徐尉力，付 壯，王 旭，趙 悅，王晨兆，馬佳駿，王志兵*

（長春工業(yè)大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，吉林 長春 130012）

苯脲類除草劑是一類核心結(jié)構(gòu)為脲的化學(xué)性除草劑，廣泛應(yīng)用于寬葉雜草和一年生雜草的控制，其作用機(jī)理為抑制光合作用中的希爾反應(yīng)從而抑制葉綠體的活性[1-4]，但其在自然環(huán)境中降解周期較長，易殘存于環(huán)境水、土壤和蔬菜、水果中，從而被動(dòng)植物吸收，繼而影響人體健康[3,5-10]。已有文獻(xiàn)報(bào)道滅草隆和利谷隆對(duì)人體有潛在的致癌可能，而其他苯脲除草劑也大多具有生態(tài)毒性或遺傳毒性[11]。因而，建立一種食品中苯脲類除草劑殘留的檢測方法顯得尤為重要。

食品中農(nóng)藥殘留常見的樣品前處理方法有基質(zhì)固相分散法[2,12-13]、固相微萃取法[3,9,13]、固相萃取法[5,10,14-15]和液液萃取法[16-17]。離子液體均相液液微萃取在液液萃取的基礎(chǔ)上發(fā)展而來，是樣品制備和預(yù)濃縮的重要方法之一，其通過原位反應(yīng)改變離子液體的水溶性實(shí)現(xiàn)溶劑與樣品溶液的分離，具有操作簡便、試劑用量少、萃取時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)，但在相分離時(shí)由于離子液體具有較大的黏度，常造成一定的損失。

目前，苯脲類農(nóng)殘的檢測方法主要有氣相色譜法[10,18-19]、毛細(xì)管電泳法[2,15]、酶聯(lián)免疫法[20]、高效液相色譜法和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[21]。其中高效液相色譜法已被廣泛用于苯脲類化合物的分析。但由于蔬菜中水溶性成分較多，基質(zhì)干擾復(fù)雜，且農(nóng)藥殘留水平較低。因此，選擇一種合適的樣品前處理方法至關(guān)重要。

沉積固化離子液體作為一種“綠色”溶劑，具有良好的熱穩(wěn)定性、溶解性以及相對(duì)較高的密度和較低的熔點(diǎn)[22-27]。通過控制溫度，可以改變離子液體的存在狀態(tài)，有效解決離子液體在室溫下與水相分離困難的問題。

因此，本研究以沉積固化型離子液體為萃取劑，以溫控超聲為輔助手段，建立基于原位反應(yīng)的均相液液微萃取-高效液相色譜法，用于蔬菜中苯脲類除草劑的分析檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

5 種蔬菜樣品西紅柿、馬鈴薯、甘藍(lán)、胡蘿卜、黃瓜（樣品1～5），全部購買于當(dāng)?shù)剞r(nóng)貿(mào)市場。

滅草隆、綠麥隆、異丙隆、敵草隆、綠谷隆標(biāo)準(zhǔn)品（純度均大于99%，結(jié)構(gòu)見圖1） 中國阿拉丁試劑公司；三丁基辛基溴化膦（[P4448]Br）由實(shí)驗(yàn)室自制；六氟磷酸銨（NH4PF6） 上海成捷化學(xué)有限公司；乙腈、甲醇（均為色譜純） 成都市科隆化學(xué)品有限公司；其他試劑均為分析純 北京化工廠。

圖1 目標(biāo)分析物的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig. 1 Chemical structures of phenylurea pesticides

1.2 儀器與設(shè)備

1100型高效液相色譜儀（配有自動(dòng)進(jìn)樣器、四元泵、柱溫箱、脫氣機(jī)和二極管陣列檢測器） 美國Agilent公司；AcclaimTM120-C18色譜柱（4.6 mmh250 mm，5 μm） 美國Thermo Fisher Scientific公司；KQ-100DE超聲波清洗器 江蘇昆山市超聲儀器有限公司；AG 5428型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 德國Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別準(zhǔn)確稱取5 mg苯脲標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL容量瓶中，用乙腈定容，配制成質(zhì)量濃度為500 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于4 ℃冰箱中避光保存，備用。實(shí)驗(yàn)所用其他工作溶液均由各標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液經(jīng)乙腈稀釋得到。

