富天昕，張 舒，盛亞男，馮玉超，王長(zhǎng)遠(yuǎn),2,*

（l.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 大慶 163319；2.國(guó)家雜糧工程技術(shù)研究中心，黑龍江 大慶 163319）

綠豆是中國(guó)主要的食用豆類作物，其生產(chǎn)和出口量居世界首位。作為藥食兩用的豆科植物，綠豆其本身含有豐富的蛋白質(zhì)、淀粉、維生素、礦物質(zhì)及人體必需的氨基酸。其中蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)19.5%～33.1%，是禾谷類籽粒的2～3 倍[1-2]。但目前對(duì)綠豆的開(kāi)發(fā)多為淀粉的加工利用，對(duì)綠豆蛋白的開(kāi)發(fā)利用還存在一些局限，造成了資源的嚴(yán)重浪費(fèi)[3]。因此開(kāi)發(fā)綠豆蛋白，增加綠豆的附加值已成為現(xiàn)代的研究熱點(diǎn)。而綠豆多肽作為綠豆蛋白的酶解物，因其具有低致敏性，且在較低的pH值條件下依然能保持較高溶解性，可減輕腸胃負(fù)擔(dān)的特點(diǎn)所以有著廣闊的應(yīng)用前景[4-6]，但多數(shù)研究只是停留在綠豆蛋白肽本身的生物活性，例如抗氧化性、抗菌性，鮮有綠豆蛋白肽與金屬離子結(jié)合的報(bào)道。

鋅被稱為“生命元素”，在維持人體正常的生理狀態(tài)和生命活動(dòng)中起著至關(guān)重要的作用。缺鋅可導(dǎo)致生長(zhǎng)遲緩、免疫性功能障礙和神經(jīng)性功能障礙等一系列疾病[7-9]。但人體對(duì)飲食中鋅的吸收率較低，其主要原因是鋅與植酸在小腸中可形成不溶的復(fù)合物，從而大大降低了鋅的生物利用率，鋅缺乏已成為嚴(yán)重影響健康的常見(jiàn)問(wèn)題[10-11]。因此尋求一種高效、吸收利用率好的補(bǔ)鋅制劑迫在眉睫。研究發(fā)現(xiàn)，肽可與金屬離子反應(yīng)形成化學(xué)穩(wěn)定的可溶性螯合物，這種螯合物可以防止金屬離子在胃腸道中受到植酸等物質(zhì)的影響而生成沉淀。此外，這種金屬螯合物還可以在肽的吸收模式下進(jìn)入體內(nèi)，加速金離子的吸收。這為身體補(bǔ)充鋅提供了新的途徑[12-14]。

為進(jìn)一步明晰多肽與鋅離子螯合的機(jī)制以及生物利用率等情況，實(shí)驗(yàn)利用綠豆多肽與鋅進(jìn)行螯合，以螯合能力為指標(biāo)明確螯合工藝的最優(yōu)條件，采用紅外、紫外光譜分析對(duì)螯合前后的結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較，推測(cè)肽鋅螯合位點(diǎn)，并運(yùn)用掃描電鏡和X-射線衍射觀察二者表面結(jié)構(gòu)和結(jié)晶結(jié)構(gòu)的差異，通過(guò)體外腸道模擬實(shí)驗(yàn)測(cè)定螯合物的生物利用率。本研究可為肽鋅螯合的工業(yè)化生產(chǎn)及后續(xù)的研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脫脂綠豆蛋白（純度89.93%） 實(shí)驗(yàn)室自制；堿性蛋白酶（200 000 U/g）、鹽酸、氫氧化鈉、七水硫酸鋅（均為分析純） 上海麥克林公司；無(wú)水乙醇、二甲酚橙、六亞甲基四胺、乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）（均為分析純）西安化學(xué)試劑廠；透析袋（7 000 Da） 上?；巧锟萍加邢薰荆讳寤?、胃蛋白酶、胰蛋白酶 美國(guó)Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HH-S4型恒溫水浴鍋 鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；DELTA 320精密pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；Alpha 1-2 LD plus冷凍干燥機(jī) 德國(guó)Christa公司；PXZ-21K高速冷凍離心機(jī) 長(zhǎng)沙湘智離心機(jī)儀器有限公司；Quintik 24-1CN電子天平 賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；UV-2250PC型紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì) 日本島津儀器公司；傅里葉紅外光譜（Fourier transform infrared spectrometer，F(xiàn)TIR）儀美國(guó)Thermo Electron公司；SU1510型掃描電鏡 日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 綠豆蛋白的制備

