杜 艷，陳復(fù)生*，陳 晨，劉 營

（河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院，河南 鄭州 450001）

大豆（Glycine max (L.) Merr）通稱黃豆，起源于中國，種植面積廣泛，距今已有五千多年的栽培歷史，是現(xiàn)今人們的主要食品之一。大豆蛋白中含有大量的必需氨基酸，不含膽固醇，具有非常高的營養(yǎng)價值[1]，逐漸走向人們的生活飲食中。當(dāng)前市售的大豆蛋白主要有大豆分離蛋白（soybean protein isolate，SPI）和大豆?jié)饪s蛋白（soybean protein concentrate，SPC）[2]。

近年來，我國的大豆消耗量巨大，以至于國產(chǎn)大豆供不應(yīng)求，無法滿足人們及飼料行業(yè)日益增長的需要。因此，大量的大豆依賴進(jìn)口。數(shù)據(jù)顯示，2017ü2018年度中國大豆消費(fèi)量為1.1億 t，而自產(chǎn)量僅1 500萬 t左右，大豆進(jìn)口量高達(dá)9 700萬 t，這其中大部分為來自美國和巴西的轉(zhuǎn)基因大豆[3]。

轉(zhuǎn)基因作物自出現(xiàn)以來，爭議不斷。為規(guī)范轉(zhuǎn)基因作物在國際市場上的流通，世界各國紛紛建立轉(zhuǎn)基因標(biāo)識制度[4]，我國農(nóng)業(yè)部頒布的《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物標(biāo)識管理辦法》要求“凡列入標(biāo)識管理目錄并用于銷售的農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物，應(yīng)進(jìn)行標(biāo)識”。然而轉(zhuǎn)基因成分含量甚微且可能在產(chǎn)品加工過程中發(fā)生降解或損失，使得定性和定量檢測難度增大。

為檢測飼料和食品中的轉(zhuǎn)基因成分，國家農(nóng)業(yè)部發(fā)布第1485號公告[5]，描述了適用于富含多糖的植物及其粗加工測試樣品DNA提取和純化的溴化十六烷基三甲銨（hexadecyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）法，適用于植物深加工樣品DNA提取和純化的改良CTAB法，以及適用于蛋白含量較高的植物及其粗加工測試樣品DNA提取和純化的十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）等DNA提取方法。此外，GB/T 19495.3ü 2004《轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測 核酸提取純化方法》[6]描述了用于DNA提取的酚-三氯甲烷法、聚乙烯吡咯烷酮法、CTAB法和硅土法。國家農(nóng)業(yè)部2259號公告[7-8]和其他標(biāo)準(zhǔn)[9-14]均針對不同種類的轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品，提出了轉(zhuǎn)基因成分定性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）、實(shí)時熒光定量PCR、數(shù)字PCR以及基因芯片等檢測方法。

DNA的提取是轉(zhuǎn)基因檢測的關(guān)鍵步驟[15]。豆類食品成分復(fù)雜，常含有多糖、酚類、蛋白等PCR抑制劑，食品加工過程中的機(jī)械作用、熱效應(yīng)以及化學(xué)處理等也會對DNA的含量和完整性造成影響，為DNA提取帶來難度[16]。而DNA模板的濃度和純度決定著PCR的成敗，從而對檢測結(jié)果產(chǎn)生影響。DNA模板濃度或純度過低，可能由于含量低于PCR檢測限或PCR抑制劑的存在，降低PCR的靈敏度，造成假陰性結(jié)果。

研究人員對多種DNA提取方法進(jìn)行了比較，并提出對于不同的食品基質(zhì)應(yīng)選用不同的提取方法。Kamiya等[17]表示SDS法有助于大豆及大豆粕中DNA的提取。Wang Xiumin等[18]分別采用CTAB法、SDS法和鹽酸胍試劑盒對山東、江蘇、廣東、河北、廣西五省的54 種大豆種子和大豆粕進(jìn)行DNA提取，從成本、DNA質(zhì)量濃度和純度以及反應(yīng)時間4 個層面進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)SDS法每次反應(yīng)約消費(fèi)0.13 美元，成本較CTAB法（0.24 美元）更低，DNA產(chǎn)量高（164～1 750 ng/mg），A260nm/A280nm在1.8～2.0之間，符合PCR要求，且提取時間適中，比另2 種方法更適用于大豆及豆粕中DNA提取。Turkec等[4]隨機(jī)選取了47 種市售豆制品，研究CTAB法和Foodproof試劑盒、Dneasy Plant Mini Kit（Dneasy試劑盒）、Wizard Genomic DNA Purification Kit（Wizard試劑盒）、GeneSpin試劑盒的適用范圍，并未發(fā)現(xiàn)某一種方法可通用于所有樣品DNA的提取，大豆種子、餅干、巧克力、嬰兒配方奶粉宜使用CTAB法，豆粉、豆芽、豆奶宜使用GeneSpin試劑盒，豆粕、豆醬、面包和肉宜使用Foodproof試劑盒。

