類化合物[4]，具有涼血止血、清熱止痢、通乳汁、清熱解毒、利濕退黃等功效，藥理研究證實黃酮類化合物是地錦草抗菌、止血、抗氧化的主要有效成分，地錦草煎劑、醇提取液及地錦草素均有抗菌止血[5]的作用。地錦草在臨床中得到很大程度的應(yīng)用，多用于治療痢疾、外傷出血、乳汁不足、腸炎、咳血、便血、崩漏[6]等病癥。還可以將地錦草運用到功能性食品、化妝品和制藥行業(yè)[7]。

黃酮類化合物具有很強的抗氧化性、抗菌、抗病毒能力，可以清除體內(nèi)過剩的自由基，起到保護機體的作用，具有很好的免疫調(diào)節(jié)作用，而且對多種酶均有抑制作用[8]。

提取黃酮類化合物方法有溶劑法，比較常用的溶劑一般有水、甲醇、乙醇、乙醚、氯仿等[9-10]，提取方法有超聲輔助提法、生物酶方法、超臨界流體萃取法等[11-13]。

本文主要對地錦草的黃酮類化合物進行提取，并考察其抗氧化、抗菌、酶抑制等性能，為地錦草的應(yīng)用提供前期研究。

1 實驗

1.1 儀器與試劑

VIS-721可見光分光光度計（上海佑科儀器儀表），CARY 50紫外可見光度計（Varian公司），RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠），500 mL索氏提取器（臨沂正衡化玻儀器有限公司），細（霉）菌培養(yǎng)箱（福州科遠貿(mào)易有限公司），無菌操作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司）。

地錦草（安徽省亳州市潤邦食品有限公司），蘆丁、無水乙醇、無水甲醇、氫氧化鈉、抗壞血酸、雙氧水、碘、碘化鉀、可溶性淀粉、六水合硫酸亞鐵（國藥集團化學(xué)試劑有限公司，AR），亞硝酸鈉（天津市瑞金特化學(xué)品有限公司，AR），硝酸鋁（天津市紅巖化學(xué)試劑廠，AR），水楊酸（上海實驗試劑有限公司，AR），磷酸氫二鈉十二水合物、磷酸二氫鈉二水合物（上海展云化工有限公司，AR），α-淀粉酶（江蘇銳陽生物科技有限公司，AR），大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、青霉、曲霉（由福建師范大學(xué)生科院提供），所用水均為去離子水。

1.2 地錦草提取工藝

1.2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制[14]

準(zhǔn)去稱取2.5 mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，用50%甲醇定容至10 mL，得到濃度為250 μg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。然后分別取0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液于25 mL的容量瓶中，加入5%的亞硝酸鈉1 mL，搖勻，放置6 min；加10%硝酸鋁1 mL，搖勻，放置6 min；再加4%氫氧化鈉10 mL，加水定容至刻度，搖勻，放置10 min。在紫外可見分光光度計上于其最佳吸收波長510 nm處測其吸光度，并以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制濃度-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線。

地錦草提取物中總黃酮含量的計算公式如式（1）所示。

式中：Fc是地錦草中總黃酮含量，mg/g；c是樣品吸光度代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計算所得濃度，ug/mL；V是溶液試樣所需溶劑體積，mL；V1是吸取試樣溶液的體積，mL；V2是稀釋試樣溶液體積，mL；m-地錦草的質(zhì)量，g。

1.2.2 乙醇濃度對地錦草有效成分提取的影響

稱取地錦草10 g，分別加入20倍量75%、80%、85%、90%的乙醇溶液，90℃的水浴下，用索氏提取器回流提取3次，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將提取液進行濃縮，并計算濃縮液總黃酮的含量，最后烘干稱重。

1.2.3 料液比對地錦草有效成分提取的影響

稱取地錦草10 g，分別加入15、20、25倍量的90%的乙醇溶液，90℃的水浴下，用索氏提取器回流提取3次，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將提取液進行濃縮，并分別計算濃縮液總黃酮的含量，最后烘干稱重。

1.2.4 提取次數(shù)對地錦草有效成分提取的影響

稱取地錦草10 g，加入20倍量90%的乙醇溶液，90℃的水浴下，用索氏提取器分別回流提取1、2、3次，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀提取液進行濃縮，并分別計算濃縮液總黃酮的含量，最后烘干稱重。

1.3 抗氧化性能的測定[15-16]

1.3.1 空白組

向25 mL容量瓶依次加入2 mL濃度為0.2 mmol/L六水合硫酸鐵溶液，1.5 mL濃度為0.2 mmol/L水楊酸溶液，最后加入0.2 mL 體積分?jǐn)?shù)為0.3%的雙氧水，用水定容到25 mL，搖勻，用721可見光分光光度計在波長510 nm下測定吸光值A(chǔ)0，平行測定3組，取其平均值。