將綠豆進(jìn)行粉碎過(guò)篩，并對(duì)其進(jìn)行脫脂處理。將脫脂綠豆粉與蒸餾水以1∶10的配比進(jìn)行堿提（用1 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)pH值至10），室溫條件攪拌2 h，3 500 r/min離心20 min，取上清液用1 mol/L的鹽酸調(diào)pH值至4.6，靜置0.5 h后，按照上述條件離心取沉淀，水洗沉淀2～3 次，冷凍干燥并在-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 綠豆多肽的制備

將脫脂后的綠豆蛋白用堿性蛋白酶進(jìn)行水解，酶解條件為溫度56 ℃、綠豆蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%、酶添加量6%、pH 9、時(shí)間4 h，在水解過(guò)程中維持pH值恒定并不斷攪拌。酶解結(jié)束后沸水浴中滅酶15 min，離心取上清液（5 000 r/min，15 min），經(jīng)冷凍干燥制得綠豆多肽粉[15]。

1.3.3 綠豆多肽成分測(cè)定

蛋白質(zhì)含量測(cè)定參照GB/T 5009.5ü2010《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》；水分測(cè)定參照GB/T 12087ü2008《食品中水分的測(cè)定》；灰分測(cè)定參照GB/T 5009.4ü2016《食品中灰分的測(cè)定》；鋅離子測(cè)定參照GB/T 10656ü2008《鍋爐用水和冷卻水分析方法 鋅離子的測(cè)定》。

1.3.4 綠豆多肽鋅螯合物的制備

將上述得到的綠豆多肽溶于蒸餾水中，調(diào)節(jié)螯合的溫度、pH值，待條件穩(wěn)定后加入一定量的ZnSO4g7H2O恒溫進(jìn)行螯合，5 000 r/min離心15 min去除沉淀。取上清液用3 倍體積的95%乙醇溶液進(jìn)行醇沉處理，10 000 r/min離心15 min取沉淀，洗滌數(shù)次后將其冷凍干燥[16]。

1.3.5 綠豆多肽螯合能力的測(cè)定

采用EDTA絡(luò)合滴定法[17]。將1.3.1節(jié)得到的螯合物用去離子水溶解定容至50 mL。取定容后的溶液10 mL，滴加二甲酚橙指示劑，滴加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的六亞甲基四胺至溶液呈穩(wěn)定的紫紅色，再加入4 mL六亞甲基四胺，用0.01 mol/L EDTA溶液滴定，溶液從紫紅色變?yōu)辄S色即為終點(diǎn)，記錄所消耗EDTA溶液的體積。肽鋅螯合能力計(jì)算如式（1）所示：

式中：X為綠豆多肽鋅螯合能力/（mg/g）；M為鋅的摩爾質(zhì)量/（g/mol）；C為EDTA的濃度/（mol/L）；V為滴定所消耗EDTA的體積/mL；m為螯合用綠豆多肽的質(zhì)量/g。

1.3.6 單因素試驗(yàn)

將綠豆多肽溶于去離子水中，配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%多肽溶液，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的ZnSO4g7H2O溶液，恒溫水浴一定時(shí)間。分別以多肽與鋅離子質(zhì)量比（肽鋅質(zhì)量比）（3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1）、反應(yīng)溫度（30、40、50、60、70 ℃）、反應(yīng)時(shí)間（40、60、80、100、120 min）、反應(yīng)pH值（4、5、6、7、8）進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

1.3.7 響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上以綠豆多肽螯合鋅的螯合能力為響應(yīng)值，采用Design-Expert 8.0統(tǒng)計(jì)分析軟件且以反應(yīng)pH值、反應(yīng)溫度、肽鋅質(zhì)量比、反應(yīng)時(shí)間為自變量建立Box-Behnken模型，對(duì)肽鋅螯合反應(yīng)進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)。響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平如表1所示。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Coded values and corresponding actual values of independent variables used for Box-Behnken design