此外，劉欣等[19]分別使用DuPont試劑盒、Bayer試劑盒、Qiagen試劑盒、Monsanto試劑盒和Tiangen試劑盒提取大豆籽粒DNA，結(jié)果表明Monsanto試劑盒和Bayer試劑盒均由于PCR抑制劑的存在而影響后續(xù)檢測，Qiagen試劑盒、DuPont試劑盒與Tiangen試劑盒得到的DNA質(zhì)量濃度高、純度好，完整度高，為大豆轉(zhuǎn)基因檢測中DNA提取的適宜方法。喻志學(xué)等[20]對比了CTAB法和改良SDS法對轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因大豆DNA的提取效果，認(rèn)為SDS法更優(yōu)。然而，大豆蛋白作為一種重要的動物飼料和食品添加劑[21]，針對其DNA提取方法的對比討論相對較少。

因此，本研究選擇DNA提取常用的Macherey-Nagel Nucleo Spin Kit（Nucleo試劑盒）、Wizard試劑盒、Dneasy試劑盒、Ezup柱式植物基因組DNA抽提試劑盒（Ezup試劑盒）、Dzup基因組DNA抽提試劑盒（Dzup試劑盒）和SDS法6 種方法，對比其對7 種中國市售大豆蛋白（4 種SPI和3 種SPC）和大豆籽粒中DNA的提取效果，旨在提高轉(zhuǎn)基因大豆及其蛋白制品檢測的靈敏度和準(zhǔn)確性，為轉(zhuǎn)基因檢測方法的健全和轉(zhuǎn)基因標(biāo)識制度的完善奠定基礎(chǔ)。最后，使用優(yōu)選出的方法提取市售SPI和SPC中的DNA，并對其中大豆內(nèi)源lectin基因不同長度的片段進(jìn)行擴(kuò)增，探究大豆蛋白中l(wèi)ectin基因的降解情況。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

4 種市售SPI分別來自廣東（SPI 1）、四川（SPI 2）、陜西（SPI 3）和臨沂（SPI 4），3 種SPC分別來自上海（SPC 1）、四川（SPC 2）和河南（SPC 3），3 種大豆籽粒分別來自東北（大豆籽粒1）、河南（大豆籽粒2）和巴西（大豆籽粒3）。

Wizard試劑盒（目錄號：A1120） 美國Promega公司；Nucleo試劑盒（目錄號：740945） 德國Macherey-Nagel公司；Dneasy試劑盒（目錄號：69104） 德國Qiagen公司；Ezup試劑盒（目錄號：B518261）、Dzup試劑盒（目錄號：B518203）、SDS（分子生物級）、瓊脂糖M、4S Green Plus核酸染色劑 生工生物工程（上海）股份有限公司；蛋白酶K、核糖核酸酶A（ribonuclease A from bovine pancreas，RNase A）、2hPremix Taq 日本TaKaRa公司；6hLoading Buffer 北京Solarbio科技有限公司；λ DNA/Hind III Marker、DNA Marker I、Marker D2000 DNA北京Tiangen生化科技有限公司；熒光定量PCR擴(kuò)增試劑PowerUp SYBR Green Master Mix 美國Thermo Fisher公司；其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

FW-100高速萬能粉碎機(jī) 北京市光明醫(yī)療儀器有限公司；BSA224S-CW型分析天平 德國Sartorius公司；Sorvall BIOFUGE Stratos全能臺式高速離心機(jī)、Nanodrop 2000微量紫外分光光度計(jì)、QuantStudio 3實(shí)時熒光PCR擴(kuò)增儀 美國Thermo Fisher公司；HH-4J數(shù)顯恒溫水浴鍋 上海維誠儀器有限公司；D1008掌中寶離心機(jī) 北京大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；T100 Thermal Cycler PCR儀、UV light tray Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng)美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取方法

