史普酉，賈 孟，楊成翠，楊 祥，譚小兵，詹 淳，張金峰，王 戈*

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 煙草學(xué)院，云南 昆明 650201；2.云南省保山市煙草公司 昌寧分公司，云南 保山 678100；3.云南省曲靖市煙草公司 羅平分公司，云南 曲靖 655800)

煙草黑脛病(Phytophoraparasiticavar.nicotiana)是煙草上普遍發(fā)生的土傳性真菌病害，可通過菌絲、孢子囊和游動(dòng)孢子侵染煙株，導(dǎo)致煙葉自上而下變黃、凋萎、枯死等[1-2]。我國(guó)每年因煙草黑脛病造成的經(jīng)濟(jì)損失巨大，嚴(yán)重影響了烤煙生產(chǎn)質(zhì)量。因此，在煙草植株田間不同發(fā)病條件下，探討不同發(fā)病程度植株光合特性及抗氧化酶活性的差異，有助于進(jìn)一步豐富黑脛病抗性機(jī)理，為科學(xué)防治黑脛病提供理論依據(jù)。研究表明，病原菌侵染植株后會(huì)涉及病原菌和植株之間的復(fù)雜作用關(guān)系。病原菌入侵后，植物體內(nèi)會(huì)形成一系列復(fù)雜防御機(jī)制抵御病原物的入侵和擴(kuò)展，超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)等植物體內(nèi)重要的保護(hù)酶會(huì)積極參與活性氧清除及酚類、木質(zhì)素和植保素等抗病相關(guān)物質(zhì)的合成，對(duì)抵御活性氧及氧自由基對(duì)細(xì)胞系統(tǒng)的傷害和增強(qiáng)植物抗病能力具有重要作用[3]。同時(shí)，病原菌的入侵，在煙株與病原物發(fā)生非親和作用時(shí)，寄主體內(nèi)保護(hù)酶活性較低，導(dǎo)致O2-、H2O2大量積累，并逐漸導(dǎo)致細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整性喪失，引發(fā)體內(nèi)一系列生理生化代謝失衡、光合能力降低等現(xiàn)象[4]。煙株感病后，生物因子和非生物因子等多種誘導(dǎo)因子可以誘導(dǎo)植物體內(nèi)防御酶活性升高以及葉綠素含量等生理指標(biāo)的改變，繼而引起植株體內(nèi)代謝物質(zhì)的改變，形成的代謝物本身具有抗病作用或者進(jìn)一步轉(zhuǎn)化形成與抗病性有關(guān)的次級(jí)代謝物[5-6]。光照是植物進(jìn)行光合作用的基礎(chǔ)，植物光合生產(chǎn)能力與光合色素、凈光合速率、氣孔導(dǎo)度、胞間CO2濃度等因素密切相關(guān)[7]。魏明月等[8]研究表明，光環(huán)境對(duì)煙草不同生育期光合作用、干物質(zhì)積累有顯著影響，強(qiáng)光條件下未出現(xiàn)光抑制的現(xiàn)象更有利于煙草的生長(zhǎng)發(fā)育。當(dāng)植物遭受病害脅迫時(shí)，植物體內(nèi)的一系列生理機(jī)制將形成一些適應(yīng)方法，同時(shí)也形成多種防御機(jī)制，構(gòu)成嚴(yán)密的防御系統(tǒng)。小麥感染白粉病菌后，相對(duì)葉綠素含量、光合速率及可溶性蛋白含量均不同程度地降低[9]。杜國(guó)棟等[10]在對(duì)蘋果褐斑病的研究中發(fā)現(xiàn)，蘋果褐斑病病菌侵染引起的光系統(tǒng)PSII反應(yīng)中心、PSII受體側(cè)和供體側(cè)的傷害，導(dǎo)致葉肉細(xì)胞CO2同化能力下降，進(jìn)而造成葉片凈光合速率不斷下降。同時(shí)，也有研究指出，番茄幼苗在受到脅迫的情況下葉片會(huì)變大、變薄以便于吸收更多光能用于光合作用[11]；棉花苗期受到脅迫后則通過抑制生長(zhǎng)以降低能力消耗的方式抵御脅迫[12]。

