田其真，蔡丙嚴(yán)，程 漢，郝福星，黃銀云

(江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇 泰州 225300)

野大黃散提取物是將中藥野大黃散(野拔子、土大黃、癩蛤蟆草、苧麻根等組成)，經(jīng)水煮、蒸餾、醇沉、減壓干燥等工藝加工成的中藥復(fù)方制劑。野拔子，又名野壩子、野巴子，是云南的一種藥食同源植物，其味辛、涼，具有清熱解毒、疏風(fēng)解表、利濕、消食化積的功效[1]。野拔子水、醇提取物對大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌，均具有較強(qiáng)的抑制作用[2]。土大黃為蓼科植物鈍葉酸模及羊蹄的根與根莖，其性涼，味辛、苦，具有清熱行瘀、殺蟲、解毒等功效[3]。土大黃的蒽醌類、黃酮類成分具有抗流感病毒、呼吸道合胞病毒及止咳平喘作用[4-5]。癩蛤蟆草，藥名為荔枝草，本品味苦、辛，性涼，歸肺、胃、腎經(jīng)，具有清熱解毒、利尿消腫、涼血止血等功效[6]。癩蛤蟆草提取物為黃酮類、萜類、揮發(fā)油類等多種類型的化合物，具有止咳平喘、抗炎鎮(zhèn)痛、抗病毒、抑菌等多種藥理作用[7-8]。苧麻根是蕁麻科苧麻屬植物苧麻根莖，主要含黃酮類和三萜類化合物，具有清熱解毒、止血、止痛、抗病毒、安胎等功效[9-10]。獸醫(yī)臨床上對動物病毒性疾病常使用抗生素防止繼發(fā)感染，但抗生素過量使用帶來的耐藥性和藥物殘留問題日益突出。2018年4月，我國發(fā)布《關(guān)于開展獸用抗菌藥使用減量化行動試點(diǎn)工作的通知》，明確了養(yǎng)殖業(yè)抗生素減用和限用的時(shí)間表。面對嚴(yán)格規(guī)范的獸藥管理政策，開發(fā)用于提高畜禽免疫力、增強(qiáng)動物抗病能力且低毒、低殘留的中藥制劑，是畜牧業(yè)防制疫病的有效途徑[11]。野大黃散提取物中的上述4味中藥成分，性味寒涼，具有清熱解毒、涼血止血及安胎等功效，符合中獸醫(yī)對病毒性疾病的治療原則。方中大部分藥物含有黃酮類、蒽醌類等生物大分子成分，具有抗炎、抗病毒、止咳平喘及止血等活性[12-13]。筆者所在課題組前期對野大黃散提取工藝進(jìn)行了研究，制備了野大黃散提取物。通過觀察野大黃散提取物對小鼠的急性毒性和亞慢性毒性作用，評價(jià)其用藥安全性，旨在為野大黃散提取物的獸醫(yī)臨床用藥提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 野大黃散提取物

野大黃散提取物是將中藥野大黃散(中藥野拔子18 g、土大黃14 g、癩蛤蟆草24 g和苧麻根10 g)，經(jīng)水煮、蒸餾、醇沉、減壓干燥等工藝制備而成，復(fù)方提取物相當(dāng)于原生藥含量為1 g/mL。

1.2 試驗(yàn)動物

健康昆明(KM)小鼠，體質(zhì)量(20±0.20)g，由揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心提供，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(蘇)2012-0004。飼養(yǎng)在室溫20～25 ℃的鼠籠中，自由采食和飲水，觀察適應(yīng)3 d。試驗(yàn)給藥前停食12 h，給藥后4 h內(nèi)禁食，但不禁水。

1.3 主要試劑與儀器

天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、肌酐(Cre)、尿素氮(BUN)測定試劑盒，均購自江蘇英諾華醫(yī)療技術(shù)有限公司。小鼠分泌型球蛋白(sIgA)和血清IgG ELISA檢測試劑盒，均購自美國R D 公司。CPA電子天平為德國Sartorius公司產(chǎn)品，Exigo eos Vet動物血細(xì)胞分析儀為瑞典Exigo公司產(chǎn)品，D280全自動生化分析儀為江蘇英諾華醫(yī)療技術(shù)有限公司產(chǎn)品，Sunrise酶標(biāo)儀為瑞士Tecan公司產(chǎn)品。

1.4 急性毒性試驗(yàn)

