李 成，孔曉雪，余炬波，鄒小欠，羅海波,*

（1.南京師范大學(xué)食品與制藥工程學(xué)院，江蘇 南京 210097；2.寧波南聯(lián)冷凍食品有限公司，浙江 寧波 315191；3.安徽科技學(xué)院食品工程學(xué)院，安徽 鳳陽 233100）

梭子蟹營養(yǎng)豐富、脂膏肥滿、味道鮮美，以其獨(dú)特的風(fēng)味而聞名。蟹糊是將新鮮梭子蟹漂洗、去殼腮、斬碎、加入少許鹽、味精等調(diào)味品制成的腌制生食水產(chǎn)品[1]。蟹糊生產(chǎn)中無熱加工過程，能充分保持原料鮮美等優(yōu)點(diǎn)，是我國沿海地區(qū)的特色水產(chǎn)品，深受當(dāng)?shù)鼐用裣矏邸Ｈ欢?，傳統(tǒng)腌制蟹糊產(chǎn)品因其加工工藝的特殊性，存在極高的食品安全風(fēng)險(xiǎn)隱患，具體表現(xiàn)在加工設(shè)備簡陋、環(huán)境衛(wèi)生較差，同時(shí)員工缺乏衛(wèi)生安全意識，導(dǎo)致微生物指標(biāo)普遍超標(biāo)[2]。徐景野等[3]對瓶裝蟹糊的調(diào)查表明溶藻弧菌和金黃色葡萄球菌的檢出率很高。楊憲時(shí)等[4]研究表明，市售蟹糊優(yōu)勢菌中存在葡萄球菌。消費(fèi)者食用污染后的產(chǎn)品會(huì)引起食源性疾病，具有安全隱患，嚴(yán)重限制了這一產(chǎn)品的推廣與發(fā)展。探究瓶裝蟹糊腐敗變質(zhì)的微生物種類，有利于對腐敗菌進(jìn)行靶向抑制，延長產(chǎn)品貨架期。

關(guān)于腌制生食水產(chǎn)品微生物菌相分析，目前已有研究報(bào)道。張春丹等[5]采用16S rDNA技術(shù)研究了瓶裝蟹糊中的細(xì)菌多樣性，發(fā)現(xiàn)蟹糊中存在馬胃葡萄球菌、嗜冷桿菌、海嗜冷桿菌、消化嗜冷桿菌、鹽水弧菌屬、肋生弧菌等菌。馬超等[6]運(yùn)用生理生化和Sensitire細(xì)菌鑒定系統(tǒng)對市購蟹糊進(jìn)行鑒定，主要菌群為葡萄球菌、玫瑰色庫克菌、棒狀桿菌，同時(shí)檢測出少量的馬紅球菌。但是，由于傳統(tǒng)微生物鑒定方法受到培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的限制，絕大多數(shù)微生物難以分離。大量研究表明，用傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法鑒定的微生物所占比例不到環(huán)境樣品中的1%，因而分析結(jié)果不能全面反映出樣本中微生物菌落情況[7]。

近年來，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，高通量測序技術(shù)已廣泛應(yīng)用于環(huán)境微生物多樣性分析。高通量測序又稱下一代測序技術(shù)，可以在短時(shí)間內(nèi)對幾十萬甚至百萬計(jì)的序列進(jìn)行檢測分析，具有同時(shí)分析多個(gè)樣品、安全性和自動(dòng)化程度高、數(shù)據(jù)量大、誤差小、分析全面等特點(diǎn)[8]，將其應(yīng)用于食品微生物菌群研究中有利于食源性病原菌的快速分析。目前，高通量測序技術(shù)已成功應(yīng)用于南美白對蝦[9]、牡蠣[10]、蝦夷扇貝柱[11]等水產(chǎn)品微生物菌群多樣性分析。但運(yùn)用高通量測序技術(shù)分析蟹糊菌群多樣性的研究鮮見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以傳統(tǒng)腌制蟹糊為研究對象，采用Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)分析不同貯藏溫度下蟹糊菌群結(jié)構(gòu)及變化規(guī)律，為后期靶向抑制其腐敗及防腐保鮮提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蟹糊 寧波南聯(lián)冷凍食品有限公司；MagicPure Size Selection DNA Beads 法國Transgen公司；Qubit3.0 DNA檢測試劑盒 美國Life公司；2hTaq Master Mix美國Vazyme公司；E.Z.N.A.Soil DNA試劑盒 美國Omega公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Pico-21型臺式離心機(jī) 美國Thermo Fisher公司；32866型Qubit3.0熒光計(jì) 美國Invitrogen公司；GL-88B型旋渦混合器 海門市其林貝爾儀器制造有限公司；Q32866型QubitT100TMThermal Cyeler型聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國Bio-Rad公司；DYY-6C型電泳儀電源、DYCZ-21型電泳槽北京市六一儀器廠；凝膠成像系統(tǒng) 美國UVP公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