1.3.1.1 Nucleo試劑盒

取0.1 g磨碎的樣品于2 mL無菌離心管，根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行后續(xù)的DNA提取，最后用50 μL TE緩沖液洗脫，-20 ℃保存，備用。

1.3.1.2 Wizard試劑盒

取0.1 g磨碎的樣品于2 mL無菌離心管，根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行后續(xù)的DNA提取，最后用50 μL TE緩沖液溶解DNA，-20 ℃保存，備用。

1.3.1.3 Dneasy試劑盒

取0.1 g磨碎的樣品于2 mL無菌離心管，加入800 μL AP1緩沖液和4 μL RNase A，根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行后續(xù)的DNA提取，最后用50 μL TE緩沖液洗脫，-20 ℃保存，備用。

1.3.1.4 Ezup試劑盒

取0.1 g磨碎的樣品于2 mL無菌離心管，加入800 μL PCB緩沖液（預(yù)熱至65 ℃），振蕩混勻，置于65 ℃水浴保溫25 min，加入20 μL RNase A，室溫放置2～5 min，加同體積混合溶液（氯仿-異戊醇24∶1，V/V），12 000hg離心5 min，移上清液于新的離心管，根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行后續(xù)的DNA提取，最后用50 μL TE緩沖液洗脫，-20 ℃保存，備用。

1.3.1.5 Dzup試劑盒

取0.1 g磨碎的樣品于2 mL無菌離心管，加入400 μL Dzup溶液，振蕩混勻，后續(xù)操作按照試劑盒說明書進(jìn)行，最后用50 μL TE緩沖液溶解DNA，-20 ℃保存，備用。

1.3.1.6 SDS法

在Tian Fang等[22]方法基礎(chǔ)上稍作修改。取0.1 g磨碎的樣品于2 mL無菌離心管，加入1 mL 65 ℃預(yù)熱的SDS溶液，于65 ℃保溫混勻1 h，間或混勻，再加入10 μL RNase A，搖勻后于37 ℃保溫30 min。之后14 000hg離心10 min，移上清液于新的離心管中，加入0.7 倍的混合溶液（氯仿-異戊醇24∶1，V/V），于12 000hg離心10 min，將上清液移入到新的2 mL離心管。再加0.7 倍的混合溶液（氯仿-異戊醇24∶1，V/V），12 000hg離心10 min，將上清液移入到新的2 mL離心管。加0.6 倍的異丙醇，混勻后于-20 ℃保存1 h，12 000hg離心10 min，棄去上清液，向沉淀中加入500 μL無水乙醇，將沉淀彈至溶解后，于12 000hg離心5 min，棄去上清液。使用500 μL無水乙醇重復(fù)洗滌沉淀1～2 次，于12 000hg離心5 min后，棄去上清液，并將沉淀晾干，然后用50 μL TE緩沖液溶解，-20 ℃保存，備用。

1.3.2 DNA質(zhì)量濃度和純度檢測

用Nanodrop 2000微量紫外分光光度計(jì)測定各DNA樣品的濃度和純度。

1.3.3 DNA分子完整性檢測

用0.5 hT B E溶液配制1%的瓊脂糖凝膠，以0.1 μL/mL的比例，向瓊脂糖凝膠中加入4S Green Plus核酸染色劑。取10 μL DNA溶液與2 μL 6hLoading Buffer混合后點(diǎn)樣。于80 V恒壓條件下電泳1 h。使用UV light tray Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng)對DNA擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行觀察、拍照和分析[23]。

1.3.4 DNA用于實(shí)時熒光PCR的靈敏度檢測

選取大豆內(nèi)源lectin基因81 bp的片段進(jìn)行實(shí)時熒光PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系總體積為20 μL，包括PowerUp SYBR Green Master Mix 10 μL，上下游引物（表1）各0.3 μmol/L，模板DNA 40～50 ng，剩余體積用無菌水補(bǔ)齊。實(shí)時熒光PCR條件如表2所示。

表1 lectin基因?qū)崟r熒光PCR及普通定性PCR的擴(kuò)增引物序列及長度Table 1 Primers used in real-time PCR and qualitative PCR ampli fi cation of lectin gene