預(yù)試驗(yàn)：取小鼠60只，雌雄各半，隨機(jī)分為A—F，共6組，每組10只，試驗(yàn)前禁食12 h，不限制飲水。A—E組為給藥組，分別對應(yīng)野大黃散提取物1.25、2.50、5.00、10.00、20.00 g/kg 5個劑量組，一次對各劑量組小鼠灌胃給藥0.8 mL/只，F(xiàn)組為對照組，灌服等體積生理鹽水。連續(xù)觀察7 d，觀察記錄小鼠的飲食、行為變化、是否有中毒或死亡癥狀出現(xiàn)，統(tǒng)計(jì)各組死亡及存活數(shù)量，采用改良寇氏法計(jì)算半數(shù)致死量(Median lethal dose，LD50)。

正式試驗(yàn)：取小鼠20只，雌雄各半，隨機(jī)分為2組，10只/組，試驗(yàn)前禁食12 h，不限制飲水。給藥組以野大黃散提取物的最高質(zhì)量濃度(1 g/mL)，一次給藥0.8 mL/只，于24 h內(nèi)灌胃3次，每次間隔6 h，累積灌服的給藥總量為120 g/kg，即為最大耐受給藥量(Maximal tolerable dose，MTD)，對照組灌服等體積的生理鹽水。連續(xù)觀察7 d，并記錄小鼠中毒癥狀及死亡情況。

1.5 亞慢性毒性試驗(yàn)

取小鼠80只，雌雄各半，隨機(jī)分為4組，每組20只。A—C組為野大黃散提取物給藥組，分別以20 g/kg(高劑量)、10 g/kg(中劑量)及2 g/kg(低劑量)一次灌胃給藥0.8 mL/只，分別相當(dāng)于靶動物推薦劑量的100、50、10倍，連續(xù)給藥35 d，D組為對照組，灌服等體積的生理鹽水。試驗(yàn)期間小鼠常規(guī)飼養(yǎng)，自由采食，每日觀察精神狀態(tài)、行為反應(yīng)、糞便性狀等，每周稱體質(zhì)量。

1.5.1 樣品采集 在第35 天末次給藥后，對小鼠禁食不禁水12 h，稱取體質(zhì)量。摘眼球采血，每組采集18只小鼠的血液，其中抗凝血6份用于檢測血常規(guī)指標(biāo)，6份血清用于檢測生化指標(biāo)，6份血清用于檢測免疫學(xué)指標(biāo)。逐只剖檢小鼠，取心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、小腸、睪丸/子宮等稱質(zhì)量，計(jì)算臟器指數(shù)(臟器指數(shù)=臟器濕質(zhì)量/體質(zhì)量)。對采集的臟器肉眼觀察，并采用福爾馬林溶液常規(guī)固定，進(jìn)行病理組織檢查。

1.5.2 血常規(guī)檢測 用全自動血液分析儀檢測小鼠抗凝全血中的紅細(xì)胞數(shù)(RBC)、白細(xì)胞數(shù)(WBC)、淋巴細(xì)胞數(shù)(LYMPH)、單核細(xì)胞數(shù)(MONO)和中性粒細(xì)胞數(shù)(NEUT)。

1.5.3 血生化檢測 用全自動血生化分析儀測定血清中天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、肌酐、尿素氮含量。

1.5.4 免疫學(xué)檢測 參照試劑盒說明書操作，分別檢測呼吸道、腸道sIgA和血清中的IgG免疫水平。

1.5.5 病理組織檢查 將采集的各臟器用福爾馬林溶液常規(guī)固定后，送至江蘇啟動子生物科技有限公司進(jìn)行石蠟包埋、切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.6 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 野大黃散提取物的急性毒性試驗(yàn)

由表1可知，與生理鹽水對照組比較，野大黃散提取物給藥組在預(yù)試驗(yàn)期間，小鼠采食、飲水、精神狀態(tài)、行為活動均未出現(xiàn)明顯異常，未發(fā)生中毒和死亡現(xiàn)象。分別從5.00、10.00、20.00 g/kg 3個劑量組中隨機(jī)選取3只小鼠脫臼處死，剖檢觀察心臟、肝臟、腎臟等臟器，均未見病理變化。小鼠給予野大黃散提取物前后的體質(zhì)量變化差異不顯著(P>0.05)。因此，無法確定野大黃散提取物的半數(shù)致死量，表明野大黃散提取物毒性極小。

表1 野大黃散提取物的急性毒性試驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Acute toxicity test results of Yedahuang powder extract

正式試驗(yàn)期間，給藥組小鼠每天3次累積灌服120 g/kg的野大黃散提取物，與生理鹽水對照組比較，小鼠外觀、精神、行為、糞便等均無異常，各組小鼠均無死亡情況，剖檢各臟器均無肉眼可見病變。在無法確定半數(shù)致死量的情況下，測得MTD>120 g/kg，結(jié)果表明，小鼠的最大給藥量為120 g/kg，相當(dāng)于臨床用藥量0.2 g/kg的600倍，表明野大黃散提取物無毒性作用。