1.3.8 綠豆多肽鋅螯合物結(jié)構(gòu)表征

1.3.8.1 紫外光譜分析

分別將肽與肽鋅螯合物粉末樣品溶于去離子水中，配成0.4 mg/mL溶液，用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)在190～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行紫外吸收光譜掃描[18]。

1.3.8.2 FTIR分析

分別取2 mg的綠豆多肽和肽鋅螯合物放入瑪瑙研缽中，再向瑪瑙研缽中分別加入200 mg干燥后的KBr，研磨至粒度在2.5～2.0 μm以下，在20 MPa的壓力下壓至1～2 min，取出壓片呈半透明狀態(tài)。利用FTIR儀進(jìn)行定性分析，波數(shù)范圍400～4 000 cm-1[19]。

1.3.8.3 掃描電鏡分析

將肽與肽鋅螯合物粉末分別用雙面膠黏貼于鋁制樣品臺(tái)上，然后噴涂一薄層金膜，在掃描電鏡下觀察拍攝樣品微觀形態(tài)并照相。放大倍數(shù)為500 倍[20]。

1.3.8.4 X-射線衍射分析

取一定量的樣品放在樣品槽中，在加速電壓40 kV、加速電流40 mA、掃描范圍（2θ）5°～90°、掃描速度0.02°/0.2 s的條件下對(duì)樣品進(jìn)行掃描，利用X-射線衍射圖譜分析其結(jié)構(gòu)[21]。

選取2015年4月至2017年9月期間在我院就診的84例系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者作為研究對(duì)象,并按照科室隨機(jī)分為對(duì)照組和觀察組。其中,對(duì)照組中男性15例,女性27例,年齡在34歲到79歲之間,平均年齡42.9±5.7歲,平均病程為3.2年;觀察組中男性17例,女性25例,年齡在36歲到77歲之間,平均年齡44.1±6.3歲,平均病程為3.5年。兩組患者的性別、年齡以及平均病程等一般數(shù)據(jù)均不具備統(tǒng)計(jì)學(xué)中的意義(P>0.05)。

1.3.9 肽鋅螯合物生物利用率1.3.9.1 模擬胃腸液的配制

模擬胃液的配制：準(zhǔn)確稱取2 g氯化鈉與3.2 g胃蛋白酶溶于800 mL雙蒸水，混勻后用6 mol/L鹽酸溶液調(diào)pH值至1.2，雙蒸水定容至1 000 mL后備用。

模擬腸液的配制：稱取0.68 g磷酸二氫鉀溶于70 mL雙蒸水后，加入7.7 mL 0.2 mol/L氫氧化鈉溶液，混勻后加入1 g胰蛋白酶和6 g膽鹽，溶解后用0.2 mol/L的氫氧化鈉調(diào)pH值至7.6，雙蒸水定容至100 mL后備用[22]。

1.3.9.2 模擬體外模擬胃腸道消化

分別取10 mg/mL的肽鋅螯合物和ZnSO4g7H2O（對(duì)照）溶液，用1 mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)溶液pH值到2.0，向溶液中加入5 mL的模擬胃液，混勻后，在37 ℃水浴振蕩2 h。之后將混合液pH值調(diào)節(jié)至7.2后加入5 mL模擬腸液，將此混合物移入到透析袋中（7 000 Da），37 ℃振蕩水浴2 h[23]。

溶解率測(cè)定：分別在胃液消化、腸液消化后測(cè)定肽鋅螯合物和ZnSO4g7H2O的溶解率。取一定體積的溶液10 000 r/min離心15 min，利用EDTA絡(luò)合滴定法分別測(cè)定上清液中鋅離子含量和溶液中總鋅含量。鋅離子溶解率計(jì)算如式（2）所示：

式中：V1為滴定上清液中鋅離子所需要的EDTA溶液體積/mL；V2為滴定等體積溶液中鋅離子所需要的EDTA溶液體積/mL。

透析率的測(cè)定：在腸液消化后，取透析袋外的溶液，利用EDTA絡(luò)合滴定測(cè)定溶液中鋅離子含量，以表示透過(guò)模擬腸道的鋅離子含量，鋅離子透析率計(jì)算如式（3）所示：