表2 lectin基因?qū)崟r熒光PCR條件Table 2 Conditions for real-time PCR ampli fi cation of the lectin gene

1.3.5 不同長度lectin基因片段的定性PCR檢測

以Dneasy試劑盒提取的大豆蛋白DNA作為模板，分別擴(kuò)增不同長度的大豆內(nèi)源lectin基因片段，探究大豆蛋白中l(wèi)ectin基因的降解情況。定性PCR體系的總體積為25 μL，包括2hPremixTaq10 μL，上下游引物（表1）各0.4 μmol/L， 模板DNA 40～50 ng，剩余體積用無菌水補(bǔ)齊。定性PCR條件如表3所示。

表3 lectin基因普通定性PCR條件Table 3 Conditions for qualitative PCR amplification of the lectin gene

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與處理

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)4 次，所有測試均進(jìn)行4 次以上，采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行方差分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)值之間以Duncan法進(jìn)行差異顯著性分析（P＜0.05，差異顯著），采用Origin 8.5軟件對實(shí)驗(yàn)結(jié)果作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 6 種DNA提取方法得到的DNA質(zhì)量濃度和純度

應(yīng)用6 種常用的DNA提取方法提取0.1 g大豆蛋白或大豆中的DNA，DNA質(zhì)量濃度和純度結(jié)果如表4所示。所有方法均可有效提取所有樣品中的DNA，但DNA質(zhì)量濃度和純度差異顯著，有必要針對不同樣品種類進(jìn)行具體分析。根據(jù)表4，將所有的樣品分為SPI、SPC和大豆籽粒3 類，分別求得6 種方法提取這3 類樣品得到的DNA質(zhì)量濃度和DNA純度（A260nm/A280nm和A260nm/A230nm）平均值，結(jié)果如圖1、2所示。

表4 6 種方法提取所得的DNA質(zhì)量濃度、純度、Ct值結(jié)果對比Table 4 Comparison of DNA yield, purity, and real-time PCR results by six extraction methods

續(xù)表4

由圖1可知，對于SPI，不同方法提取得到的DNA質(zhì)量濃度從高到低依次為Dzup、SDS、Wizard、Nucleo和Dneasy、Ezup；對于SPC，該順序依次為Dzup、SDS、Wizard和Ezup、Dneasy、Nucleo。大豆籽粒成分復(fù)雜，不同提取方法得到的DNA質(zhì)量濃度與SPI和SPC相比，無明顯的規(guī)律，如SDS法提取得到的大豆籽粒DNA質(zhì)量濃度均高于SPI和SPC，Dzup試劑盒提取得到的大豆籽粒DNA質(zhì)量濃度均低于SPI和SPC，而Wizard試劑盒提取得到的大豆籽粒DNA質(zhì)量濃度界于SPI和SPC之間。這可能與不同的DNA提取方法對大豆細(xì)胞裂解程度不同，從而導(dǎo)致DNA釋放差異。

DNA提取的基本原則是釋放樣品中的DNA，隨后純化DNA，去除PCR抑制劑[6]。Nucleo、Dneasy和Ezup試劑盒技術(shù)原理屬于膜過濾法，分別用鹽酸胍、AP1緩沖液和PCB緩沖液裂解樣品，通過硅膠吸附柱將釋放出的DNA吸附[28]，再采用化學(xué)試劑溶解清除DNA上附著的蛋白質(zhì)、多酚、多糖等物質(zhì)，最后使用能夠溶解和穩(wěn)定貯存DNA的TE緩沖液將純化的DNA從硅膠吸附柱上洗脫下來。Wizard試劑盒技術(shù)原理屬于CTAB法，是利用陽離子去污劑CTAB可與蛋白質(zhì)和多糖形成聚合物，并從低離子強(qiáng)度溶液中沉淀核酸與酸性多糖的能力，通過有機(jī)溶劑抽提，進(jìn)一步除去蛋白、多糖、酚類等雜質(zhì)，在乙醇的沉淀作用下，達(dá)到分離核酸的目的。Dzup試劑盒技術(shù)原理屬于鹽酸胍法，通過高pH值條件下的胍鹽等離液劑和變性劑將植物組織裂解，并水解RNA，再經(jīng)過乙醇沉淀得到基因組DNA。SDS法是基于陰離子去污劑SDS在高溫下能裂解細(xì)胞，使染色體解離、蛋白變性，同時與蛋白和多糖形成聚合物，釋放核酸。整體而言，本研究中的Nucleo、Dneasy、Ezup試劑盒提取的DNA質(zhì)量濃度均低于Dzup、Wizard試劑盒和SDS法提取的DNA質(zhì)量濃度。這表明膜過濾法在DNA純化過程中，可能造成部分DNA的損失，從而降低產(chǎn)品DNA質(zhì)量濃度。