2.2 野大黃散提取物的亞慢性毒性試驗(yàn)

2.2.1 小鼠臨床表現(xiàn) 與生理鹽水對照組比較，各給藥組小鼠采食、飲水、行為活動、糞便等均正常，且口角、眼、鼻等處無分泌物，體質(zhì)量增加，試驗(yàn)過程中未出現(xiàn)死亡小鼠。

2.2.2 對小鼠體質(zhì)量的影響 由表2可知，與生理鹽水對照組比較，高劑量組與低劑量組在1～35 d體質(zhì)量差異不顯著，中劑量組至第21天后體質(zhì)量顯著上升(P<0.05)。

表2 野大黃散提取物對小鼠體質(zhì)量的影響Tab.2 Effects of Yedahuang powder extract on body weight of mice g

注:同列字母不同表示差異顯著(P<0.05)，下同。
Note: Different letters in the same column show significant difference (P<0.05), the same below.

2.2.3 對小鼠臟器指數(shù)的影響 由表3可知，與生理鹽水對照組比較，僅中劑量給藥組小鼠脾臟指數(shù)顯著升高(P<0.05)，各組心臟、肝臟、肺臟、腎臟及胸腺指數(shù)等差異均不顯著。

2.2.4 對小鼠血常規(guī)指標(biāo)的影響 由表4可知，與生理鹽水對照組比較，中、低劑量給藥組小鼠淋巴細(xì)胞數(shù)顯著升高(P<0.05)，高劑量組中性粒細(xì)胞數(shù)顯著升高(P<0.05)，其余指標(biāo)均無顯著差異。

表3 野大黃散提取物對小鼠臟器指數(shù)的影響Tab.3 Effects of Yedahuang powder extract on organ index of mice

表4 野大黃散提取物對小鼠血常規(guī)指標(biāo)的影響Tab.4 Effects of Yedahuang powder extract on blood routine indexes in mice

2.2.5 對小鼠血清生化指標(biāo)的影響 由表5可知，與生理鹽水對照組比較，各劑量給藥組天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、肌酐、尿素氮含量差異不顯著。

表5 野大黃散提取物對小鼠血清生化指標(biāo)的影響Tab.5 Effects of Yedahuang powder extract on serum biochemical indexes in mice

2.2.6 對小鼠免疫學(xué)指標(biāo)的影響 由表6可知， 與生理鹽水對照組比較，中劑量組、低劑量組呼吸道與腸道sIgA、血清IgG 差異顯著(P<0.05)。

表6 野大黃散提取物對小鼠免疫學(xué)指標(biāo)的影響Tab.6 Effects of Yedahuang powder extract on immunological indexes of mice ng/ml

2.2.7 對小鼠臟器組織的影響 用藥第35天時(shí)，將各試驗(yàn)組小鼠頸椎脫臼處死，剖檢，小鼠各臟器組織均無肉眼可見病變。取各組小鼠的心臟、肝臟、腎臟、脾臟、肺臟、小腸、睪丸/子宮做組織病理切片，400倍光學(xué)顯微鏡下觀察，20 g/kg給藥組與生理鹽水對照組小鼠臟器組織鏡檢結(jié)果見圖1。由圖1可知，2組小鼠臟器組織結(jié)構(gòu)清晰，未發(fā)現(xiàn)顆粒變性、水泡變性和壞死點(diǎn)等變化。結(jié)果表明，2組小鼠心臟、肝臟、腎臟、脾臟、肺臟、小腸、睪丸/子宮組織未出現(xiàn)明顯的病理變化。