式中：V1為滴定透析袋外鋅離子所需要的EDTA溶液體積/mL；V2為滴定透析袋內(nèi)外鋅離子所需要的EDTA溶液體積/mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 綠豆多肽成分分析

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 反應(yīng)pH值對(duì)螯合能力的影響

圖1 反應(yīng)pH值對(duì)螯合能力的影響Fig. 1 Effect of pH on chelation efficiency

從圖1可以看出，肽鋅螯合反應(yīng)開(kāi)始，隨著反應(yīng)pH值的不斷增大，肽鋅螯合能力逐漸增強(qiáng)，在pH值為6時(shí)，其螯合能力達(dá)到最大，隨后緩慢下降。造成這種情況的原因是，當(dāng)螯合反應(yīng)體系中反應(yīng)pH值太低時(shí)，H+則會(huì)與鋅離子爭(zhēng)奪供電子基團(tuán)，不利于螯合物的生成。當(dāng)反應(yīng)pH值過(guò)高時(shí)，鋅離子則會(huì)與OH-生成Zn(OH)2沉淀，不利于螯合反應(yīng)的進(jìn)行[24-25]。

2.2.2 反應(yīng)溫度對(duì)螯合能力的影響

圖2 反應(yīng)溫度對(duì)螯合能力的影響Fig. 2 Effect of temperature on chelation efficiency

從圖2可以看出，螯合能力隨著反應(yīng)溫度的上升出現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)，在反應(yīng)溫度達(dá)到50 ℃時(shí)，其螯合能力達(dá)到最大，但在超過(guò)60 ℃時(shí)，肽鋅螯合能力則急速降低。出現(xiàn)這種趨勢(shì)的原因是開(kāi)始時(shí)溫度升高會(huì)使溶液中的鋅離子加速溶出，增大了鋅離子與肽的碰撞頻率，有利于螯合反應(yīng)的進(jìn)行。但由于肽鋅螯合的過(guò)程屬于放熱過(guò)程，且高溫易破壞多肽的結(jié)構(gòu)，減少了多肽鋅的結(jié)合位點(diǎn)，不利于螯合反應(yīng)的進(jìn)行[26-27]。

圖3 肽鋅質(zhì)量比對(duì)螯合能力的影響Fig. 3 Effect of peptide/zinc ratio on chelation efficiency

2.2.3 肽鋅質(zhì)量比對(duì)螯合能力的影響從圖3可以看出，在螯合反應(yīng)開(kāi)始時(shí)，螯合能力隨著多肽比例的增加而不斷增大，當(dāng)其質(zhì)量比達(dá)到6∶1時(shí)，肽鋅螯合能力達(dá)到最高值，隨后隨著肽鋅質(zhì)量比的增大其螯合能力開(kāi)始降低。出現(xiàn)這一現(xiàn)象的原因是當(dāng)肽鋅質(zhì)量比值過(guò)小時(shí)，溶液中多肽的濃度較低且無(wú)法生成穩(wěn)定的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，且大量的鋅離子未參加螯合反應(yīng)；當(dāng)肽鋅比值過(guò)大時(shí)，在溶液中產(chǎn)生聚集現(xiàn)象，多肽的有效利用率下降，不利于與鋅離子結(jié)合[28]。故曲線呈現(xiàn)先逐漸上升后下降的趨勢(shì)。

2.2.4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)螯合能力的影響

圖4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)螯合能力的影響Fig. 4 Effect of reaction time on chelation efficiency

從圖4可以看出，肽鋅螯合反應(yīng)時(shí)間逐漸延長(zhǎng)，肽鋅螯合能力不斷增大，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間達(dá)到80 min左右時(shí)，肽鋅螯合能力達(dá)到最大，之后隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，其螯合能力略有降低。故選取60～100 min作為后續(xù)研究。

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 響應(yīng)試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