圖2 6 種方法提取SPI、SPC和大豆籽粒中的DNA純度Fig. 2 DNA purities from SPI, SPC, and soybean seeds by six extraction methods

DNA的純度主要包含兩個方面[29]：通過DNA溶液在260 nm和280 nm波長處的吸光度比值（A260nm/A280nm）的大小判斷DNA樣品受蛋白質(zhì)、酚類的污染情況，通過DNA溶液在260 nm和230 nm波長處的吸光度比值（A260nm/A230nm）判斷多糖、鹽等小分子的污染情況[30]。6 種方法提取SPI、SPC和大豆籽粒中的DNA純度對比結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，對于SPI，Nucleo試劑盒、Dneasy試劑盒得到的樣品A260nm/A280nm值在1.7～2.0之間，A260nm/A230nm＞2.0，表明樣品純度高；Wizard試劑盒和SDS法提取DNA的A260nm/A280nm值也界于1.7～2.0，但A260nm/A230nm＜2.0，表明這兩種方法對蛋白和RNA等的去除效果較好，但對鹽等小分子的去除效果較差；Ezup試劑盒提取的DNA A260nm/A280nm和A260nm/A230nm均在2.0以上，表明樣品中有RNA污染；Dzup試劑盒得到的DNA純度最低，A260nm/A280nm＞2.0，A260nm/A230nm＜2.0，表明樣品中不僅存在RNA，也存在鹽等雜質(zhì)。

對于SPC，僅Dneasy試劑盒提取的DNA純度最高，A260nm/A280nm為1.9f0.1，A260nm/A230nm為5.7f1.7；Nucleo試劑盒、Wizard試劑盒、Dzup試劑盒和SDS法得到的DNA樣品，A260nm/A280nm值界于1.7～2.0，但A260nm/A230nm＜2.0，其中Dzup試劑盒A260nm/A230nm值最小，僅為0.4，表明采用這4 種方法提取的DNA中殘存多糖、鹽和其他小分子等雜質(zhì)；Ezup試劑盒得到DNA的A260nm/A280nm和A260nm/A230nm均在2.0以上，表明樣品受RNA污染。

對于大豆籽粒，所有方法得到DNA的A260nm/A280nm均處于1.7～2.0的范圍內(nèi)，A260nm/A230nm值從高到低依次為Dneasy試劑盒、Nucleo試劑盒、Ezup試劑盒、SDS法、Wizard試劑盒、Dzup試劑盒，DNA樣品的純度隨之遞減。

造成DNA純度不同的原因與不同方法純化DNA的原理不同有關(guān)。Nucleo試劑盒、Dneasy試劑盒、Ezup試劑盒是基于硅膠吸附柱將DNA吸附，再通過化學(xué)試劑除雜，從而提高樣品純度。而Wizard試劑盒、Dzup試劑盒、SDS法不借助物理吸附，僅通過蛋白酶、RNA酶及其他化學(xué)試劑，除去樣品中的蛋白和RNA，接著根據(jù)相似相溶原理將樣品中的非DNA類物質(zhì)溶解，并通過離心去除。盡管膜過濾法得到的DNA樣品濃度偏低，但其純度較高。在濃度不影響后續(xù)檢測的情況下，DNA純度對轉(zhuǎn)基因檢測十分重要。DNA純度越高，PCR抑制劑存在越少，越有利于提高后續(xù)定性、定量PCR的重復(fù)性、穩(wěn)定性和精確性，降低出現(xiàn)假陰性或假陽性結(jié)果的概率[15]。

2.2 6 種DNA提取方法的成本和時間

如圖3所示，DNeasy試劑盒提取DNA的過程耗時最短，約2 h即可完成，但成本最高，提取一個樣品DNA需要41 元；SDS法成本最低，一次提取折合不到1 元錢，但耗時最長，完成一輪操作往往需要12 h以上。Wizard試劑盒和Ezup試劑盒的時間成本和經(jīng)濟(jì)成本比較適中。

