朱美君

肺炎是常見的兒童疾病之一，患兒主要出現(xiàn)發(fā)熱、干咳、咳痰等臨床癥狀[1]。近年來支原體肺炎的發(fā)病率逐漸升高，發(fā)病急、病情重。臨床上肺炎支原體(Mycoplasma pneumoniae，MP)引起的呼吸系統(tǒng)疾病不易與其他病原體區(qū)分，為臨床診治帶來一定挑戰(zhàn)。MP無細(xì)胞壁，對(duì)糖肽類、β-內(nèi)酰胺類藥物具有天然抗性，目前對(duì)于MP的治療主要采用紅霉素、克拉霉素、羅紅霉素、阿奇霉素等，但由于近年來大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的濫用，MP菌株對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類藥物出現(xiàn)明顯的耐藥性[2]。MP臨床分離培養(yǎng)較為困難，目前關(guān)于MP的耐藥性機(jī)制尚不完全清楚。研究報(bào)道，耐藥MP引起患兒治療時(shí)間及臨床癥狀持續(xù)時(shí)間延長(zhǎng)，耐藥MP與患兒的臨床預(yù)后具有一定的相關(guān)性[3]。但關(guān)于耐藥MP-DNA拷貝量是否與臨床預(yù)后相關(guān)則未見報(bào)道，本文通過檢測(cè)耐藥MP-DNA拷貝量，分析其與臨床預(yù)后的相關(guān)性。

資料與方法

一、一般資料

2017年12月至2018年12月于本院兒科就診的合并發(fā)熱或(和)咳嗽，且1年內(nèi)反復(fù)MP感染且不規(guī)律應(yīng)用大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物≥2次的110例患兒納入研究組?；純褐心?6例，女44例，年齡1～8歲，平均(6.30±1.24)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡1～8歲，患者入院前未進(jìn)行抗生素、免疫抑制劑等治療；②患兒肺部有濕啰音或哮鳴音；③患兒依從性好，家屬知情同意；④本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①患有免疫缺陷性疾病患兒；②患有肺結(jié)核或者哮喘等呼吸系統(tǒng)疾病者；③阿奇霉素過敏或者有嚴(yán)重反應(yīng)不良患兒；④伴有先天性疾病患兒。

二、方法

1 MP培養(yǎng)及藥敏試驗(yàn) 用無菌棉拭子在患兒咽喉部捻轉(zhuǎn)數(shù)次采集咽拭子標(biāo)本，把被檢測(cè)的棉拭子置于含有快速M(fèi)P培養(yǎng)基的分離培養(yǎng)瓶中，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。陽性判斷：MP繁殖過程中分解糖類，形成 H+，引起培養(yǎng)基的pH值降低，指示劑顏色由紅色變?yōu)辄S色；陰性：培養(yǎng)基顏色變渾濁或者保持不變。本次藥敏試驗(yàn)共檢測(cè)5種抗菌藥物(紅霉素、羅紅霉素、阿奇霉素、克拉霉素、加替沙星)，根據(jù)藥物濃度由高到低，于體外對(duì)MP抑制抗菌藥物作用進(jìn)行病原體耐藥性分析。

實(shí)驗(yàn)步驟：取1支分裝的阿奇霉素干粉培養(yǎng)基，加入1.5 mL無菌水溶解；在藥敏陰性孔中加入50 uL培養(yǎng)基，將采集的MP標(biāo)本咽拭子在培養(yǎng)基中攪動(dòng)數(shù)次，取50 uL含有MP標(biāo)本的培養(yǎng)液加入藥敏板，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。藥敏試驗(yàn)判定標(biāo)準(zhǔn)[4]：MP培養(yǎng)基上C孔為澄清藍(lán)色，則為MP陽性(+)；C孔培養(yǎng)基不變，則為MP陰性(-)。藥物敏感：A、B孔MP均為陰性(-)；重度敏感：A孔MP為陰性(-)、B孔MP為陽性(+)；耐藥：A孔MP為陽性(+)、B孔MP為陽性(+)。重度敏感按照敏感進(jìn)行處理。

2 療效判定標(biāo)準(zhǔn) 依據(jù)國(guó)家衛(wèi)生計(jì)生委辦公廳、國(guó)家中醫(yī)藥管理局辦公室、解放軍總后勤部衛(wèi)生部藥品器材局發(fā)布的《抗菌藥物臨床應(yīng)用指導(dǎo)原則(2015年版)》[5]將治療效果分為無效、進(jìn)展、顯效、痊愈4級(jí)。有效率=(顯效例數(shù)+痊愈例數(shù))/總例數(shù)×100%。

