陳 麗，坤吉瑞，王 靜，童華榮*

（西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715）

茶葉中的類胡蘿卜素占干質(zhì)量的0.032%～0.125%[1]，不但可以作為色素影響干茶和葉底的色澤，還可在光合作用中起到光保護作用[2]，同時還參與茶葉香氣的形成，對茶葉品質(zhì)具有重要貢獻。類胡蘿卜素作為香氣前體降解產(chǎn)生的β-大馬烯酮、β-紫羅蘭酮、香葉醇、橙花叔醇、α-法呢烯等香氣物質(zhì)占成品茶香氣總量的4.3%～46.5%[3]，是茶葉香氣的重要組成部分。

目前分離檢測類胡蘿卜素的方法有柱色譜-分光光度法[4]、薄層色譜掃描定量法[5]及高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）法[6]。分光光度法定量不夠精確，薄層色譜法用混合溶劑作展開劑，經(jīng)單波長掃描定量，較前者有所改善，但檢測效率有待提高[7]。HPLC目前在茶葉中類胡蘿卜素的分析檢測中最為常用，但國內(nèi)用于檢測茶葉中類胡蘿卜素的方法大多存在提取程序繁瑣、檢測到的類胡蘿卜素種類少等問題[8-9]。Zapata等[10]建立的以C8反相色譜柱為基礎(chǔ)，并通過在流動相中添加吡啶作為修飾劑改善峰形的二元梯度方法被認為是目前分離效果最好、最有前途的一個色素分析方法。鄧春梅等[11]對該方法的有效性進行了驗證，國際上對于其應(yīng)用日益增多[12-13]，但在國內(nèi)的茶學(xué)領(lǐng)域未得到應(yīng)用。

茶葉中類胡蘿卜素的種類和含量受茶葉成熟度、季節(jié)、加工工藝及茶樹品種等因素的影響。隨著茶樹葉片成熟度的增高類胡蘿卜素總量增高，而葉黃素與胡蘿卜素的比值卻有所下降[1,8]；在不同季節(jié)，茶葉中的類胡蘿卜素表現(xiàn)為夏季最高，春季最低，秋季介于二者之間[14]；茶葉加工過程中類胡蘿卜素的含量減少，一般情況下，烏龍茶因用成熟芽葉為原料，類胡蘿卜素含量最高，紅茶發(fā)酵引起類胡蘿卜素降解95%左右，含量最少，綠茶介于二者之間，較鮮葉減少80%以上[15]；有研究分析中國西南、江南、華南3 個產(chǎn)區(qū)的31 個茶樹品種的7 種類胡蘿卜，總量在324.8～528.8 μg/g之間，且遺傳因素對類胡蘿卜素的影響相對于栽培環(huán)境更大[9]。目前鮮見有關(guān)不同適制性茶樹品種中類胡蘿卜素的研究。

本實驗運用Zapata等[10]分析脂溶性色素的方法，分析37 個不同適制性茶樹品種的類胡蘿卜素，旨在闡明不同適制性茶樹品種中類胡蘿卜素的分布規(guī)律，為茶葉香氣的形成機理研究及茶葉加工中的品種選擇提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

37 個不同適制性茶樹品種的一芽二葉均采于2017年秋季，其中僅適制綠茶的品種有15 種：巴渝特早（重慶南川）；中茶102、鄂茶1號、芙蓉6號（湖北恩施）；水晶茶、中白1號（四川宜賓）；碧香早、渝茶1號、渝茶2號、渝茶3號、南江1號、龍井長葉、烏牛早、中選10號、紫筍（重慶永川）。僅適制紅茶的品種有5 種：蜀永703、蜀永1號、蜀永2號、臺灣大葉（重慶永川）；云南大葉（重慶南川）。僅適制烏龍茶的品種有5 種：金萱、金匙（重慶永川）；九龍袍、紫牡丹、308（四川宜賓）。具有兼制性的品種有12 種：金牡丹（綠茶、烏龍茶，四川宜賓）；春蘭、梅占（綠茶、紅茶、烏龍茶，四川宜賓）；蜀永307、菊花春、勁峰、褚葉齊、福豐20號、浙農(nóng)117、崇批71-1（綠茶、紅茶，重慶永川）；大樹茶（綠茶、紅茶，重慶南川）；福鼎大白（綠茶、紅茶、白茶，重慶南川）[16-17]。鮮葉采下后立即放入液氮中處理，干冰低溫保護下運輸，冷凍干燥固樣，磨碎后過40 目篩，-40 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