圖3 6 種DNA提取方法的成本（A）和時間（B）對比Fig. 3 Differences in cost (A) and time (B) between six DNA extraction methods

2.3 6 種DNA提取方法得到的DNA完整性

圖4 6 種方法提取SPI、SPC和大豆籽粒的DNA凝膠電泳結(jié)果Fig. 4 Agarose gel electrophoresis analysis of DNA samples extracted from SPI, SPC and soybean seeds by six extraction methods

由圖4a～g可以看出，SPI和SPC的基因組DNA分布于整個泳道或亮度很弱，幾乎檢測不到，表明以上樣品的DNA存在降解，也印證了大豆蛋白制備工藝參數(shù)可能會對大豆DNA產(chǎn)生降解作用。大豆蛋白中DNA的降解可能與蛋白制備工藝有關(guān)。國內(nèi)外生產(chǎn)SPI大多采用堿溶酸沉法，是將脫脂大豆粉用稀堿液浸提后，離心除去不溶性的多糖或其他雜質(zhì)后再將浸出液的pH值調(diào)至4.5左右，使蛋白質(zhì)處于等電狀態(tài)沉淀下來[31]。在制備過程中主要經(jīng)歷堿性、酸性環(huán)境的化學(xué)作用、熱作用和離心等物理作用。SPC的制備主要采用溶劑浸提法，逐步除去大豆粉中的非蛋白質(zhì)類可溶性物質(zhì)，并將剩下的不溶物干燥而得[2]。在此過程中DNA主要受到熱作用和有機(jī)溶劑的化學(xué)作用，最常用的溶劑為乙醇。

前人研究表明，pH值[32]、溫度[33]和化學(xué)試劑[34]會影響DNA的穩(wěn)定性。在偏堿性條件下，基因的穩(wěn)定性較高，受溫度影響不大，而在極端pH值條件下雙鏈DNA會變性成為單鏈DNA，甚至發(fā)生脫嘌呤反應(yīng)，當(dāng)pH值為4.0時，輔以溫度65 ℃處理90 min，DNA降解率達(dá)到99%[35]。熱處理過程中，DNA會發(fā)生物理變性，100 ℃以上可引起顯著的鏈斷裂，脫嘌呤或脫氨基反應(yīng)，二級結(jié)構(gòu)發(fā)生不可逆損失[32]。Lu Zhengfei等[36]在水醇浸提洋甘菊提取物時，發(fā)現(xiàn)不論水醇比例為多少，洋甘菊提取物中的DNA均無法被完全除去，DNA的片段長度大多在100～400 bp之間。

圖4h～j為未經(jīng)加工處理的大豆籽粒DNA，可見，Nucleo試劑盒、Dneasy試劑盒、Ezup試劑盒、SDS法均可提取出片段大小在23 kb左右的DNA，完整性較高，較適用于大豆DNA降解規(guī)律的研究。

2.4 大豆內(nèi)源lectin基因的實(shí)時熒光PCR分析[37]

圖5 6 種方法對lectin基因的擴(kuò)增結(jié)果Fig. 5 Fluorescent PCR amplification curves of the lectin gene using DNA samples extracted by six extraction methods

6 種方法對10 種樣品中大豆內(nèi)源lectin基因81 bp的實(shí)時熒光PCR檢測結(jié)果如圖5所示，所有方法提取出的DNA均可以得到典型的擴(kuò)增曲線，4 次平行實(shí)驗(yàn)的擴(kuò)增結(jié)果均呈陽性（表4）[13]，但Ct值大小差異明顯。Fernandes等[38]也有類似結(jié)論：不同的DNA提取方法得到的DNA樣品在進(jìn)行熒光PCR時，Ct值大小可能不同。其中，Ct值越小，表明樣品中的PCR抑制劑越少[39]。對于SPI，Nucleo試劑盒與Dneasy試劑盒的Ct值（19.9～22.7）均顯著小于其他4 種方法，Dzup試劑盒和SDS法的Ct值相對偏高，Wizard試劑盒、Ezup試劑盒較為適中。對SPC以及大豆籽粒，Dneasy試劑盒的Ct值（19.2～21.5）均顯著小于其他5 種方法，而Dzup試劑盒的Ct值（24.6～26.7）均顯著大于其他5 種方法。該現(xiàn)象與DNA純度結(jié)果基本一致，表明Dneasy試劑盒得到的DNA純度較高，對實(shí)時熒光PCR檢測具有較高的靈敏度，而Dzup試劑盒純度較低，可能存在實(shí)時熒光PCR抑制劑，在實(shí)際檢測中可能會影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2.5 SPI和SPC中l(wèi)ectin基因片段降解情況