為獲得螯合能力最高的綠豆多肽鋅螯合物，采用響應(yīng)面設(shè)計(jì)對(duì)螯合條件（肽鋅質(zhì)量比、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、pH值）進(jìn)行優(yōu)化，以期獲得螯合能力最高的螯合物。以X1、X2、X3、X4分別表示反應(yīng)體系的pH值、反應(yīng)溫度、肽鋅質(zhì)量比、反應(yīng)時(shí)間以及螯合能力（Y）為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)4因素3水平的二次回歸方程擬合因素和響應(yīng)值間的函數(shù)關(guān)系，見(jiàn)表3。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果建立多元二次回歸方程：Y=51.78+1.52X1+0.46X2+1.98X3+0.094X4-1.58X1X2+1.17X1X3+0.30X1X4-0.18X2X3-1.60X2X3-0.16XX+0.55XX-6.28X2-2.65X2-1.86X2-3.51X2。

24341234由表4可以看出，此響應(yīng)面的模型顯著，失擬項(xiàng)不顯著，且j為0.974 5，表示回歸方程模型具有良好的實(shí)際試驗(yàn)擬合度，誤差很小，可以在實(shí)際實(shí)驗(yàn)肽鋅螯合能力的研究和分析中使用。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 3 Experiment design with results for response surface analysis

表4 回歸方程模型的方差分析Table 4 Analysis of variance for regression equation

2.3.2 響應(yīng)面分析

從圖5可以看出，曲面形狀均近似橢圓形，說(shuō)明交互作用較顯著。如圖5A所示，反應(yīng)pH值和反應(yīng)溫度沿著彎曲表面上升的斜率陡峭，并且軸向輪廓致密，故反應(yīng)pH值和反應(yīng)溫度存在顯著的交互作用，且明顯可以看出反應(yīng)pH值對(duì)肽鋅螯合能力的影響相比溫度較大。從圖5B可以看出，當(dāng)反應(yīng)pH值一定時(shí)，隨著肽鋅質(zhì)量比的不斷增大，肽鋅螯合能力呈現(xiàn)先增強(qiáng)后逐漸減弱的趨勢(shì)，當(dāng)肽鋅質(zhì)量比一定時(shí)，反應(yīng)pH值不斷升高，肽鋅螯合能力也呈現(xiàn)先增強(qiáng)后逐漸減弱的趨勢(shì)。由圖5C可知，反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間沿曲面上升的坡面較緩且軸向等高線密集程度較小，故反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間存在顯著的交互作用，反應(yīng)溫度與反應(yīng)時(shí)間的交互作用對(duì)肽鋅螯合能力的影響也是呈現(xiàn)先增強(qiáng)后減弱的趨勢(shì)。結(jié)合Design Expert試驗(yàn)設(shè)計(jì)軟件分析得到佳螯合條件為肽鋅質(zhì)量比為6.19∶1、反應(yīng)溫度49.9 ℃、反應(yīng)pH 6.3、反應(yīng)時(shí)間82.7 min，此時(shí)得到的響應(yīng)預(yù)測(cè)值即52.50 mg/g。

圖5 各因素交互作用對(duì)肽鋅螯合能力影響的響應(yīng)面圖Fig. 5 Response surface and contour plots showing the interactive effect of factors on chelating efficiency

2.3.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

為后續(xù)的生產(chǎn)加工，將實(shí)際的應(yīng)用調(diào)整為肽鋅質(zhì)量比6.20∶1、反應(yīng)溫度50 ℃、反應(yīng)pH 6.3、反應(yīng)時(shí)間83 min，實(shí)際得到的肽鋅螯合能力的平均值為52.19 mg/g，與預(yù)測(cè)值相差0.59%，與響應(yīng)面預(yù)測(cè)值較為吻合。故而，本實(shí)驗(yàn)所采用響應(yīng)面法所得的綠豆多肽鋅制備的優(yōu)化工藝具有可靠性。

2.4 綠豆多肽鋅螯合物的結(jié)構(gòu)表征

2.4.1 紫外光譜分析

圖6 綠豆多肽以及肽鋅螯合物的紫外掃描圖Fig. 6 Ultraviolet absorption spectra of mung bean peptide and zinc-peptide chelate