煙草是以收獲葉片為主的經(jīng)濟(jì)作物，病原菌的侵入導(dǎo)致葉片產(chǎn)量、品質(zhì)的下降，目前有關(guān)煙葉黑脛病害的研究大多圍繞品種抗性鑒定、病原菌分化和拮抗菌選育上，而有關(guān)病原菌侵入后導(dǎo)致光合特性改變的研究較少涉及[4,13]。從以往研究方法上來看，更多采用室內(nèi)或田間等人為干擾形式探討病原菌侵染的影響[14]，這與病原菌田間實(shí)際侵染和植株響應(yīng)存在一定的差距。在田間病原菌自然侵染并導(dǎo)致植株發(fā)生響應(yīng)條件下，探討植株自然發(fā)病情況下植株的抗性響應(yīng)相關(guān)研究較少涉及。本研究選擇云南煙區(qū)煙草黑脛病發(fā)病典型地區(qū)，在控制其他栽培條件基礎(chǔ)上，選擇同一地塊中不同自然發(fā)病程度煙株，比較不同發(fā)病程度煙株葉片抗氧化酶活性和光合特性的響應(yīng)差異，探討不同發(fā)病程度與植株相關(guān)生理指標(biāo)變化之間的相關(guān)性，以期進(jìn)一步豐富煙株黑脛病感病機(jī)理，為今后科學(xué)防治黑脛病提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)概況

1.1.1 取樣煙田背景情況 選定煙草黑脛病危害較為嚴(yán)重的3個(gè)區(qū)域進(jìn)行定點(diǎn)監(jiān)測(cè)(煙田種植情況如表1所示)，即云南省石林縣板橋鎮(zhèn)(北緯24°41′28″、東經(jīng)103°15′28″，海拔1670 m)、云南省昌寧縣珠街鎮(zhèn)(北緯25°8′7″、東經(jīng)99°53′42″，海拔1950 m)和云南省昌寧縣耇街鎮(zhèn)(北緯25°0′35″、東經(jīng)99°50′14″，海拔1690 m)。各區(qū)域定點(diǎn)一塊煙田進(jìn)行跟蹤監(jiān)測(cè)，供試土壤均為紅壤，品種為紅花大金元，供試田塊施肥措施及田間管理一致。

表1 不同煙區(qū)黑脛病發(fā)病情況

1.1.2 取樣處理設(shè)置 參照煙草病蟲害分級(jí)及調(diào)查方法[15]對(duì)煙株進(jìn)行黑脛病等級(jí)劃分并基于病情指數(shù)調(diào)查結(jié)果將煙株劃分為不同發(fā)病程度煙株(圖1)，即正常煙株：全株無??；輕度發(fā)病煙株：莖部病斑不超過莖圍的1/2，或半數(shù)以下葉片出現(xiàn)輕度凋萎及下部少數(shù)葉片出現(xiàn)病斑；中度發(fā)病煙株：莖部病斑超過莖圍的1/2，或半數(shù)以上葉片出現(xiàn)輕度凋萎及少數(shù)葉片出現(xiàn)病斑；重度發(fā)病煙株：莖部病斑環(huán)繞莖圍，或2/3以上葉片出現(xiàn)凋萎。

1.2 抗氧化酶活性測(cè)定

在各定點(diǎn)煙田，參照上述不同發(fā)病程度劃分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行田間取樣和相關(guān)指標(biāo)測(cè)定，具體方法為同一煙田同一發(fā)病程度選擇3株。將葉片去除葉脈后放入液氮罐保存，待測(cè)葉片酶活性，酶活性測(cè)定方法參照高俊鳳[16]的方法。

1.3 煙葉光合特性測(cè)定

于云南省昌寧縣耇街鎮(zhèn)監(jiān)測(cè)點(diǎn)，選擇同一發(fā)病程度最有代表性的3株烤煙，在其中部定點(diǎn)選取一片葉片，用軟毛刷刷去中部葉表面的灰塵，然后用LI-6400型便攜式光合儀(Li-COR lnc，美國(guó))并應(yīng)用Li-6400-02B藍(lán)紅光源探頭進(jìn)行光合響應(yīng)曲線的測(cè)定，取3株烤煙葉片平均值進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