圖6 SPI和SPC樣品不同長度lectin基因片段的擴(kuò)增電泳圖Fig. 6 Agarose gel electrophoresis of PCR amplified products of the lectin gene with different lengths in SPI and SPC samples

以Dneasy試劑盒提取得到的大豆蛋白樣品DNA作為模板，對不同長度的大豆內(nèi)源lectin基因進(jìn)行擴(kuò)增，電泳結(jié)果如圖6所示。所有樣品中均可以明顯擴(kuò)增出lectin基因81、201、414 bp的片段，擴(kuò)增條帶清晰、明亮。lectin基因836 bp的片段也廣泛存在于SPI和SPC樣品DNA中，但SPI 3和SPC 1～3的條帶亮度較低。在7 種大豆蛋白樣品中，同樣存在lectin基因1 487 bp的片段，但條帶非常弱，幾乎觀察不到，這表明在蛋白制備過程中l(wèi)ectin基因可能發(fā)生了降解，長片段逐漸消失。通過長片段與短片段的擴(kuò)增條帶亮度對比還可知，基因片段長度越高，越不穩(wěn)定，與短片段相比更容易發(fā)生降解。除此之外，在擴(kuò)增片段長度相同的情況下，樣品不同得到的條帶亮度不同，說明不同產(chǎn)地的蛋白樣品可能經(jīng)受了不同的制備過程，在此期間DNA所受到的降解程度和降解規(guī)律有所不同。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)以不同產(chǎn)地的SPI、SPC和大豆籽粒為原料，研究6 種常用的DNA提取方法——Nucleo試劑盒、Wizard試劑盒、Dneasy試劑盒、Ezup試劑盒、Dzup試劑盒、SDS法對DNA的提取效果，篩選出最適合SPI、SPC和大豆籽粒中DNA提取的方法，以根據(jù)檢測工作的實(shí)際需求，有針對性地選擇合適的方法，提高工作效率和結(jié)果可靠性。

通過對比可知，Dneasy試劑盒提取DNA的濃度較低，但純度最高，操作過程耗時最短，成本較高，DNA產(chǎn)品的完整性保持較好，實(shí)時熒光PCR檢測過程中靈敏度高，在現(xiàn)場快檢和對結(jié)果靈敏度、準(zhǔn)確度要求較高的檢測中較為適用。同樣地，Nucleo試劑盒得到的DNA質(zhì)量濃度也較低，但純度較高，能夠很好地保持DNA完整度，操作時間短，成本適中，對SPI的檢測靈敏度高，而在SPC的檢測方面靈敏度略低于Dneasy試劑盒。Ezup試劑盒和SDS法提取的DNA同樣可以保持較高的完整性，SDS法價格最低，但純度較差。Wizard試劑盒提取的DNA完整性相對較差，但由于該方法的實(shí)時熒光PCR靈敏度以及價格和操作時間均較低，也可以作為備選方法之一。Dzup試劑盒無論從DNA完整性還是濃度等方面均無法與以上5 種方法相提并論，因此不推薦作為大豆DNA的提取方法。

除此之外，本研究還發(fā)現(xiàn)SPI和SPC中DNA含量不同，SPI中的DNA含量整體高于SPC，推測其原因可能與DNA的降解有關(guān)。通過對4 種市售SPI和3 種SPC中不同長度的內(nèi)源lectin基因擴(kuò)增結(jié)果，印證了這一推測：在大豆蛋白制備過程中l(wèi)ectin基因836 bp和1 487 bp存在降解，條帶亮度與81、201、414 bp相比明顯較暗，也表明長片段比短片段更容易發(fā)生降解，且制備工藝不同，降解程度也有所不同。

因此，下一步可以在篩選出最適提取方法的基礎(chǔ)上，對大豆蛋白制備過程中DNA的降解規(guī)律進(jìn)行研究，為轉(zhuǎn)基因大豆制品的檢測和生產(chǎn)調(diào)控提供科學(xué)依據(jù)。