李小梅，楊冬雪，李忠琴

(雅安職業(yè)技術(shù)學(xué)院，四川 雅安 625000)

酸棗又名野棗、山棗、鼻涕果等，鼠李科棗屬植物，廣泛分布于我國各省多個山區(qū)。酸棗具有很高藥用和食用價值，是我國衛(wèi)生部審批通過的第一批藥食同源植物之一[1]。酸棗全身皆為寶貝，酸棗仁是我國傳統(tǒng)治療焦慮失眠的名貴中藥材[2-3]；酸棗根治療失眠癥，療效顯著；用酸棗葉泡水代茶以鎮(zhèn)靜；酸棗果肉營養(yǎng)豐富直接食用或泡水具有止咳、降血脂等功效，通過對虛弱患者臨床觀察，發(fā)現(xiàn)連續(xù)按時吃酸棗的患者康復(fù)速度是服用多種維生素的患者的6倍，證明野生酸棗具有防病、抗氧化、抗衰老、養(yǎng)顏益壽的作用[4-5]。野生酸棗共含維生素、有機酸、果膠、三萜類化合物、黃酮類化合物和生物堿等物質(zhì)120多種。黃酮類化合物是酸棗中主要的化學(xué)成分之一，能夠清除體內(nèi)自由基，是一種天然有機抗氧化劑，引起學(xué)者們廣泛關(guān)注[6-11]。目前，國內(nèi)外對野生酸棗中黃酮的研究主要集中在酸棗仁，而對酸棗果肉、果皮和酸棗葉的研究較少。鑒于我國野生酸棗資源豐富，酸棗果肉、果皮和酸棗葉利用率低，為提高野生酸棗經(jīng)濟價值，本文采用紫外分光光度法以乙醇為溶劑，水浴加熱回流法提取酸棗中黃酮，以黃酮百分含量為評價指標(biāo)，優(yōu)化提取工藝，為野生酸棗中黃酮的提取工藝提供實驗參考。

1 試驗部分

1.1 材料、試劑和儀器

材料：野生酸棗(采于雅安山區(qū))。

試劑：蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%，上海源葉生物科技有限公司)；無水乙醇、95%的乙醇、Al(NO3)3、NaNO2、NaOH均分析純。

儀器：ME204E型電子天平：梅特勒-托利多有限公司；真空干燥箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；FS-200g中藥粉碎機：成都漢正科技有限公司； 恒溫水浴鍋：北京科偉永興儀器有限公司； 752型紫外可見分光光度計：上海光譜儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品前處理

挑選顆粒飽滿的野生酸棗洗凈晾干，剝下果皮，分離果肉和果核，將殘留在果核和果皮上的果肉洗凈，把果核、果肉、果皮和酸棗葉均勻鋪在4個洗凈的盤子上，放入真空干燥箱中在40℃溫度下烘干至恒重，用中藥粉碎機粉碎，過40目篩，裝入密封袋，置于干燥器中儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 .2 繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

精密稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品20mg，用70%乙醇溶解，轉(zhuǎn)移到100mL容量瓶中，用相同濃度的乙醇定容至刻度線，搖勻，即得濃度為200μg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)儲備液。用移液管精密吸取0，1，2，3，4，5mL 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)儲備液，分別置于25mL比色管中，依次加入5%NaNO2溶液1.5mL，搖勻，放置5min，加入10%Al(NO3)3溶液1.5mL，搖勻，放置6min，加入4% NaOH溶液7.5mL，用70%乙醇定容至刻度線，搖勻，放置10min。用紫外分光光度計在510nm波長處，以0mL管為參比，測定各管吸光度，平行測定3次，取平均值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 提取黃酮

準(zhǔn)確稱取3.000g樣品，置于250mL圓底燒瓶中，加入一定濃度和體積的乙醇，在一定溫度下加熱回流提取。過濾提取液，除去殘渣，濾液轉(zhuǎn)入 100 mL容量瓶中，以相同濃度的乙醇定容至刻度線，搖勻，備用。

在其他條件一致的情況下，利用單因素實驗，考察料液比、乙醇的濃度、回流溫度和回流時間4個因素對黃酮含量的影響。

1.2.4 測定黃酮含量

在25mL比色管中準(zhǔn)確吸取一定體積提取液，依次加入5%NaNO2溶液1.5mL，搖勻，放置5min，加入10%Al(NO3)3溶液1.5mL，搖勻，放置6min，加入4% NaOH溶液7.5mL，用70%乙醇定容至刻度線，搖勻，放置10min。用紫外分光光度計在510nm波長處，以0mL管為參比，測定樣品溶液的吸光度，根據(jù)線性回歸方程計算黃酮的含量。根據(jù)稀釋倍數(shù)計算出各樣品中黃酮的含量，計算公式如下：