圖1 各發(fā)病程度煙株取樣情況

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)利用Microsoft Office 2016 初步處理和作圖，利用SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；同時(shí)基于課題組前期光響應(yīng)曲線擬合結(jié)果[17]，采用雙曲線修正模型[18]對(duì)烤煙光響應(yīng)曲線進(jìn)行擬合，得出相關(guān)光合特征參數(shù)，該模型的表達(dá)式為：

式中：β、γ為系數(shù)。參數(shù)初始值及限制設(shè)定范圍為：α=0.01，β=0.0001，γ=0.001，Rd=0.3 μmol/(m2·s)；α≤1，β≤1，γ≤1，Rd≤1.5 μmol/(m2·s)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同發(fā)病程度煙株煙葉抗氧化酶活性差異分析

不同發(fā)病程度煙株煙葉抗氧化酶活性存在較大差異，且不同取樣點(diǎn)趨勢(shì)基本一致(圖2)，即隨著煙株黑脛病病情加重，POD和SOD活性呈先增加后降低的趨勢(shì)，其中POD活性在中度發(fā)病時(shí)達(dá)到峰值，且中度發(fā)病煙株顯著高于正常煙株；SOD活性在輕度發(fā)病時(shí)達(dá)到峰值，并顯著高于正常煙株；PPO活性和MDA含量呈持續(xù)上升趨勢(shì)，重度發(fā)病煙株均顯著高于正常煙株。以上結(jié)果表明黑脛病菌侵染煙株會(huì)引發(fā)煙葉體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)發(fā)生較大變化，且不同發(fā)病程度煙葉間存在差異。

2.2 不同黑脛病發(fā)病程度煙株光合特性變化差異分析

2.2.1 不同黑脛病發(fā)病程度煙株凈光合速率的變化特征 從光合擬合曲線來看(圖3)，在弱光條件下，各處理的測(cè)量值和擬合值基本保持一致，在弱光階段PAR<500 μmol/(m2·s)時(shí)，各處理凈光合速率的表現(xiàn)為正常煙株>中度發(fā)病煙株>重度發(fā)病煙株>輕度發(fā)病煙株；當(dāng)PAR>500 μmol/(m2·s)時(shí)，各處理的烤煙均達(dá)到光飽和點(diǎn)，且正常煙株的凈光合速率最大，重度發(fā)病煙株最小。

2.2.2 不同黑脛病發(fā)病程度烤煙氣孔導(dǎo)度的變化特征 不同發(fā)病程度煙株煙葉氣孔導(dǎo)度與凈光合速率的變化趨勢(shì)基本一致，即正常煙株>輕度發(fā)病煙株>中度發(fā)病煙株>重度發(fā)病煙株(圖4)。以上結(jié)果表明，隨著煙株黑脛病發(fā)病情況的加重，煙株氣孔導(dǎo)度減小。

2.2.3 不同黑脛病發(fā)病程度烤煙胞間CO2濃度和氣孔限制值的變化特征 隨著黑脛病發(fā)病情況加重，煙葉胞間CO2濃度下降，氣孔限制值升高，具體表現(xiàn)為正常煙株>輕度發(fā)病煙株>中度發(fā)病煙株>重度發(fā)病煙株(圖5)。當(dāng)PAR小于500 μmol/(m2·s)時(shí)，各處理氣孔限制值升高，大小表現(xiàn)為重度發(fā)病煙株>中度發(fā)病煙株>輕度發(fā)病煙株>正常煙株，表明氣孔因素會(huì)影響烤煙的凈光合速率；當(dāng)PAR大于750 μmol/(m2·s)時(shí)，各處理胞間CO2濃度開始升高，氣孔限制值開始降低，表明非氣孔因素會(huì)影響烤煙的凈光合速率，大小與PAR小于500 μmol/(m2·s)時(shí)一致。