黃體素、玉米黃素、β-胡蘿卜素（均為標(biāo)準(zhǔn)品）上海源葉生物科技有限公司；丙酮、甲醇、乙腈、冰乙酸（均為HPLC級） 成都市科龍化工試劑廠；無水吡啶（HPLC級） 美國Aladdin公司。

1.2 儀器與設(shè)備

雷磁PHS-25 pH計 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；5810R離心機 美國Eppendorf公司；M20A HPLC儀日本Shimadzu公司。

1.3 方法

1.3.1 類胡蘿卜素的提取與HPLC分析條件

參考Zapata等[10]的方法。

1.3.2 類胡蘿卜素的定性定量

類胡蘿卜素分子結(jié)構(gòu)中所具有的發(fā)色團使其在紫外-可見光區(qū)有著獨特的吸收區(qū)。目前，許多類胡蘿卜素的紫外-可見吸收光譜特征已被確定，如最特征吸收波長等。因此，利用類胡蘿卜素在紫外-可見光區(qū)的吸收光譜可對其進行定性分析[18-19l。本實驗根據(jù)參考文獻[10]中類胡蘿卜素的特征吸收波長，結(jié)合Suzuki[20]、鄧春梅[11]等的保留時間確定各類胡蘿卜素的組分。

類胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品價格昂貴且多數(shù)標(biāo)準(zhǔn)品在市場上沒有銷售，所以本實驗僅使用3 個標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線進行定量。除玉米黃素和β-類胡蘿卜素根據(jù)各自的標(biāo)準(zhǔn)品定量外，其余各組分最大吸收波長與黃體素最為接近，均根據(jù)黃體素的標(biāo)準(zhǔn)曲線定量。各組分430 nm波長處均有一定強度的吸收峰，因此采用此波長條件下吸收峰的面積進行定量計算。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：精確稱取黃體素20.000 mg，玉米黃素25.000 mg，β-類胡蘿卜素25.000 mg，分別加10 mL二氯甲烷溶解，再加純的冰丙酮將黃體素稀釋成2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 μg/mL，玉米黃素稀釋成0.25、0.50、0.75、1.00、1.25 μg/mL，β-胡蘿卜素稀釋成0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 μg/mL 5 個梯度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別進樣10 μL，繪制質(zhì)量濃度與峰面積的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SPSS 2.0進行顯著性和主成分分析（principal component analysis，PCA）。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶葉類胡蘿卜素的定性分析

圖1 茶葉中類胡蘿卜素的HPLCFig. 1 HPLC analysis of carotenoids in tea leaves

對照文獻的保留時間和特征波長，共確定15 種類胡蘿卜素，與其他液相色譜檢測方法相比，此方法分離出了茶葉中更多的類胡蘿卜素組分，且玉米黃素與黃體素分離效果較好，如圖1所示。因自然界中類胡蘿卜素的種類繁多，且存在多種同分異構(gòu)體，本實驗檢測到的幾種類胡蘿卜素組分特征吸收波長相近，因此其中9 種未能確定其具體結(jié)構(gòu)。確定結(jié)構(gòu)的6 種類胡蘿卜素分別為新黃素、堇黃素、環(huán)氧玉米黃素、玉米黃素、黃體素以及β-胡蘿卜素，如表1所示。

表1 類胡蘿卜素的特征吸收波長Table 1 Characteristic absorption wavelengths of carotenoids

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別測定玉米黃素、黃體素、β-胡蘿卜素3 個標(biāo)準(zhǔn)品5 個質(zhì)量濃度梯度的峰面積，制作了質(zhì)量濃度與峰面積的一次標(biāo)準(zhǔn)曲線如表2所示，相關(guān)系數(shù)R2均大于0.999 8，表明類胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)曲線可靠，可準(zhǔn)確計算類胡蘿卜素的絕對含量。

表2 類胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)曲線Table 2 Standard curves for three carotenoids