蟹糊樣品2 組，每組1 200 g，1 組在4 ℃條件下貯藏3 d，另1 組置于-20 ℃條件下貯藏3 d。

1.3.2 pH值的測定

參考GB 5009.237ü2016《食品pH值的測定》[12]方法進(jìn)行測定。

1.3.3 TVB-N含量測定

參考GB/T 5009.228ü2016《食品中揮發(fā)性鹽基氮的測定》[13]方法，采用自動(dòng)凱氏定氮儀對揮發(fā)性鹽基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）含量進(jìn)行測定。

1.3.4 TVC值測定

參考GB 4789.2ü2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測定》[14]方法進(jìn)行測定，微生物菌落總數(shù)（total viable count，TVC）測定結(jié)果表示為lg（CFU/g）。

1.3.5 DNA的提取

采用基因組DNA提取試劑盒（美國Omega公司，按產(chǎn)品說明書進(jìn)行，網(wǎng)址鏈接http://omegabiotek.com/store/product/soil-dna-kit/）對不同溫度下蟹糊微生物基因組進(jìn)行DNA抽提，并用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測提取效果。1.3.6 PCR擴(kuò)增及高通量測序

以提取的基因組DNA作為模板，對16S rDNA序列的V1-V3和V3-V4區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增，正向引物上接有不同堿基的標(biāo)簽（barcode）序列以區(qū)分不同樣品，對應(yīng)的引物如下：

V1-V3：

V1F：5’-CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTG（barcode）AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’

V3R：5’-GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAAT TCCAACCGCGGCKGCTGGC-3’

V3-V4：

341F：5’-CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTG（barcode）CCTACGGGNGGCWGCAG-3’

805R：5’-GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAA TTCCAGACTACHVGGGTATCTAATCC-3’

PCR擴(kuò)增兩輪結(jié)束后，用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定，純化后的樣品用Qubit 3.0 DNA檢測試劑盒對DNA進(jìn)行定量，產(chǎn)物回收后送至生工生物工程（上海）股份有限公司，進(jìn)行Illumina MiSeq高通量測序。

1.4 數(shù)據(jù)處理及分析

MiSeq測序序列中含有barcode序列，首先取出引物接頭序列，再根據(jù)PE reads之間的overlap關(guān)系，將成對的reads拼接成一條序列，隨后按照barcode區(qū)分樣品得到各樣本數(shù)據(jù)。除去末端質(zhì)量值20以下及含N部分序列，并過濾低復(fù)雜短序列。然后除去嵌合體及非特異性擴(kuò)增序列，得到各樣本有效數(shù)據(jù)。最后按照序列間的距離進(jìn)行聚類，將相似性在97%以上的序列進(jìn)行歸并生成操作分單元（operational taxonomic unit，OTU）根據(jù)聚類分析結(jié)果，進(jìn)行α多樣性分析，其中菌群豐度可由ACE指數(shù)、Chao1指數(shù)進(jìn)行評估，其數(shù)值越高表明群落物種豐富度越高；菌群多樣性由Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)進(jìn)行評估，Shannon指數(shù)與群落多樣性呈正相關(guān)，Simpson指數(shù)呈負(fù)相關(guān)。Coverage值是測序深度指標(biāo)，代表每個(gè)樣品文庫的覆蓋率。基于分類學(xué)信息，討論蟹糊在不同貯藏溫度下的微生物菌群結(jié)構(gòu)。利用Mothur 1.30.1軟件、FLASH 1.2.3軟件、Pear 0.9.6軟件、Usearch 5.2.236軟件、Cytoscape 3.2軟件、R3.2、SPSS 19.0等軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蟹糊在不同貯藏溫度下的品質(zhì)變化

表1 不同貯藏溫度下蟹糊樣品的品質(zhì)變化Table 1 Quality changes of crab paste samples stored at different temperatures