1.3.2 [P4448]Br的制備

向500 mL三口燒瓶中準(zhǔn)確加入50 g三丁基膦、200 mL甲苯和53 g溴辛烷，110 ℃保溫24 h。反應(yīng)完畢后，取下層，用50 mL無水乙醚洗滌，重復(fù)洗滌6 次，將得到的純凈溶液于真空干燥烘箱中真空干燥12 h，即得到[P4448]Br。

1.3.3 樣品溶液制備

將一定量的新鮮蔬菜樣品用水沖洗后瀝干，切塊后組織搗碎，準(zhǔn)確稱取2 g于離心管中，加入8 mL超純水，渦旋2 min后7 000 r/min離心15 min，所得上清液即為樣品溶液，除實(shí)際樣品分析外，其余實(shí)驗(yàn)結(jié)果均由樣品1（西紅柿）獲得。

1.3.4 沉積固化離子液體均相液液微萃取

將1.3.3節(jié)樣品溶液和0.048 g [P4448]Br加入到10 mL離心管中，于40 ℃水浴中保溫15 min，隨后向離心管中加入0.24 g NaCl，待NaCl溶解后再加入135 μL 1.08 mol/L NH4PF6溶液（離子對(duì)試劑），此時(shí)離子液體與離子對(duì)試劑發(fā)生原位復(fù)分解反應(yīng)產(chǎn)生白色的乳濁液。將離心管在120 W條件下超聲提取5 min，于5 000 r/min離心5 min，則富集有目標(biāo)分析物的離子液體沉積于離心管底部。經(jīng)冰浴后，離子液體則完全沉積凝固，倒出上層清液，離子液體部分用300 μL乙腈溶解稀釋，過0.22 μm濾膜，進(jìn)行色譜分析。萃取流程見圖2。

圖2 沉積固化離子液體均相液液微萃取流程圖Fig. 2 Schematic procedure of homogeneous liquid-liquid microextraction based on solidification of sedimentary ionic liquids

1.3.5 色譜條件

流動(dòng)相由水（A）和乙腈（B）組成，洗脫梯度為0 min，45% B；0～3 min，45%～53% B；3～15 min，53% B；15～25 min，53%～45% B；25 min，45% B；27 min，45% B。流動(dòng)相流速0.5 mL/min；進(jìn)樣體積20 μL；色譜柱溫度30 ℃；檢測波長245 nm。

1.3.6 萃取條件優(yōu)化

表1 Box-Behnken試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels used in Box-Behnken design

對(duì)影響萃取效率的各個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化，并在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)影響目標(biāo)物萃取效率較為顯著的離子液體用量、離子液體與NH4PF6物質(zhì)的量比和超聲功率進(jìn)行優(yōu)化，以苯脲類化合物色譜峰面積為響應(yīng)值，通過Design-Expert 8.0.6軟件設(shè)計(jì)3因素3水平Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)，如表1所示。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)優(yōu)化萃取條件

2.1.1 離子液體用量

圖3 離子液體用量（a）、離子液體與NH4PF6物質(zhì)的量比（b）、超聲功率（c）、超聲時(shí)間（d）、離子強(qiáng)度（e）和萃取介質(zhì)pH值（f）對(duì)苯脲峰面積的影響Fig. 3 Effects of amount of ionic liquid (a), molar ratio of IL to NH4PF6 (b), ultrasonic power (c), ultrasonic time (d), NaCl (e) and pH (f)on peak areas of phenylureas