1.3.2 樣品組

取5個25 mL容量瓶，向每個容量瓶中加入2 mL濃度為0.2 mmol/L六水合硫酸鐵溶液，1.5 mL濃度為0.2 mmol/L水楊酸溶液，0.2 mL體積分?jǐn)?shù)為 0.3%的雙氧水，反應(yīng)5 min后，向容量瓶中依次加入0.04 g/L的地錦草提取物1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL，用水定容到25 mL，搖勻，反應(yīng)5 min，用721可見光分光光度計在波長510 nm下測定吸光值A(chǔ)X，平行測定3組取其平均值。

1.3.3 對照組

用0.2 mL的蒸餾水替代雙氧水，用721可見光分光光度計在波長510 nm下測定吸光值A(chǔ)X0，平行測定3組，取其平均值。

地錦草提取物對羥自由基的清除率按式（2）計算。

式中：A0是空白組樣品的吸光值，AX是樣品的吸光值，AX0是對照組樣品的吸光值。

1.4 地錦草提取物抗菌實驗[17]

采用紙片瓊脂擴散法對地錦草提取物抑制大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、青霉、曲霉進行試驗，每種菌實驗重復(fù)3次，抑菌效果取3次實驗平均值。

1.5 地錦草提取物對α-淀粉酶活性的抑制試驗[18]

1.5.1 地錦草提取物的濃度對α-淀粉酶活性的影響

取20 μL α-淀粉酶（由pH 6.8的磷酸緩沖溶液配制），加入20 μL不同濃度的地錦草提取物，于37℃的酶標(biāo)儀中振蕩數(shù)下，并恒溫10 min后，加入0.4 g/L 140 μL淀粉溶液（稱取0.4 g淀粉溶于pH 6.8磷酸緩沖溶液中并煮沸，冷卻后定容至100 mL容量瓶，使用時稀釋10倍），在酶標(biāo)儀中振蕩數(shù)下，且反應(yīng)2 min后，迅速滴加30 μL 0.01%碘液[19]，振蕩，在波長為660 nm下測定波長A0。平行測定三組，取其平均值，若實驗數(shù)據(jù)波動比較大，則在舍去原有數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上進行補測，直至數(shù)據(jù)趨于比較穩(wěn)定為止。設(shè)置空白組，用等體積pH6.8磷酸鹽緩沖溶液代替地錦草提取物，于660 nm測定波長A，地錦草對α-淀粉酶的抑制率按式（3）計算。

式中：A0是樣品在660 nm激發(fā)波長下測定的樣品波長，A是空白樣品在660 nm激發(fā)波長下測定的樣品波長。

1.5.2 地錦草提取物的溫度對α-淀粉酶活性的影響

將25 mL濃度為0.001 6 g/mL的地錦草提取物分別置于40℃、50℃、60℃、70℃、80℃的恒溫水浴中，保溫30 min。冷卻至室溫后，按“1.5.1”的步驟測定對α-淀粉酶活性，并計算其抑制率。

1.5.3 地錦草提取物的pH值對α-淀粉酶活性的影響

分別用pH值為 4.5、5.7、6.8、7.5的緩沖溶液配制相同濃度的地錦草提取物后，按“1.5.1”的步驟測定對α-淀粉酶活性，并計算其抑制率。

2 結(jié)果與討論

2.1 地錦草提取工藝

2.1.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)來繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并對曲線進行擬合得到的線性回歸方程為：Y＝0.005 83 X＋0.042 5，其中R2＝0.998 7，這說明在蘆丁在0～50 μg/mL具有良好的線性關(guān)系，符合定量所需，其工作曲線如圖1所示。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的工作曲線

圖2 乙醇濃度對地錦草提取效果的影響

2.1.2 乙醇濃度對地錦草提取效果的影響

采用不同濃度的乙醇溶液對地錦草進行提取，地錦草提取物中總黃酮含量與乙醇濃度的關(guān)系如圖2所示。由圖2可知，當(dāng)乙醇濃度在75%～85%之間，總黃酮含量是隨著濃度的增大而升高，在濃度為85%之后，隨濃度的增大而下降。這是由于隨著乙醇濃度的增加，溶液中的總黃酮含量也隨之升高，然而當(dāng)濃度過大時，溶液極性變小，會使得地錦草中的其他成分也隨之進入到溶液中，所以總黃酮含量變小。因此在一定濃度范圍內(nèi)，乙醇濃度的增加與地錦草中總黃酮含量呈現(xiàn)正相關(guān)的計量關(guān)系。本實驗測得的地錦草提取的最佳提純濃度為85%。

2.1.3 提取次數(shù)對地錦草提取效果的影響

對地錦草進行不同次數(shù)的提取，考察地錦草提取物中總黃酮含量與提取次數(shù)的關(guān)系，結(jié)果如表1所示。

由表1可知，隨著提取次數(shù)的增加，溶液中總黃酮含量也隨之增加。從1次增加到2次的總黃酮含量增長的趨勢明顯大于從2次增加到3次。這是由于隨著提取次數(shù)的增加，地錦草中的黃酮逐漸進入乙醇溶液中，提取次數(shù)越多，進入溶液中的黃酮便越多，但是隨著回流次數(shù)的增加，能耗、時間都逐步增加，綜合考慮之下回流提取3次最佳。