從圖6可以看出，肽與螯合物的紫外吸收光譜發(fā)生了明顯的改變，說(shuō)明鋅離子與肽發(fā)生了相互作用，并且產(chǎn)生了一種不同于肽的新的化合物?？梢钥闯觯脑?09 nm波長(zhǎng)處有最大吸收峰，這是肽鍵上的C＝O電子躍遷的結(jié)果[29]，而螯合后的吸收峰移至205 nm波長(zhǎng)處，是因?yàn)殇\離子與N、O發(fā)生配位結(jié)合，使肽鍵上的C＝O電子躍遷受到了影響。此外，肽在276 nm波長(zhǎng)處有較弱的吸收峰，螯合后移至273 nm波長(zhǎng)處且強(qiáng)度明顯增加，這是配體NüCüO電子發(fā)生躍遷的結(jié)果[30]。螯合前后紫外光譜的變化說(shuō)明了螯合物的生成。

2.4.2 FTIR分析

圖7 綠豆多肽（A）以及肽鋅螯合物（B）的紅外掃描圖Fig. 7 Infrared spectra of mung bean peptide (A) and zinc-peptide chelate (B)

由圖7可以看出，螯合前后的紅外光譜圖發(fā)生了顯著的變化，說(shuō)明螯合反應(yīng)的發(fā)生，并生成了新的物質(zhì)，從而使氨基酸的振動(dòng)頻率發(fā)生改變，引起吸收峰的變化。綠豆多肽在3 385 cm-1處出現(xiàn)—NH和—OH伸縮振動(dòng)頻率重疊的寬吸收峰，而在螯合物的紅外光譜中其波數(shù)增加至3 404 cm-1，且強(qiáng)度減弱，說(shuō)明鋅離子與—NH和—OH基團(tuán)發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致電子云密度增大[31]。綠豆多肽酰胺I帶的波數(shù)為1 634、1 446 cm-1，在與鋅離子發(fā)生螯合反應(yīng)后，波數(shù)減少到1 585、1 413 cm-1，這代表了由羰基化合物引起的紅外吸收，發(fā)生了羧酸根生物反對(duì)稱伸縮振動(dòng)和對(duì)稱伸縮振動(dòng)。此外，綠豆多肽在1 037 cm-1處的吸收峰，在與鋅離子螯合后移至1 058 cm-1處，且強(qiáng)度增大。說(shuō)明鋅離子與NH2發(fā)生了結(jié)合。綠豆多肽紅外光譜中—NHüC＝O上—NH的吸收峰在1 109 cm-1，與鋅離子發(fā)生反應(yīng)后消失不見(jiàn)，說(shuō)明鋅離子發(fā)生螯合的位置應(yīng)該是—NHüC＝O上—NH基團(tuán)[32]。綜上所述，與鋅離子發(fā)生螯合的位置可能是—NHüC＝O上的—NH，—COOH上的—OH和末端—NH2，這與紫外光譜顯示的結(jié)果一致。

2.4.3 掃描電鏡分析

圖8 綠豆多肽（A）與鈦鋅螯合物（B）的掃描電鏡圖Fig. 8 Scanning electron micrographs of mung bean peptide (A) and zinc-peptide chelate (B)

利用掃描電鏡對(duì)肽粉末和肽鋅螯合物粉末的微觀表面結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察，將其在電鏡下放大500 倍。由圖8A可以看出，肽表面呈多孔狀結(jié)構(gòu)，且較為疏松。從圖8B可以看出，肽鋅螯合物表面呈片狀結(jié)構(gòu)，且多為聚合狀態(tài)。這是因?yàn)槎嚯呐c鋅離子通過(guò)離子鍵、配位鍵結(jié)合從而生成了小顆粒聚集體[33]。掃描電鏡從物質(zhì)微觀表面結(jié)構(gòu)再次證明了螯合物的形成。

2.4.4 X-射線衍射分析

圖9 X-射線衍射圖譜Fig. 9 X-ray diffraction patterns of mung bean peptide and zinc-peptide chelate