從表1可以看出，蟹糊樣品TVC值、TVB-N含量和pH初始值分別為（4.19f0.02）（lg（CFU/g））、（7.22f0.07）mg/100 g、7.00f0.04，-20 ℃貯藏3 d后TVC值和TVB-N含量與初始值接近，無顯著變化（P＞0.05），而4 ℃貯藏3 d后TVC值和TVB-N含量分別達(dá)到（4.90f0.15）（lg（CFU/g））、（49.14f0.42）mg/100 g，均顯著超過GB 10136ü2015《動(dòng)物性水產(chǎn)制品》規(guī)定的限值（TVC＜4.70（lg（CFU/g）），TVB-N＜25.0 mg/100 g），pH值顯著升高（P＜0.05），同時(shí)出現(xiàn)輕微的腐敗臭味，這可能與蛋白質(zhì)在細(xì)菌及其相關(guān)酶的作用下分解為氨和胺類等堿性物質(zhì)有關(guān)。

2.2 PCR擴(kuò)增結(jié)果

以提取的基因組DNA作為模板，用16S rDNA V1-V3和V3-V4區(qū)的通用引物擴(kuò)增出目的片段（圖1），條帶清晰，可以滿足后續(xù)測序?qū)嶒?yàn)要求。

圖1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig. 1 Electrophoretograms of PCR-amplified products

2.3 測序數(shù)據(jù)分析

Illumina MiSeq高通量測序獲得的樣本原始序列總數(shù)為199 523，經(jīng)質(zhì)控和優(yōu)化后共得到174 943 條有效序列（表2）。每個(gè)組的有效序列數(shù)均在30 000以上，有效序列百分比達(dá)80%以上，表明所得到的有效序列可達(dá)到后續(xù)微生物多樣性分析的要求。進(jìn)而對樣品的序列進(jìn)行聚類分析，在97%相似水平下的OTU生物信息統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，不同擴(kuò)增區(qū)域的結(jié)果均顯示4 ℃貯藏3 d的蟹糊樣品OTU數(shù)量比-20 ℃多，說明在4 ℃貯藏溫度下蟹糊的微生物多樣性可能比-20 ℃更豐富。

表2 各組樣品有效序列與OTU數(shù)量統(tǒng)計(jì)Table 2 Observed valid sequence and OTU numbers in crab pastes stored at different temperatures

2.4 α多樣性分析

根據(jù)97%相似性水平下的OTU信息，采用α多樣性指標(biāo)的ACE指數(shù)、Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)及Simpson指數(shù)對樣品微生物物種豐富度和多樣性進(jìn)行評估，結(jié)果見表3。所有樣本測序覆蓋率均在90%上，表明樣品中序列未被測到的概率較低。Shannon-Wiener曲線可以反映各樣本在不同測序數(shù)量時(shí)的微生物多樣性，當(dāng)曲線趨向平坦時(shí)，說明測序數(shù)據(jù)量足夠大，可以反映樣品中絕大多數(shù)的微生物信息。由圖2可以看出，所有樣本的曲線都隨著橫坐標(biāo)而逐漸穩(wěn)定，說明測序數(shù)據(jù)量合理，所含菌種數(shù)較多。

表3 不同貯藏溫度下蟹糊α多樣性指數(shù)Table 3 α diversity index of crab pastes stored at different temperatures

圖2 Shannon-Wiener曲線分析Fig. 2 Shannon-Wiener curves

2.5 群落多樣性分析

對不同貯藏溫度下樣品獲得的OTU屬水平上進(jìn)行物種注釋，統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果見表4，其中屬水平上相對豐度大于1%的菌群柱狀分布圖見圖3。相對豐度大于1%的有肉食桿菌屬（Carnobacterium）、Jeotgalibaca、環(huán)絲菌屬（Brochothrix）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）、嗜冷桿菌屬（Psychrobacter）、弧菌屬（Vibrio）。-20 ℃貯藏3 d的蟹糊樣品優(yōu)勢菌屬為肉食桿菌屬（V1-V3，68.81%；V3-V4，69.29%）、弧菌屬（V1-V3，16.75%；V3-V4，14.39%）。4 ℃貯藏3 d的蟹糊樣品優(yōu)勢菌屬為肉食桿菌屬（V1-V3，73.37%；V3-V4，70.35%）、Jeotgalibaca（V1-V3，11.82%；V3-V4，12.35%）、葡萄球菌屬（V1-V3，5.45%；V3-V4，5.01%）。-20 ℃和4 ℃貯藏3 d的蟹糊樣品肉食桿菌屬均為優(yōu)勢菌屬，表明其可能在蟹糊腐敗變質(zhì)中起重要作用。與-20 ℃貯藏樣品相比，4 ℃貯藏3 d的蟹糊樣品菌群多樣性降低、菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，環(huán)絲菌屬（Brochothrix）、嗜冷桿菌屬（Psychrobacter）豐度保持基本不變。Jeotgalibaca、萄球菌屬（Staphylococcus）豐度顯著升高，而弧菌屬（Vibrio）明顯降低。