3 結(jié)論與討論

急性毒性試驗(yàn)是新藥生物安全評價(jià)的重要指標(biāo)，其結(jié)果不僅能確定受試藥物中毒作用方式和中毒反應(yīng)，也可為后續(xù)亞慢性毒性試驗(yàn)劑量分組提供參考依據(jù)[14]。半數(shù)致死量是藥物體內(nèi)急性毒性試驗(yàn)的關(guān)鍵指標(biāo)，也是對藥物急性毒性進(jìn)行分級的標(biāo)準(zhǔn)[15]。本研究急性毒性試驗(yàn)因受野大黃散提取物劑量和小鼠灌胃給藥的影響，無法給予小鼠更大劑量的藥物，無法測出其半數(shù)致死量。根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WTO)有關(guān)外源性化學(xué)物急性毒性分級標(biāo)準(zhǔn)和《保健食品安全性毒理學(xué)評價(jià)程序和方法》中所規(guī)定的藥物急性毒性分級標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)半數(shù)致死量>15 000 mg/kg給藥劑量時(shí)，視為無毒[16]。本試驗(yàn)中最大劑量組為20 000 mg/kg，因此可認(rèn)定野大黃散提取物無毒。對無法測出半數(shù)致死量的藥物，根據(jù)中國新獸藥研發(fā)規(guī)范與申報(bào)指南的要求，需測定其最大耐受給藥劑量[17]。本試驗(yàn)中小鼠最大耐受給藥劑量為120 g/kg，相當(dāng)于靶動物推薦臨床用藥0.2 g/kg的600倍，試驗(yàn)7 d內(nèi)均未出現(xiàn)任何毒性反應(yīng)和死亡現(xiàn)象，且采食、飲水和排便等活動正常，各臟器剖檢未見無明顯的病理學(xué)變化。說明野大黃散提取物對小鼠無急性毒性及致死性損傷，屬于實(shí)際無毒中藥制劑。

A—D分別為高劑量給藥組心臟、肝臟、腎臟、脾臟；E—H分別為對照組心臟、肝臟、腎臟、脾臟I—L分別為高劑量給藥組肺臟、小腸、睪丸、子宮；M—P分別為對照組肺臟、小腸、睪丸、子宮A—D:Heart,liver,kidney and spleen in the high dose group; E—H:Heart,liver,kidney and spleen in the control groupI—L:Lung,intestine,testis and uterus in the high dose group; M—P:Lung,intestine,testis and uterus in the control group圖1 野大黃散提取物高劑量組小鼠各臟器組織病理學(xué)變化(400×)Fig.1 Histopathological changes of various organs of mice in high dose group of Yedahuang powder extract(400×)

亞慢性毒性試驗(yàn)是評價(jià)藥物或毒物亞慢性危害的主要依據(jù)，可判斷藥物對靶器官和受試動物的累積作用，并明確安全的可重復(fù)給藥劑量值區(qū)間[18-21]。為更好地發(fā)現(xiàn)藥物的亞慢性毒性作用，在亞慢性毒性試驗(yàn)中，小鼠連續(xù)以灌胃方式給藥35 d，較一般采用的28 d喂養(yǎng)試驗(yàn)多7 d。試驗(yàn)期間野大黃散提取物各劑量組小鼠均未出現(xiàn)死亡及明顯的中毒反應(yīng)，采食、飲水、行為活動均無異常。與生理鹽水對照組比較，各劑量給藥組小鼠心臟、肝臟、腎臟、脾臟等組織剖檢形態(tài)完好，組織切片鏡檢均無顯著的病理學(xué)變化。脾臟指數(shù)與血液中淋巴細(xì)胞數(shù)均屬于免疫學(xué)相關(guān)指標(biāo)[22]，臟器指數(shù)結(jié)果表明，中劑量給藥組能顯著提高脾臟指數(shù)。血常規(guī)指標(biāo)檢測結(jié)果顯示，給藥組中、低劑量均能提升小鼠淋巴細(xì)胞數(shù)，表明野大黃散提取物中、低劑量有刺激淋巴細(xì)胞增殖作用。高劑量組中性粒細(xì)胞數(shù)升高,表明小鼠有輕微的炎癥反應(yīng)，可能是長期的灌胃給藥刺激所致。藥物亞慢性毒性試驗(yàn)中檢測靶動物的血生化指標(biāo)，可作為判定藥物對主要臟器是否具有毒性的重要依據(jù)[23]。通常天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、尿素氮和肌酐是評價(jià)心臟、肝臟、腎臟功能是否正常的重要血生化指標(biāo)[24-25]。血生化指標(biāo)檢測結(jié)果表明，野大黃散提取物各劑量給藥組與生理鹽水對照組天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、肌酐、尿素氮差異不顯著，提示野大黃散提取物對心臟、肝臟、腎臟等臟器無明顯的損傷作用。血清免疫學(xué)指標(biāo)檢測結(jié)果顯示，野大黃散提取物對灌胃小鼠的呼吸道、腸道sIgA及血清中IgG水平具有顯著的免疫調(diào)節(jié)作用，但具體調(diào)節(jié)機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

通過觀察灌胃給藥后小鼠的臨床表現(xiàn)、體質(zhì)量、臟器指數(shù)、組織病理學(xué)變化，以及測定血清生化和免疫學(xué)等多項(xiàng)指標(biāo)，綜合判定野大黃散提取物的毒性。結(jié)果表明，野大黃散提取物無毒副作用，是安全性較高的中藥制劑。