由圖9可看出，綠豆多肽與螯合物的的衍射圖譜有很大差別。ZnSO4g7H2O具有明顯的結(jié)晶衍射峰，而螯合物則沒(méi)有明顯的結(jié)晶衍射峰，如果綠豆多肽與鋅離子僅僅是物理的混合，相互作用較弱，則螯合物會(huì)顯示出結(jié)晶區(qū)。由此可以推測(cè)，鋅離子在與綠豆多肽發(fā)生螯合反應(yīng)時(shí)，晶體結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，使結(jié)晶度顯著下降。結(jié)晶結(jié)構(gòu)發(fā)生變化的原因是綠豆多肽的末端氨基、羧基與鋅離子發(fā)生了配位結(jié)合，從而導(dǎo)致了晶體結(jié)構(gòu)發(fā)生改變[34]。這與上述所測(cè)結(jié)構(gòu)的結(jié)果一致。

2.5 肽鋅螯合物生物利用率分析

圖10 體外模擬消化中鋅離子溶解率的比較Fig. 10 Comparison of dissolution rates of zinc ions from zinc-peptide chelate and zinc sulfate during in vitro simulated gastrointestinal digestion

由圖10、11可知，肽鋅螯合物和ZnSO4g7H2O經(jīng)胃消化后的溶解率分別98.85%、97.78%，二者差異顯著（P＜0.05）；經(jīng)腸道消化后的溶解率分別為54.61%、40.76%，二者差異極顯著（P＜0.01）；透析率分別為44.24%、30.15%，差異極顯著（P＜0.01）。說(shuō)明螯合物的溶解率在胃腸中均有良好的溶解性，且都高于無(wú)機(jī)鋅鹽。雖然無(wú)機(jī)鋅鹽在胃中也有較好的溶解性，但進(jìn)入腸道后其溶解性顯著下降，這因?yàn)槟c道是偏堿性的環(huán)境，無(wú)機(jī)鋅離子會(huì)形成氫氧化鋅沉淀，而肽鋅螯合物因其有較穩(wěn)定的配位鍵[35]，在胃腸中仍可以較穩(wěn)定的存在，所以溶解性相較于無(wú)機(jī)鋅鹽更好。透析率較無(wú)機(jī)鹽高的原因是鋅離子與小肽結(jié)合后以分子形式直接通過(guò)透析袋，而無(wú)機(jī)鋅離子較多會(huì)生成沉淀，導(dǎo)致無(wú)法透過(guò)。體外消化實(shí)驗(yàn)表明肽鋅螯合物相較于無(wú)機(jī)鋅鹽有較好的生物利用率。

圖11 體外模擬消化中鋅離子透析率的比較Fig. 11 Comparison of dialysis rates of zinc ions from zinc-peptide chelate and zinc sulfate during in vitro simulated gastrointestinal digestion

3 結(jié) 論

本研究將水解后的綠豆多肽與鋅離子進(jìn)行螯合，以螯合能力為指標(biāo)，考察反應(yīng)溫度、反應(yīng)pH值、肽鋅質(zhì)量比、反應(yīng)時(shí)間對(duì)螯合能力的影響。通過(guò)響應(yīng)面結(jié)合實(shí)際應(yīng)用得出最佳工藝條件為肽鋅質(zhì)量比6.20∶1、反應(yīng)溫度50 ℃、反應(yīng)pH 6.3、反應(yīng)時(shí)間83 min，實(shí)際得到的肽鋅螯合能力為52.19 mg/g；對(duì)螯合綠豆多肽和肽鋅螯合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行紫外光譜、FTIR、掃描電鏡和X-射線衍射分析，結(jié)果表明鋅離子與綠豆多肽的末端氨基、羧基以及酰胺鍵上的氮?dú)浠鶊F(tuán)發(fā)生了配位反應(yīng)，螯合后形成的新物質(zhì)從微觀表面及微觀結(jié)構(gòu)均有較大變化，說(shuō)明螯合物與綠豆多肽分屬不同物質(zhì)；對(duì)螯合生成的新物質(zhì)進(jìn)行體外消化模擬實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)證明，肽鋅螯合物在胃腸中的溶解率和透析率都優(yōu)于無(wú)機(jī)鋅鹽，肽鋅螯合物具有較好的生物利用率。本實(shí)驗(yàn)可為肽鋅螯合物的生產(chǎn)以及后續(xù)的研究提供理論支持。