2.3 類胡蘿卜素的測定結(jié)果

在被檢測的37 個鮮葉樣品中共同含有15 種類胡蘿卜素，總量在524.6～1 236.7 μg/g之間，平均為（863.7f13.5）μg/g，樣品間的差異十分顯著。從表3可以看出，37 個被測樣品所含類胡蘿卜素各組分的含量雖然各不相同，但總體呈現(xiàn)相同趨勢，即黃體素含量最高（（314.6f2.0）μg/g，36.42%），其次是堇黃素（（144.6f1.9）μg/g，16.74%）、新黃素（（102.4f1.7）μg/g，11.86%）、β-胡蘿卜素（（66.6f1.6）μg/g，7.71%）和玉米黃素（（56.3f1.2）μg/g，6.52%），這與Wei Xu等[9]的實驗結(jié)果基本一致。

37 個品種中，適制烏龍茶的九龍袍和紫牡丹的黃體素含量較高，黃體素作為香氣前體，會酶促氧化生成茶螺烯酮，茶螺烯酮是烏龍茶中對果香有貢獻的重要香氣物質(zhì)[21]。適制紅茶的云南大葉，適制烏龍茶的金萱、金匙，綠茶、紅茶兼適制的蜀永307、勁峰中β-胡蘿卜素含量都超過100 μg/g，β-胡蘿卜素作為香氣前體降解得到的β-紫羅酮對綠茶、紅茶、烏龍茶甜香都有重要作用[22]。新黃素在綠茶、紅茶兼適制的梅占和大樹茶中含量最高，其酶解產(chǎn)生的β-大馬烯酮是紅茶茶湯的重要香氣成分[23]。綠茶、紅茶、白茶兼適制的福鼎大白類胡蘿卜素總量最高為（1 236.7f9.5）μg/g，其中玉米黃素占25.59%，已有實驗表明擬南芥、玉米等植物中的玉米黃素會在酶催化下降解為具有番紅花香的藏花醛[24]，而藏花醛同樣在綠茶、紅茶、烏龍茶及普洱中檢出[3,25]，說明茶葉中的藏花醛也可能由玉米黃素降解得到?？偤看笥? 000 μg/g的茶樹品種還有云南大葉（1 214.5 μg/g）、金萱（1 082.3 μg/g）、九龍袍（1 105.1 μg/g）、紫牡丹（1 114.6 μg/g）、308（1 003.2 μg/g）和梅占（1 068.4 μg/g），這些品種也可能加工成為高香型茶。

不同適制性的各類茶樹品種所含類胡蘿卜素各組分的平均值如表4所示，含量較高的組分中，除綠茶品種和紅茶品種的黃體素和β-胡蘿卜素?zé)o顯著性差異外，4 種適制性品種的新黃素、堇黃素、環(huán)氧玉米黃素和玉米黃素均有顯著性差異。各類品種的類胡蘿卜素總量也存在顯著性差異，烏龍茶品種的平均總量最高（（1 046.0f13.9） μg/g），其次是紅茶（（889.4f12.8）μg/g ），綠茶含量最低（（801.0f12.8））μg/g。

表3 37 個茶樹品種中的類胡蘿卜素含量Table 3 Kinds and amounts of carotenoids in 37 tea varieties

表4 不同適制性茶樹品種類胡蘿卜素含量Table 4 Carotenoid contents of tea leaves for different tea varieties

2.4 PCA結(jié)果

采用PCA法對檢測結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)分析，以闡明樣品類胡蘿卜素組分及含量的內(nèi)在規(guī)律[26]。15 種類胡蘿卜素和37 個品種組成15h37的矩陣分析結(jié)果如下：抽樣適合性檢驗值為0.637，P值為0，實驗數(shù)據(jù)適合進行PCA。從表5可以看出，前4 種主成分累計方差貢獻率達到82.919%，表明前4 個主成分能夠基本解釋37 個品種類胡蘿卜素類香氣前體的全部變量信息。

表5 主成分的特征值和方差貢獻率Table 5 Eigenvalues and variance contribution rates of principal components

表6 前4 個主成分的載荷量Table 6 Loading capacities of fi rst four principal components

從表6可知，對PC1貢獻較大的類胡蘿卜素包括黃體素、堇黃素、新黃素、C9、C13和β-胡蘿卜素等，這些是樣品中含量較高的組分；對PC2貢獻較大的是玉米黃素和環(huán)氧玉米黃素；在PC3有較大正載荷量的是C14、C2和C10；對PC4貢獻較大的是C6和C7。