表4 不同貯藏溫度及擴(kuò)增區(qū)域下樣品菌群在屬水平上的分布Table 4 Relative abundance of bacterial genera at different storagetemperatures and in different amplification regions

圖3 不同貯藏溫度下蟹糊樣品微生物物種組成（屬水平）Fig. 3 Bacterial community compositions at the genus level in crab pastes stored at different temperatures

3 討 論

微生物是影響腌制生食蟹糊品質(zhì)和食用安全性的主要因素，而在不同溫度下其腐敗特性存在較大差異。本實(shí)驗(yàn)采用-20 ℃模擬產(chǎn)品加工后工廠貯藏溫度，4 ℃模擬家庭冷藏溫度，在兩種溫度下分別貯藏3 d，測定其TVC值、TVB-N含量和pH值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)-20 ℃貯藏3 d后各指標(biāo)與初始值均無顯著差異（P＞0.05），而4 ℃貯藏3 d后相關(guān)品質(zhì)指標(biāo)均已顯著超過國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定限值（P＜0.05），同時(shí)出現(xiàn)輕微腐敗跡象。因此，有必要分析不同貯藏溫度下蟹糊的菌群結(jié)構(gòu)，為企業(yè)生產(chǎn)和消費(fèi)者提供指導(dǎo)。

關(guān)于蟹糊菌群結(jié)構(gòu)的分析，張春丹等[5]采用16S rDNA擴(kuò)增法對蟹糊細(xì)菌多樣性進(jìn)行研究，共鑒定出12 個(gè)細(xì)菌種屬。馬超等[6]應(yīng)用生理生化和Sensitire細(xì)菌鑒定系統(tǒng)對市購蟹糊進(jìn)行分析，成功鑒定出4 個(gè)主要細(xì)菌種屬。本實(shí)驗(yàn)通過Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)分析了不同貯藏溫度下蟹糊菌群結(jié)構(gòu)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)-20 ℃貯藏3 d的蟹糊樣品V1-V3和V3-V4區(qū)域擴(kuò)增所得微生物菌屬分別為18 屬和26 屬，4 ℃貯藏3 d的蟹糊樣品V1-V3和V3-V4區(qū)域擴(kuò)增分別獲得16 屬和19 屬，表明-20 ℃貯藏蟹糊中的微生物多樣性比4 ℃貯藏3 d更豐富。同時(shí)，也可以看出V3-V4較V1-V3區(qū)域，所得微生物豐富性更高。此外，在蟹糊中發(fā)現(xiàn)了很多小類微生物菌屬和未知菌屬，雖然它們在微生物菌群結(jié)構(gòu)中占比較小，通過其他技術(shù)未必能分離出來，但它們可能在蟹糊的腐敗中有一定作用。

微生物能夠利用水產(chǎn)品豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，產(chǎn)生生物胺、酮、醛、酯、硫化氫、有機(jī)酸等揮發(fā)性物質(zhì)，生成不良?xì)馕?，品質(zhì)改變，導(dǎo)致產(chǎn)品在感官上不可接受[15]。在水產(chǎn)品的腐敗中，只有少數(shù)特定種類細(xì)菌占據(jù)主導(dǎo)地位，使產(chǎn)品腐敗變質(zhì)，這類細(xì)菌就是特定腐敗菌[16]。肉食桿菌屬是在真空冷藏包裝和氣調(diào)包裝海鮮中的發(fā)現(xiàn)的主要腐敗菌[17-18]。曾有研究報(bào)道，這種細(xì)菌可產(chǎn)生大量揮發(fā)性物質(zhì)，如2,3-丁二酮和2,3-戊二酮[19]，這兩種物質(zhì)在純條件下可釋放出強(qiáng)烈的黃油氣味，在肉制品中也有肉食桿菌屬產(chǎn)生黃油氣味的報(bào)道[20]。本實(shí)驗(yàn)不同貯藏溫度下樣品的總菌群中，肉食桿菌屬相對豐度均在70%左右，表明該菌可能是蟹糊的特定腐敗菌。Jeotgalibaca發(fā)現(xiàn)于韓國傳統(tǒng)腌制海產(chǎn)品，為球形，需氧、耐鹽的革蘭氏陽性菌，近年來相關(guān)報(bào)道多為該菌屬新菌種的發(fā)現(xiàn)[21-22]，鮮見其在水產(chǎn)品中腐敗的作用研究。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Jeotgalibaca在4 ℃貯藏3 d樣品中相對豐度較高，表明該菌可能在蟹糊腐敗中起重要作用，需對其理化性質(zhì)作進(jìn)一步研究。