圖2 不同發(fā)病程度煙株葉片酶活性差異

圖3 不同黑脛病發(fā)病程度煙株凈光合速率的變化特征

2.2.4 不同黑脛病發(fā)病程度烤煙表觀光能利用率的變化特征 隨著黑脛病發(fā)病情況加重，煙葉表觀光能利用率下降，具體表現(xiàn)為當(dāng)PAR小于500 μmol/(m2·s)時(shí)，大小為正常煙株>中度發(fā)病煙株>重度發(fā)病煙株>輕度發(fā)病煙株；當(dāng)PAR大于1000 μmol/(m2·s)時(shí)，大小為正常煙株>輕度發(fā)病煙株>中度發(fā)病煙株>重度發(fā)病煙株(圖6)。以上結(jié)果表明，隨著黑脛病發(fā)病程度的加重，煙株表觀光能利用率降低，從而導(dǎo)致煙株光合能力下降。

2.2.5 不同黑脛病發(fā)病程度烤煙表觀CO2利用效率的變化特征 隨著黑脛病發(fā)病情況的加重，烤煙表觀CO2利用效率下降，即在弱光階段PAR<500 μmol/(m2·s)時(shí)，各處理表觀CO2利用效率的趨勢(shì)為正常煙株>中度發(fā)病煙株>重度發(fā)病煙株>輕度發(fā)病煙株；當(dāng)PAR>500 μmol/(m2·s)時(shí)，各處理的表觀CO2利用效率大小為正常煙株>輕度發(fā)病煙株>中度發(fā)病煙株>重度發(fā)病煙株(圖9)。以上結(jié)果表明，黑脛病的發(fā)生會(huì)導(dǎo)致烤煙表觀CO2利用效率降低，病情越嚴(yán)重，表觀CO2利用效率越低。

圖4 不同黑脛病發(fā)病程度烤煙氣孔導(dǎo)度的變化特征

圖5 不同黑脛病發(fā)病程度烤煙胞間CO2濃度和氣孔限制值變化特征

圖6 不同黑脛病發(fā)病程度烤煙表觀光能利用率的變化特征

3 討論

本研究在3個(gè)典型黑脛病危害煙區(qū)，參照黑脛病病害調(diào)查方法對(duì)田間自然發(fā)病煙株進(jìn)行發(fā)病程度劃分，在田間自然發(fā)病條件下探討不同發(fā)病程度煙株抗氧化酶活性和光合特性的差異，旨在最大程度減少人為干擾，避免實(shí)驗(yàn)室人工接種等方法對(duì)結(jié)果的影響，更真實(shí)呈現(xiàn)田間發(fā)病煙株?duì)顩r及不同程度發(fā)病煙株體內(nèi)抗氧化酶活性和光合特性的差異，以期為豐富煙株抗病機(jī)理和今后防治黑脛病提供必要的理論支撐。