3 熒光定量PCR 采用高溫消毒的吸痰器于患兒咽部吸取痰液1～3 mL置于無菌試管中；4倍體積4%的NaOH室溫消化30min，取1 mL至離心管中，加入濃縮液100 uL，12000r/min離心5min，棄上清，沉淀中加入50 uL核酸釋放劑；加50 uL DNA提取液于MP-DNA檢測(cè)管中，于ABI7500 Real Time 熒光定量PCR儀中檢測(cè)MP-DNA載量，依據(jù)試劑盒說明書分析檢測(cè)結(jié)果。

4 血清炎癥因子的檢測(cè) 采集患兒入院第二天清晨空腹血液，分離血清，IL-6、PCT采用ELISA法測(cè)定，hs-CRP采用免疫比濁法測(cè)定，BECKMAN CUNLTER GENS 全自動(dòng)無分類血細(xì)胞分析儀檢測(cè)白細(xì)胞總數(shù)、丹麥全自動(dòng)血沉儀檢測(cè)血沉。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、肺炎支原體陽性率、藥敏試驗(yàn)及測(cè)序結(jié)果

經(jīng)過檢測(cè)顯示，110例研究組中MP陽性感染患兒42例，陽性率38.18%。42例紅霉素、羅紅霉素、阿奇霉素、克拉霉素、加替沙星的敏感性及耐藥性分析(見表1)。42例MP陽性中27例阿奇霉素敏感，15例耐藥。阿奇霉素耐藥15例患兒中，1年內(nèi)阿奇霉素不規(guī)律使用2次的有2例，3次的有4例，4次的有9例，隨著不規(guī)律用藥次數(shù)的增加，耐藥比例顯著增加(P<0.05)(見表2)。

表1 42例MP陽性感染患兒的耐藥性分析 [n(%)]

表2 1年內(nèi)不規(guī)律阿奇霉素用藥次數(shù)及耐藥率分析 [n(%)]

二、治療效果及預(yù)后恢復(fù)情況的比較

根據(jù)MP耐藥情況將患兒分為耐藥組(27例)和敏感組(15例)，其中耐藥組治療2周后治愈率為59.26%(17/27)；4周后治愈率為77.78%(21/27)；敏感組治療2周后治愈率為100%(15/15)；耐藥組發(fā)熱時(shí)間、住院時(shí)間均高于敏感組(P<0.05)(見表3)。

表3 治療效果比較

三、各組MP-DNA拷貝量的比較

兩組MP-DNA拷貝量比較顯示，耐藥組MP-DNA水平顯著高于敏感組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見表4)。

表4 MP-DNA拷貝量比較

四、各組炎癥因子的比較

各組炎癥因子比較顯示，耐藥組血清hs-CRP、IL-6水平顯著高于敏感組，白細(xì)胞總數(shù)、PCT、血沉與敏感組比較無顯著差異(P<0.05)(見表5)。

表5 各組炎癥因子及恢復(fù)情況的比較

五、Logistic回歸分析影響耐藥肺炎支原體感染患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素

單因素分析發(fā)現(xiàn)，MP-DNA、hs-CRP、IL-6是影響耐藥肺炎支原體感染患者預(yù)后的危險(xiǎn)因子(P<0.05)。多因素分析發(fā)現(xiàn)，MP-DNA、hs-CRP是影響耐藥肺炎支原體感染患者不良預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)(見表6)。

表6 Logistic多因素回歸分析影響患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素

討 論

MP感染是臨床常見的兒童疾病之一，MP感染引起人肺A549上皮細(xì)胞黏蛋白表達(dá)增加，引起患兒痰液黏稠，氣道內(nèi)黏液分泌物明顯增多、壅塞，常表現(xiàn)為大葉性肺炎[6]。MP感染除引起肺部癥狀外，還引起肺外多系統(tǒng)并發(fā)癥，包括胃腸道反應(yīng)、過敏反應(yīng)等，部分患兒甚至出現(xiàn)多器官功能障礙或衰竭[7]。MP因?yàn)槿狈?xì)胞壁，天然耐藥頭孢類抗生素、青霉素，但對(duì)四環(huán)素類、喹諾酮類、大環(huán)內(nèi)酯藥物敏感，兒童處于生長(zhǎng)發(fā)育、骨骼形成階段，限制四環(huán)素類、喹諾酮類藥物在兒童中的應(yīng)用，所以治療兒童MP常用大環(huán)內(nèi)酯類藥物[8]。阿奇霉素是大環(huán)內(nèi)酯類的一種，主要發(fā)揮抑菌、抗炎等作用，其組織滲透性較好，對(duì)肺部感染組織的治療較好，臨床常用阿奇霉素序貫法治療兒童MP[9]。目前數(shù)據(jù)顯示，我國(guó)兒童及成年患者中分離的MP菌株對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類具有較高耐藥性，因此研究耐藥MP患兒對(duì)臨床治療及預(yù)后具有重要意義。