表1 提取次在數(shù)對地錦草提取效果的影響

2.1.4 料液比對地錦草提取效果的影響

采用體積分?jǐn)?shù)為85%的乙醇對地錦草進行提取，考察料液比對地錦中黃酮提取的影響，其結(jié)果如圖3。

由圖3可知，隨著料液比得到增加，溶液中總黃酮含量隨之呈現(xiàn)下降趨勢。這是由于在其他條件都不變的情況下，隨著料液比的增加，只是增加了溶劑的量，但是地錦草中總黃酮的含量是固定的，提取必定存在極限，繼續(xù)增大料液比反而使得濃縮過程不能夠徹底進行。從圖3可以看出，在料液比為1∶15時，溶液中總黃酮含量最高，因此本實驗測得的最佳料液比為1∶15。

圖3 料液比對地錦草中黃酮提取的影響

圖4 地錦草提取物濃度對羥自由基清除效果的影響

2.2 地錦草提取物濃度對羥自由基清除效果的影響

采用不同濃度的地錦草提取物對羥自由基進行清除實驗，地錦草提取物濃度對羥自由基的清除關(guān)系如圖4所示。

由圖4可知，隨著地錦草提取物濃度的增加，對羥自由基清除率的也隨之增大，當(dāng)濃度達到8.0 mg/mL時，其清除率達到82.04%。說明濃度越大，對羥自由基的清除效果越好，這是由于相同數(shù)量的羥自由基，濃度大的提取物對其清除速度快，清除效率高。

2.3 地錦草抗菌性能的測定

為了考察地錦草提取物的抗菌性能，采用紙片瓊脂擴散法進行抗菌實驗，實驗結(jié)果如表2所示。

表2 地錦草提取物抗菌性能

由表2可知地錦草對青霉、曲霉均有抑菌效果，且青霉的抑菌圈達到19.52 mm，曲霉的抑菌圈達到18 .29 mm，但是對大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的抗菌效果幾乎為0，并沒有明顯的抑菌圈出現(xiàn)。

2.4 地錦草提取物對α-淀粉酶抑制作用

2.4.1 地錦草提取物濃度對α-淀粉酶活性的影響

參照“1.5.1”的實驗方法來探究地錦草提取物的濃度對α-淀粉酶活性的影響，其結(jié)果如圖5所示。

由圖5可知，隨著地錦草提取物濃度的增大，對α-淀粉酶的抑制率先隨著增大，當(dāng)達到一定數(shù)值后，隨著地錦草提取物濃度的增大而減小。當(dāng)?shù)劐\草提取物濃度在1.6～4.8 mg/L之間，抑制率隨著濃度的增大而升高，當(dāng)濃度超過4.8 mg/L之后，隨濃度的增大而下降。因此，4.8 mg/L為抑制作用最強的濃度。在一定濃度范圍內(nèi)，隨著地錦草提取物的增加，其對α-淀粉酶的抑制作用呈現(xiàn)正相關(guān)的計量關(guān)系。

圖5 不同濃度地錦草提取物對α-淀粉酶的抑制率

圖6 不同溫度的地錦草提取物對α-淀粉酶的抑制率

2.4.2 地錦草提取物的溫度對α-淀粉酶活性的影響

通過單因素實驗來探究不同溫度下的地錦草提取物對α-淀粉酶活性的影響，其結(jié)果如圖6所示。

由圖6可知，隨著溫度的升高，地錦草提取物對α-淀粉酶活性抑制率基本上處于先上升后下降的趨勢。在70℃時，地錦草提取物對α-淀粉酶活性抑制率最高，達到了50%左右。

2.4.3 地錦草提取物的pH值對α-淀粉酶活性的影響

為了探究不同pH值的地錦草提取物對α-淀粉酶活性的影響，通過控制單一變量，采用不同pH值的地錦草提取物實驗，得到如表3的實驗數(shù)據(jù)。由表3可知，隨著pH的增加，抑制率先增加，當(dāng)達到一定數(shù)值后，隨著pH的增大呈現(xiàn)下降的趨勢。而在pH 6.8時抑制率最大，這符合人體內(nèi)的正常pH耐受值。

表3 不同pH的地錦草提取物對α-淀粉酶的抑制率

3 結(jié)論

通過單因素實驗得出地錦草總黃酮的最佳提取工藝為：提取溫度為90℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)為85%，料液比為1∶15，提取次數(shù)為3次。

地錦草提取物對羥基自由基具有一定的清除能力，且在濃度為8 mg/mL是清除率達到最大，為82.04%。地錦草提取物對青霉和曲霉具有一定的抗菌能力，抗菌效果比較顯著，抑菌圈達到19.52 mm、18.29 mm，而對大腸桿菌和枯草芽孢桿菌沒有明顯的抗菌效果。

地錦草提取物對α-淀粉酶具有一定的抑制作用，最佳抑制條件為：濃度為4.8 mg/mL，pH值為6.8，溫度為70℃，此時地錦草提取物對α-淀粉酶活性的抑制率達45.13%。