圖7 不同黑脛病發(fā)病程度烤煙表觀CO2利用效率變化特征

外界脅迫會(huì)誘發(fā)植株自身防御系統(tǒng)的積極響應(yīng)，其中植株保護(hù)酶系統(tǒng)在其中扮演著重要角色[19]。當(dāng)受到病原菌入侵時(shí)，煙株體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧，造成膜系統(tǒng)的損傷，同時(shí)煙株也可以通過調(diào)動(dòng)保護(hù)酶以抵御和清除活性氧，抵制膜脂過氧化，維持膜系統(tǒng)的穩(wěn)定[20-21]。SOD、POD和PPO是植物在逆境條件下酶促防御系統(tǒng)的關(guān)鍵酶，可作為表征植物抗逆性的指標(biāo)[22-23]。MDA是植物在逆境環(huán)境下膜脂過氧化作用的最終產(chǎn)物，其含量是膜脂過氧化程度的重要標(biāo)志[24-25]，與細(xì)胞膜的損害程度直接相關(guān)，其含量的多少可以反映出細(xì)胞受到脅迫程度的高低以及煙株抗逆能力的強(qiáng)弱[26]。因此，探討不同發(fā)病條件下植株抗氧化酶活性的差異具有重要意義。在對(duì)青枯菌與赤星病菌侵染煙草的研究中發(fā)現(xiàn)，受侵染植株葉片POD活性均高于正常植株[6，27]；王戈等[3]的試驗(yàn)也表明，黑脛病病菌侵染烤煙品種紅花大金元后，POD活性先上升后降低，與本試驗(yàn)研究結(jié)果相同，這可能是因?yàn)殡S著黑脛病發(fā)病程度的加重，細(xì)胞中積累了大量的活性氧，紅花大金元為易感黑脛病品種，對(duì)黑脛病入侵表現(xiàn)出的敏感性較低，POD含量雖然隨之增加，但并未將其及時(shí)清理，最終導(dǎo)致細(xì)胞膜系統(tǒng)受到損害。對(duì)根黑腐病侵染辣椒的研究發(fā)現(xiàn)[28]，辣椒多酚氧化酶活性隨著病菌的入侵先上升再下降，與本試驗(yàn)研究結(jié)果一致，這可能是在發(fā)病后期，植株根系多數(shù)死亡造成的。本試驗(yàn)結(jié)果表明，SOD活性先上升再下降，在輕微發(fā)病時(shí)達(dá)到最高值，這與匡傳富[29]和房保海等[30]的研究結(jié)果一致，這可能是由于病菌的入侵造成了活性氧的積累，活性氧有利于激活和調(diào)控?zé)煵蒹w內(nèi)各種防御相關(guān)基因的表達(dá)[31]，接種后紅花大金元SOD活性快速上升，這種高活性水平的SOD可以清除植物和病原物親和性互作產(chǎn)生的O2-，即紅花大金元受到病原物侵染后不發(fā)生過敏性反應(yīng)，病原物可以在寄主內(nèi)擴(kuò)展，爾后隨著發(fā)病程度的加重，植株正常生理代謝受到影響，SOD活性降低。江彤等[4]通過對(duì)黑脛病菌侵染抗病煙草品種K326的研究表明，MDA含量會(huì)隨時(shí)間的延長(zhǎng)而降低。但本試驗(yàn)結(jié)果顯示，丙二醛含量呈現(xiàn)持續(xù)上升趨勢(shì)，原因是植株在受到黑脛病菌侵染后，寄主體內(nèi)SOD、CAT活性較低，導(dǎo)致O2-、H2O2大量積累，進(jìn)一步啟動(dòng)膜脂過氧化作用，使得MDA含量上升，而品種K326對(duì)黑脛病抗病能力強(qiáng)，隨著時(shí)間的推移，入侵的黑脛病菌被植株免疫系統(tǒng)清除，MDA含量隨之下降，而本試驗(yàn)選用的品種紅花大金元對(duì)黑脛病抗性低，植株無法清除入侵的黑脛病菌，MDA含量持續(xù)增高。本研究中，煙株感染黑脛病后，體內(nèi)抗氧化酶活性發(fā)生明顯變化，說明在病原菌的誘導(dǎo)下，植株體內(nèi)活性氧產(chǎn)生和消除機(jī)制遭到破壞，大量活性氧積累誘發(fā)了抗氧化酶活性激增以此提高抗氧化能力，這也與王戈[3]的研究結(jié)果一致。

光照是植物進(jìn)行光合作用的基礎(chǔ)，影響著植物在光合作用過程中同化力形成所需的能量、光合作用關(guān)鍵酶的活化、氣孔的開放以及調(diào)節(jié)光合機(jī)構(gòu)的發(fā)育[8]。通過光合儀進(jìn)行光合響應(yīng)曲線的測(cè)定對(duì)研究植物生長(zhǎng)規(guī)律及光合效率特征具有重要作用[32]。常用的光響應(yīng)曲線擬合的模型主要有直角雙曲線、非直角雙曲線、雙曲線修正與指數(shù)模型[33]，但前人研究結(jié)果表明，在烤煙[34]、小麥[35]、玉米[36]上雙曲線修正模型擬合效果最好，故本研究基于雙曲線修正模型研究了不同黑脛病發(fā)病程度烤煙光合特性差異。