趙熙婷等研究報(bào)道，阿奇霉素序貫法對(duì)耐藥性MP治療效果良好[10]。本研究中采用阿奇霉素序貫法治療2周后，多數(shù)患兒痊愈，與上述報(bào)道結(jié)果相似，提示阿奇霉素序貫法治療可用于兒童MP感染。王亞坤等研究報(bào)道，耐藥MP患兒的治療時(shí)間及病程均有所延長(zhǎng)[11]。劉會(huì)彩等研究報(bào)道，大環(huán)內(nèi)酯類治療耐藥MP退熱時(shí)間較敏感株延長(zhǎng)，總發(fā)熱時(shí)間較敏感株也延長(zhǎng)[12]。本研究顯示，耐藥組治愈率低于敏感組，耐藥組治療時(shí)間和退熱時(shí)間均顯著高于敏感組，提示耐藥MP可對(duì)治療效果及臨床預(yù)后具有一定影響，與上述研究結(jié)果一致。

MP通過免疫學(xué)機(jī)制產(chǎn)生致病作用，MP感染機(jī)體后引起抗原抗體結(jié)合，激活補(bǔ)體，產(chǎn)生中性粒細(xì)胞趨化因子，大量白細(xì)胞聚集在病變部位，引起組織增生或者破壞性病變[13]。CRP是典型的急性期時(shí)相蛋白，是介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的重要炎癥因子，并且通過與炎癥損傷細(xì)胞暴露的磷脂結(jié)合啟動(dòng)免疫應(yīng)答[14]。PCT是甲狀腺分泌的降鈣素前體物質(zhì)，機(jī)體正常狀態(tài)下只存在少量，但當(dāng)機(jī)體感染時(shí)PCT水平則會(huì)顯著升高[15]。研究顯示PCT與細(xì)菌感染程度呈正相關(guān)。IL-6是MP反應(yīng)中的重要炎癥因子，在細(xì)胞免疫和體液免疫中發(fā)揮重要作用，研究顯示，IL-6在炎癥反應(yīng)早期異常增高，誘導(dǎo)T細(xì)胞分化，促進(jìn)炎癥因子的分泌，IL-6水平可能與MP感染的嚴(yán)重程度和臨床預(yù)后相關(guān)[16]。本研究中耐藥組患兒血清hs-CRP、IL-6水平顯著高于對(duì)照組，白細(xì)胞數(shù)、PCT也高于對(duì)照組，與上述研究結(jié)果一致，炎性因子水平的升高可能與耐藥MP表面的基因型變化，免疫損傷和炎癥反應(yīng)持續(xù)時(shí)間延長(zhǎng)相關(guān)。

MP-DNA拷貝量客觀反映了MP與宿主免疫清除能力之間的平衡。研究報(bào)道，MP核糖體23S r RNA V區(qū)2063位基因型的改變，引起敏感株的增殖受到抑制，而耐藥株的增殖不受抑制，進(jìn)而引起感染患者M(jìn)P-DNA拷貝量的差異；且MP核糖體23S r RNA V區(qū)2063位基因型改變引起抗生素與核糖體親和力改變[4]。本研究中耐藥菌組患兒MP-DNA拷貝量顯著高于敏感組，且耐藥株2周治愈率低于敏感組，治療時(shí)間高于敏感組，這可能與敏感組MP增殖力減弱、抗生素親和力降低有關(guān)。COX多因素回歸分析顯示，MP-DNA、hs-CRP是影響耐藥肺炎支原體感染患者不良預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，提示可根據(jù)患者M(jìn)P-DNA拷貝量、hs-CRP水平采取合適的治療方法進(jìn)一步改善患者預(yù)后情況。

綜上所述，耐藥組患兒MP-DNA拷貝量高于敏感組MP-DNA拷貝量，且是影響臨床預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一。但關(guān)于耐藥MP-DNA拷貝量與臨床預(yù)后的具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。