其中：c為由標(biāo)準(zhǔn)曲線求出的稀釋后提取液中黃酮的濃度，mg/mL； V：原提取液的體積，100mL； m：樣品的質(zhì)量，g； n：稀釋倍數(shù)，酸棗仁和酸棗果肉稀釋25倍，酸棗果皮和酸棗葉稀釋60倍。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。在0～40μg/mL濃度范圍內(nèi)，吸光度A與蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品濃度(μg/mL)

線性關(guān)系良好，線性回歸方程為y = 0.011x + 0.002(R2=0.9990)。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 野生酸棗黃酮提取工藝

2.2.1 料液比對野生酸棗黃酮提取的影響

在乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，提取溫度為60℃，提取時間6h的條件下，選擇不同的料液比提取樣品中的黃酮，考察料液比對黃酮提取效率的影響，結(jié)果見表1。

表1 料液比對黃酮含量的影響(n=3)

試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)料液比為1∶30(g/mL)時提取出黃酮含量最高，因此選擇料液比為1∶30(g/mL)。

2.2.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對野生酸棗黃酮提取的影響

在料液比為1∶30(g/mL)，提取溫度為60℃，提取時間6h的條件下，選擇乙醇不同的體積分?jǐn)?shù)提取樣品中的黃酮，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)對黃酮提取效率的影響，結(jié)果見表2。

表2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對黃酮含量的影響(n=3)

試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時提取出黃酮的含量最高。這可能與70%乙醇的極性和樣品中黃酮類化合物的極性最接近有關(guān)，因選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%。

2.2.3 提取溫度對野生酸棗黃酮提取的影響

在料液比為1∶30(g/mL)，乙醇體積分?jǐn)?shù)比為70%，提取時間6h的條件下，選擇在不同溫度下提取樣品中的黃酮，考察提取溫度對黃酮提取效率的影響，結(jié)果見表3。

表3 提取溫度對黃酮含量的影響(n=3)

試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，提高溫度，有利于增加黃酮含量，但溫度超過80℃后，黃酮含量逐漸降低。這是因為升高溫度可以加快分子運動，同時還能軟化和破壞細胞壁有利于黃酮流出，但溫度過高黃酮氧化含量降低。因選擇溫度為80℃。

2.2.4 提取時間對野生酸棗黃酮提取的影響

在料液比為1∶30(g/mL)，乙醇體積分?jǐn)?shù)比為70%，回流溫度80℃的條件下，選擇不同時間提取樣品中的黃酮，考察提取時間對黃酮提取效率的影響，結(jié)果見表4。

試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著提取時間增長，黃酮含量增加，但增加到一定程度后，黃酮含量變化不大，為了節(jié)約時間，選擇提取時間為3h。

由上述單因素試驗結(jié)果表明野生酸棗中黃酮提取的最佳工藝條件為：料液比為1∶30(g/mL)，乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，提取溫度80℃，回流提取3h。

表4 提取時間對黃酮含量的影響(n=3)

2.3 重復(fù)性和穩(wěn)定性試驗

2.3.1 重復(fù)性試驗

精密稱取同一樣品(酸棗仁粉末)6份，按照最佳工藝條件制備提取液，按照1.2.4方法測定吸光度，計算黃酮的含量， RSD計算為2.37% ，表明本提取方法重復(fù)性好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗

將最佳工藝條件下制備的提取液放置0min、20min、40min、60min、80min后，按照1.2.4方法測定吸光度，計算黃酮的含量， RSD計算為2.54%，表明該工藝條件下制備出的提取液在顯色80min內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.4 測定酸棗各部位中黃酮含量

精密稱取樣品3.000g，置于250mL圓底燒瓶中，加入90mL 70%的乙醇，在80℃溫度下回流提取3h。所得提取液過濾，除去殘渣，濾液轉(zhuǎn)入 100 mL容量瓶中，以70%的乙醇定容，搖勻，待用。按照1.2.4方法測定和計算各樣品中黃酮的含量，結(jié)果見表5。

表5 酸棗各部位黃酮含量 (n=3)

3 結(jié)論

本試驗以乙醇為溶劑采用回流法提取雅安山區(qū)野生酸棗中的黃酮，以料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、提取時間四個單因素研究提取工藝條件。結(jié)果表明最佳提取工藝條件為：料液比1∶30(g/mL)、乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、提取溫度80℃、提取時間 6h，在此工藝條件下酸棗仁、酸棗果肉、酸棗果皮和酸棗葉中黃酮含量分別為2.439%、1.485%、8.254%、6.381%。并且考察了該方法的穩(wěn)定性和重復(fù)性RSD分別為2.37%和2.54%，表明該工藝條件下提取的提取液在顯色80min內(nèi)穩(wěn)定，重復(fù)性好，精密度高，適用于酸棗中黃酮提取，為雅安山區(qū)野生酸棗資源開發(fā)利用提供理論依據(jù)。