一般認(rèn)為，病害脅迫引起植物光合作用下降的影響因素主要包括兩類，由于氣孔的部分關(guān)閉導(dǎo)致的氣孔因素和葉肉細(xì)胞光合活性的下降導(dǎo)致的非氣孔限制因素。Farquhar認(rèn)為，在氣孔導(dǎo)度下降，而胞間CO2濃度維持不變甚至上升的情況下，葉肉細(xì)胞同化能力降低等非氣孔因素是引起光合速率下降的主要原因[37]。本研究結(jié)果表明，隨著黑脛病發(fā)病程度的增加，植株氣孔導(dǎo)度和凈光合速率下降，胞間CO2濃度升高，說明隨著黑脛病發(fā)病程度的增加，凈光合速率的下降是由于非氣孔因素導(dǎo)致的，這與柯思佳的研究結(jié)果一致[7]。同時(shí)，本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，隨著黑脛病發(fā)病程度的增加，Rd值相應(yīng)升高，這可能是由于煙草植株?duì)I養(yǎng)物質(zhì)被病菌消耗，加劇了烤煙消耗自身物質(zhì)，不利于干物質(zhì)的積累。胞間CO2濃度與氣孔導(dǎo)度顯示，隨著烤煙黑脛病發(fā)病程度的逐步加重，胞間CO2濃度與氣孔導(dǎo)度均逐漸降低，氣孔限制值增加，這可能是因?yàn)楹诿劜《舅貫槎嘣肴樘侨┟?，該酶能夠分解寄主?xì)胞的中膠層和導(dǎo)管壁，產(chǎn)生果膠產(chǎn)物碎塊，從而阻塞煙株根部水分的上升[38]，從而使烤煙植株水分傳輸能力和水氣交換能力降低，對(duì)水分的利用能力降低，有機(jī)物合成減少[39]?？緹煹谋碛^光能利用率和表觀CO2與植株光合作用強(qiáng)度也有緊密的關(guān)系。表觀光能利用率與CO2利用率隨著黑脛病發(fā)病程度的加重而降低，這可能由于黑脛病發(fā)病時(shí)莖、葉上形成大量病斑，煙株下垂，甚至干枯壞死，導(dǎo)致植株利用光能和CO2能力降低。

綜合來看，前人[40-41]通過接種病菌的方式對(duì)煙草葉片酶活性及光合特性的變化進(jìn)行了深入的研究，但均止步于接種實(shí)驗(yàn)受酶活性及光合特性的影響，人工創(chuàng)傷接種時(shí)會(huì)損傷莖表皮，不利于烤煙抗病性的表現(xiàn)且并不能真實(shí)反映出病菌在自然條件下對(duì)烤煙生長(zhǎng)發(fā)育的影響。本試驗(yàn)在大田中對(duì)不同發(fā)病程度煙株進(jìn)行取樣，更接近烤煙自然生長(zhǎng)狀態(tài)，更能準(zhǔn)確地反映不同發(fā)病狀態(tài)下烤煙生長(zhǎng)狀態(tài)的差異。本文只研究了易感黑脛病烤煙品種紅花大金元葉片酶活性及光合特性對(duì)不同黑脛病發(fā)病程度的響應(yīng)差異，但其他烤煙品種對(duì)不同黑脛病發(fā)病程度的響應(yīng)可能不同，這也可能是不同品種抗黑脛病能力較強(qiáng)的原因，因此，品種間對(duì)不同黑脛病發(fā)病程度響應(yīng)的差異有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

試驗(yàn)結(jié)果表明，不同發(fā)病程度煙株煙葉抗氧化酶活性存在較大差異，其中POD與SOD活性隨著黑脛病發(fā)病程度的加重表現(xiàn)為先增高后降低的趨勢(shì)，PPO活性與MAD含量均隨黑脛病發(fā)病程度的增加呈持續(xù)上升趨勢(shì)。黑脛病侵染烤煙植株顯著抑制了光合作用，降低了植株利用光能和CO2的能力。