PC1和PC2累計貢獻率最高的2 個主成分，37 個品種根據(jù)圖2中各樣品的相對位置，可以分析樣品間的差異。相對位置越近，差異越小[27]。

如圖2所示，37 個品種可以分為3 部分，PC1得分較高的5 個烏龍茶品種聚在圖右側(cè)，說明烏龍茶品種類胡蘿卜素含量明顯優(yōu)于其他品種。黃體素酶促氧化可降解為花果香的茶螺烯酮；新黃素酶促氧化降解為玫瑰花香，李、柚等果香的β-大馬烯酮；β-胡蘿卜素可在物理、生物途徑降解產(chǎn)生β-紫羅酮、二氫獼猴桃內(nèi)酯、橙花叔醇和香葉基丙酮等多種香氣物質(zhì)。這可能是烏龍茶花果香濃郁，香氣物質(zhì)含量豐富的原因。圖2上方分布著適制紅茶的蜀永703、蜀永2號、臺灣大葉、云南大葉和具有兼制性的福鼎大白，分布較為分散，說明玉米黃素和環(huán)氧玉米黃素對紅茶的影響較大。玉米黃素、環(huán)氧玉米黃素參與葉黃素循環(huán)，二者之間根據(jù)光照情況可相互轉(zhuǎn)化[28]，類胡蘿卜素裂解雙加氧酶可催化玉米黃素降解為3-羥基-β-紫羅酮[29]，紅茶加工過程中也有該香氣物質(zhì)的形成，但其轉(zhuǎn)化機理尚不明確[24]。其余27 個品種密集分布在X軸附近成為另外一類，它們在PC1和PC2上的得分均不高，說明其類胡蘿卜素含量較低。

圖2 37 個品種主成分得分圖Fig. 2 Scores plot of PC1 versus PC2 for 37 tea varieties

從圖2可以看出，福鼎大白和云南大葉是2 個較為特殊的品種。福鼎大白在PC2上有很高的得分，而在PC1上得分為負，原因是其含有很高的玉米黃素造成的。類胡蘿卜素不但可以作為香氣前體對茶葉香氣有貢獻，也有利于紅茶紅湯紅葉品質(zhì)特征的形成，紅茶品種云南大葉在PC1和PC2上均有較高得分，說明其類胡蘿卜素含量最為豐富，對香氣和色澤品質(zhì)都有積極作用。

3 結(jié) 論

本實驗采用的HPLC-二極管陣列檢測器法與國內(nèi)其他分析茶葉中類胡蘿卜素的方法比較，具有操作簡便、快速、所需標(biāo)準(zhǔn)品少的特點。在37 個茶樹品種中共檢測到15 種類胡蘿卜素，含量為524.6～1 236.7 μg/g，平均為（863.7f13.5）μg/g，檢測結(jié)果更為全面。通過PCA得出，不同適制性茶樹品種所含類胡蘿卜素存在較大差異，烏龍茶的類胡蘿卜素含量最高；紅茶的環(huán)氧玉米黃素和玉米黃素含量高，其他品種類胡蘿卜素含量低。為不同茶類的香氣形成機理研究及茶葉加工中的品種選擇提供理論依據(jù)。

但本實驗采用的檢測方法未檢測出番茄紅素、六氫番茄紅素等對茶葉香氣同樣具有重要貢獻的類胡蘿卜素，這些類胡蘿卜素在茶葉中含量較少，可在本實驗方法基礎(chǔ)上加大樣品量，延長檢測時間，或使用大氣壓化學(xué)電離離子源的質(zhì)譜[30]等手段進一步探索。本實驗檢測出的類胡蘿卜素中，一些組分結(jié)構(gòu)尚不明確，需要通過HPLC-MS/MS聯(lián)用、核磁共振、紅外光譜等檢測手段分析。后續(xù)關(guān)于類胡蘿卜素香氣前體的研究可進一步擴展到加工過程及成品茶中，并結(jié)合香氣物質(zhì)進行研究，有利于研究類胡蘿卜素在茶葉中的降解機理，為茶葉加工提供參考。