[P4448]Br是一種在室溫下呈固態(tài)的水溶性高密度離子液體，當(dāng)溫度升高時(shí)，[P4448]Br逐漸溶于水中與離子對(duì)試劑NH4PF6發(fā)生原位反應(yīng)，生成疏水性離子液體[P4448]PF6，并與目標(biāo)分析物通過疏水、π-π堆積、靜電等相互作用結(jié)合在一起；當(dāng)降低溫度時(shí)，新形成的[P4448]PF6發(fā)生凝固現(xiàn)象，與水相發(fā)生分離。因此，作為一種綠色萃取溶劑，[P4448]Br的用量對(duì)目標(biāo)化合物的萃取效率具有重要影響。如圖3a所示，隨著離子液體用量增加，峰面積逐漸升高，當(dāng)離子液體用量達(dá)到0.04 g時(shí)，峰面積達(dá)到最大值并趨于穩(wěn)定。當(dāng)離子液體用量過高時(shí)，影響后期的溶解、提取過程，降低實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性和穩(wěn)定性。因此，本實(shí)驗(yàn)中選用0.04 g [P4448]Br作為萃取溶劑。

2.1.2 離子液體與NH4PF6物質(zhì)的量比

[P4448]Br屬于親水性離子液體，在一定溫度下可以與水混溶。當(dāng)加入NH4PF6后，PF6-結(jié)合離子液體中的有機(jī)陽離子，發(fā)生原位復(fù)分解反應(yīng)[P4448]Br+KPF6=[P4448]PF6+KBr，形成疏水性離子液體[P4448]PF6，富集目標(biāo)分析物，并在低溫下沉積凝固，與水相分離。因此，本研究考察離子液體與NH4PF6物質(zhì)的量比對(duì)提取效率的影響。由圖3b可以看出，隨著NH4PF6物質(zhì)的量的增加，峰面積逐漸增加，當(dāng)物質(zhì)的量比達(dá)到1∶1時(shí)，離子液體與NH4PF6反應(yīng)完全，提取效果相對(duì)較好。所以，本實(shí)驗(yàn)選擇離子液體與NH4PF6物質(zhì)的量比為1∶1。

2.1.3 超聲功率和超聲時(shí)間

如圖3c、d所示，在超聲功率120 W、超聲時(shí)間5 min時(shí)，峰面積達(dá)到最高值，但隨著超聲功率的增加和超聲時(shí)間的延長，提取效率逐漸降低。結(jié)果表明，適當(dāng)?shù)某曁幚碛欣谳腿⌒实奶岣撸驗(yàn)槌曈兄诩铀匐x子液體和目標(biāo)分析物的分散，增加兩者的接觸頻率。然而，過高的功率和時(shí)間卻不利于提取過程，這可能是因?yàn)檫^度的超聲處理使體系熱能增加，一方面，使少量[P4448]PF6溶解于水中；另一方面，使離子液體與目標(biāo)分析物的相互作用力減弱，從而使提取回收率降低。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇超聲功率120 W、超聲時(shí)間5 min。

2.1.4 離子強(qiáng)度

NaCl用于調(diào)節(jié)樣品溶液的離子強(qiáng)度，考察樣液中NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)（0%～5%）對(duì)提取效率的影響，如圖3e所示。結(jié)果表明，在NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%～4%時(shí)，目標(biāo)化合物的提取效果最佳，但隨著NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，離子強(qiáng)度增強(qiáng)，黏度增大，鹽析現(xiàn)象加重，離子液體存在粘壁現(xiàn)象，不利于乙腈溶解稀釋。綜合考慮，本實(shí)驗(yàn)選擇樣液中NaCl的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%。

2.1.5 溶液介質(zhì)pH值

溶液介質(zhì)超純水的pH值影響目標(biāo)物的解離狀態(tài)和穩(wěn)定性，進(jìn)而影響萃取效率。如圖3f所示，隨溶液pH值不斷升高，目標(biāo)物回收率逐漸增加，當(dāng)pH 6時(shí)，峰面積達(dá)到最大值。當(dāng)pH值繼續(xù)升高時(shí)，除敵草隆和綠麥隆的峰面積基本不變外，其余目標(biāo)物的峰面積略有下降。因此，本研究選擇溶液介質(zhì)pH 6進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化萃取條件