葡萄球菌屬和弧菌屬是常見的水產(chǎn)品食源性致病菌。葡萄球菌屬種類較多，其中金黃色葡萄球菌與食源性疾病密切相關(guān)，該菌在人體主要存在皮膚、黏膜以及外界相通的各種腔道。有些菌株可產(chǎn)生腸毒素等毒性蛋白，引起急性金黃色葡萄球菌毒血癥[23]。目前，已在多寶魚[24]、帶魚[25]等海產(chǎn)品中檢測出金黃色葡萄球菌?；【鷮僭诤Ｑ蟓h(huán)境中廣泛存在，其中一些成員是重要的食源性病原體，尤其是副溶血性弧菌，該菌引起的感染可導(dǎo)致人類發(fā)生不同種類的疾病，最常見的是急性胃腸炎。關(guān)于副溶血性弧菌，已有較多報(bào)道發(fā)現(xiàn)其存在于貝類[26]、三文魚[27]等多種海產(chǎn)品中。本實(shí)驗(yàn)中，在不同溫度條件下均檢出這兩種菌，其中葡萄球菌屬在4 ℃貯藏3 d時(shí)豐度較高，而弧菌屬在-20 ℃溫度下豐度較高，表明蟹糊產(chǎn)品存在著較高的食品安全風(fēng)險(xiǎn)隱患，但在不同貯藏溫度下主要致病菌存在差異。

嗜冷菌屬和環(huán)絲菌屬是水產(chǎn)品中發(fā)現(xiàn)的重要腐敗菌。嗜冷菌屬能夠分解脂類和水解蛋白質(zhì)，從而引起輕微腥味和發(fā)霉的氣味[28-29]。張皖君等[30]研究表明，嗜冷菌屬是鱸魚TVB-N含量與K值呈顯著正相關(guān)的主要菌屬。目前，在牡蠣[10]、蝦夷扇貝柱[11]、帶魚[31]等海產(chǎn)品中均有檢測出。環(huán)絲菌屬生長溫度范圍廣，這種細(xì)菌能夠在好氧和厭氧條件下生長，其屬中的熱殺索氏菌具有很強(qiáng)分解蛋白和脂肪的能力[32]，可引起海產(chǎn)品腐敗產(chǎn)生焦糖異味（2,3-丁二酮）[33]。有報(bào)道顯示，該菌已在蝦類[34]等多種水產(chǎn)品中被檢測到。本實(shí)驗(yàn)不同溫度下均檢測出嗜冷菌屬和環(huán)絲菌屬，表明這兩種菌屬可能是蟹糊腐敗過程中產(chǎn)生各種腐敗異味的重要菌群。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)采用Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)分析了不同貯藏溫度下蟹糊樣品中菌群結(jié)構(gòu)及變化情況，16S rDNA V1-V3和V3-V4區(qū)域擴(kuò)增測序結(jié)果顯示菌群結(jié)構(gòu)及豐度較為相似，對菌群整體無太大影響，但通過V3-V4區(qū)域擴(kuò)增測序所得微生物豐富性更高，建議今后測序選用V3-V4區(qū)域。蟹糊-20 ℃貯藏溫度下優(yōu)勢菌屬為肉食桿菌屬和弧菌屬，表明冷凍蟹糊存在一定的致病風(fēng)險(xiǎn)。4 ℃貯藏3 d蟹糊樣品，優(yōu)勢菌屬為肉食桿菌屬、Jeotgalibaca和葡萄球菌屬，這可能是蟹糊4 ℃放置時(shí)間過長易導(dǎo)致食源性中毒的重要原因。為此，應(yīng)當(dāng)加強(qiáng)原料減菌處理、嚴(yán)格控制加工環(huán)境、輔助添加天然保鮮劑等手段抑制微生物的生長繁殖，保障產(chǎn)品衛(wèi)生安全。