2.2.1 回歸模型建立及方差分析

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Experimental results of Box-Behnken design

根據(jù)響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果（表2），對(duì)各目標(biāo)物進(jìn)行多元二次回歸擬合分析，確定自變量離子液體用量（X1）、超聲功率（X2）、離子液體與NH4PF6物質(zhì)的量比（X3）與因變量峰面積的回歸方程為：

方程式各項(xiàng)系數(shù)如表3所示，可以看出各目標(biāo)物的回歸模型具有顯著性（P≤0.000 3），且失擬項(xiàng)均不顯著（P值為0.088 4～0.455 2），校正相關(guān)系數(shù)R2大于0.91，說明該模型可以很好地?cái)M合現(xiàn)實(shí)實(shí)驗(yàn)規(guī)律，對(duì)結(jié)果具有準(zhǔn)確的預(yù)判性。因此，該模型可以用于苯脲類化合物提取方法的優(yōu)化和預(yù)測。

表3 回歸方程參數(shù)Table 3 Parameters of regression equations

2.2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

圖4 響應(yīng)面及等高線分析各因素相互作用對(duì)苯脲峰面積的影響Fig. 4 Response surface and contour plots showing the interactive effects of extraction conditions on peak areas of phenylureas

以敵草隆的多元二次回歸模型為例，進(jìn)行響應(yīng)面分析，可以很好地觀察出各因素之間相互作用對(duì)目標(biāo)物峰面積的影響，如圖4所示。

圖4b中兩因素等高線的疏密程度大致相等，說明離子液體用量和離子液體與NH4PF6物質(zhì)的量比相互影響較弱，但兩者坡度變化較陡，因而對(duì)峰面積影響較大，是影響目標(biāo)物峰面積的主要因素。通過比較圖4a和圖4c可以看出相對(duì)于上述兩個(gè)條件，超聲時(shí)間對(duì)目標(biāo)化合物提取效率的影響最弱。同時(shí)由方差分析可得離子液體用量、超聲時(shí)間、離子液體與NH4PF6物質(zhì)的量比的F值分別為98.24、28.78、109.29，即各因素對(duì)敵草隆峰面積影響的強(qiáng)弱順序?yàn)殡x子液體與NH4PF6物質(zhì)的量比＞離子液體用量＞超聲時(shí)間，這與單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面分析結(jié)果一致。

2.2.3 最優(yōu)條件確定及回歸模型驗(yàn)證

基于Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果，綜合考慮實(shí)驗(yàn)科學(xué)性和可操作性，苯脲類化合物最佳萃取條件為離子液體用量0.048 g、超聲功率120 W、離子液體與NH4PF6物質(zhì)的量比1∶1.18，在此條件下進(jìn)行6 次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，敵草隆峰面積平均值為87.42。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，5 種化合物的二次多元回歸方程可以很好地?cái)M合實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有一定的預(yù)測性。

2.3 方法學(xué)評(píng)價(jià)

2.3.1 線性關(guān)系、定量限和方法檢出限

以加標(biāo)質(zhì)量濃度（c）為橫坐標(biāo)，以峰面積（A）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，得到線性回歸方程以及相關(guān)系數(shù)。在最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下，按照1.3.3、1.3.4節(jié)實(shí)驗(yàn)步驟，對(duì)11 組低質(zhì)量濃度的空白加標(biāo)樣品進(jìn)行分析，用所得的結(jié)果計(jì)算方法檢出限和定量限。如表4所示，該實(shí)驗(yàn)方法具有良好的線性關(guān)系（r≥0.998 1），其檢出限和定量限分別為2.1 9～5.3 5 μg/k g和7.30～17.82 μg/kg。

表4 線性關(guān)系、檢出限和定量限（n=3）Table 4 Linear regressions, limits of detection and limits of quantitation for the analytes (n= 3)

2.3.2 精密度

通過分析加標(biāo)量為25、100 μg/kg的兩組樣品的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD），可以確定該方法的精密度。日內(nèi)精密度是1 d內(nèi)對(duì)同一樣品連續(xù)分析6 次測得回收率的RSD，日間精密度是每天分析2 次、連續(xù)分析3 d所測得回收率的RSD。如表5所示，該方法的日內(nèi)和日間精密度分別為2.13%～7.66%和2.46%～8.88%，說明該實(shí)驗(yàn)方法具有良好的精密度。

表5 日內(nèi)和日間精密度（n=6）Table 5 Intra-day and inter-day precisions for the analytes (n= 6)

2.3.3 回收率

為考察僅用純水渦旋提取時(shí)，苯脲類農(nóng)藥是否能完全轉(zhuǎn)移到樣品溶液中，本研究按照1.3.2節(jié)步驟處理樣品，對(duì)所得樣品溶液進(jìn)行色譜分析。結(jié)果表明，滅草隆、綠麥隆、異丙隆、敵草隆和綠麥隆的轉(zhuǎn)移率分別為72.25%、85.30%、93.31%、84.82%和89.94%，說明當(dāng)用純水渦旋提取時(shí)，除滅草隆外，其余4 種苯脲類農(nóng)藥超過84%均能轉(zhuǎn)移到樣品溶液中，這與文獻(xiàn)[28]報(bào)道一致。

為考察本法的準(zhǔn)確度，本研究分析5 種蔬菜樣品。如表6所示，蔬菜中各種目標(biāo)分析物的加標(biāo)回收率在82.84%～117.49%之間，其RSD為0.18%～9.93%。實(shí)驗(yàn)證明該法準(zhǔn)確度較高，結(jié)果令人滿意。

表6 西紅柿、甘藍(lán)、胡蘿卜、馬鈴薯、西蘭花樣品中苯脲類農(nóng)藥殘留測定Table 6 Analysis of phenylurea residues in tomato, cabbage, carrot,potato, and broccoli samples

2.4 實(shí)際樣品分析結(jié)果

為考察本法的適用性，本研究對(duì)西紅柿、甘藍(lán)、胡蘿卜、馬鈴薯、西蘭花5 種樣品進(jìn)行分析檢測，結(jié)果表明，各種樣品中均未檢測到苯脲類農(nóng)藥殘留，色譜圖如圖5所示。

圖5 標(biāo)準(zhǔn)溶液（A）、加標(biāo)樣品（B）和空白樣品（C）色譜圖Fig. 5 Chromatograms of standard solution (A), spiked sample (B) and blank sample (C)

2.5 方法比較

本法使用離子液體代替?zhèn)鹘y(tǒng)有溶劑作萃取劑，既減少了萃取溶劑的用量，也減輕對(duì)實(shí)驗(yàn)人員身體的影響。將沉積固化離子液體均相液液微萃取與高效液相色譜相結(jié)合，通過控制溫度實(shí)現(xiàn)萃取溶劑和樣品溶液的快速分離，使提取過程變得更加快捷、高效，同時(shí)使目標(biāo)化合物的檢出限更低，方法具有更高的靈敏度（表7）。因此，相對(duì)于其他方法，本法在萃取溶劑的安全性、操作的簡便性以及高效性方面具有一定的優(yōu)勢。

表7 方法比較Table 7 Comparison between the proposed method and other methods

3 結(jié) 論

本方法在超聲輔助條件下將沉積固化離子液體與均相液液微萃取相結(jié)合用于食品中苯脲類化合物的提取，并通過高效液相色譜-二極管陣列檢測器對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行分析。該方法在液液微萃取的基礎(chǔ)上，用水溶性、高密度、低溫固化型離子液體代替?zhèn)鹘y(tǒng)有機(jī)溶劑作為萃取劑，既減少了萃取溶劑的使用量，也避免了旋蒸、回溶等實(shí)驗(yàn)步驟。具有萃取溶劑用量少，萃取時(shí)間短，實(shí)驗(yàn)操作簡單、方便等優(yōu)點(diǎn)，可用于食品中苯脲類農(nóng)藥殘留的分析檢測。