鄧明慧，馮 玉，路 娟，柴瑞平，趙 穎，俞 月，呂欣鍇，陳 曦,，李海濤

（1.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250355；2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所，北京100193；3.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所云南分所，云南 景洪 666100）

桑葉為?？浦参锷＃∕orus albaL.）的干燥葉，性味甘、苦、寒，歸肺、肝經(jīng)，具有疏散風(fēng)熱，清肺潤(rùn)燥，清肝明目的功效，用于風(fēng)熱感冒，肺熱燥咳，頭暈頭痛，目赤昏花等癥[1]。桑葉藥用始載于《五十二病方》[2]。桑葉產(chǎn)地豐富，我國(guó)東北、西南、西北各省區(qū)均有栽培，中亞各國(guó)、歐洲、印度等地均有栽培[3]。桑葉中含黃酮類、酚酸類、生物堿類、香豆素類、氨基酸、多糖等化學(xué)成分[4-10]，其中多種成分具有良好生物活性?，F(xiàn)代藥理研究表明，桑葉具有抗炎、降低毛細(xì)血管脆性、降血壓、抗氧化、抗腫瘤、抗病毒、抗過(guò)敏、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗脂質(zhì)過(guò)氧化等作用[4-10]，蘆丁、紫云英苷具有抗炎、抗氧化作用；異槲皮苷具有降壓、抗炎、抗氧化、抗抑郁作用；綠原酸具有清除自由基、抗脂質(zhì)過(guò)氧化、抗菌、抗病毒、抗誘變等作用[11-14]。中藥的活性成分是多個(gè)成分的復(fù)合體，2015 年版《中國(guó)藥典》中桑葉指標(biāo)成分為蘆丁[1]，未測(cè)定其他成分含量，但單一成分無(wú)法全面反映桑葉整體質(zhì)量。本研究采用超高效液相色譜（UPLC）測(cè)定不同產(chǎn)地新綠原酸、隱綠原酸、綠原酸、蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷6種活性成分的含量，為桑葉質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)控制和含桑葉的成藥制劑質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Waters UPLC H-Class系統(tǒng)，含四元溶劑泵、自動(dòng)進(jìn)樣裝置、在線真空脫氣裝置、PDA檢測(cè)器、Empower 2色譜工作站（美國(guó)沃特世）；AB265-S分析天平（瑞士Mettler公司）；KQ-250E型超聲波清洗器（昆山超聲儀器公司）；高速萬(wàn)能粉碎機(jī)（上海頂帥電器有限公司）。

1.2 試藥

新綠原酸（批號(hào)：170916），隱綠原酸 （批號(hào)：171016），蘆?。ㄅ?hào)：160423），綠原酸（批號(hào)：180301），異槲皮苷（批號(hào)：160730），紫云英苷（批號(hào)：190503，上海融合醫(yī)藥技術(shù)有限公司）；乙腈（德國(guó)Merck），磷酸（阿拉?。鶠樯V純；蒸餾水（屈臣氏）。

桑葉藥材為藥材市場(chǎng)、藥店購(gòu)買，經(jīng)中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所云南分所李海濤教授鑒定均為桑（Morus albaL.）干燥葉。標(biāo)本保存于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所化學(xué)樓106室。樣品信息見(jiàn)表1。

表1 桑葉樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性

BEH shield RP18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；以乙腈（A）-0.1 %磷酸（B）為流動(dòng)相，梯度洗脫：0～2.5 min，15 %～16 %A；2.5～2.6 min，16 %～25 %A；2.6～7 min，25 %～27 %A；7～8 min，27 %A～100 %A。流速0.3 ml/min，柱溫40 ℃，進(jìn)樣量2 μl，檢測(cè)波長(zhǎng)0～3 min 325 nm，3～8 min 358 nm。結(jié)果新綠原酸、隱綠原酸、綠原酸、蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷各峰之間分離度良好，分離度均＞1.5，理論板數(shù)按蘆丁峰計(jì)算＞100 000。對(duì)照品溶液與供試品溶液的UPLC圖譜見(jiàn)圖1。

圖1 對(duì)照品溶液與供試品溶液的UPLC色圖譜

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液的制備 桑葉粉碎，過(guò)60目篩，取約0.5 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入70 %甲醇25 ml，稱定重量，90 ℃回流提取30 min，放冷，再次稱定重量，用70 %甲醇補(bǔ)足補(bǔ)減矢的重量，搖勻，濾過(guò)，續(xù)濾液過(guò)0.22 μm微孔濾膜，即得。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取新綠原酸、隱綠原酸、綠原酸、蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷對(duì)照品適量，用70 %甲醇溶解定容，配制成濃度為1 mg/ml的對(duì)照品貯備溶液。分別精密吸取新綠原酸對(duì)照品貯備溶液0.8 ml、隱綠原酸對(duì)照品貯備溶液1 ml、綠原酸對(duì)照品貯備溶液1.2 ml、蘆丁對(duì)照品貯備溶液0.6 ml、異槲皮苷對(duì)照品貯備溶液0.6 ml、紫云英苷對(duì)照品貯備溶液0.15 ml，置10 ml量瓶中，加70 %甲醇定容，制得新綠原酸80 μg/ml、隱綠原酸100 μg/ml、綠原酸120 μg/ml、蘆丁60 μg/ml、異槲皮苷60 μg/ml、紫云英苷15 μg/ml混合對(duì)照品溶液，4 ℃存放備用，測(cè)定前使用 0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系考察 分別吸取2.2.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1 ml于1 ml量瓶，用70 %甲醇逐級(jí)稀釋成不同濃度的混合對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣2 μl，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，以相應(yīng)的對(duì)照品質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程。見(jiàn)表2。

2.3.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取供試品溶液，按2.1項(xiàng)色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積。結(jié)果新綠原酸、隱綠原酸、綠原酸、蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷峰面積的RSD分別為2.8 %，2.2 %，1.5 %，1.5 %，2.1 %，1.8 %。結(jié)果表明精密度良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取桑葉供試品溶液，按2.1項(xiàng)色譜條件，分別于 0，2，4，6，8 ，12，24 h 測(cè)定峰面積。根據(jù)峰面積，計(jì)算各成分含量。樣品中新綠原酸、隱綠原酸、綠原酸、蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷含量RSD分別為 2.4 %，2.2 %，1.7 %，1.6 %，1.8 %，2.1 %，表明樣品溶液在 24 h 內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取桑葉樣品，按 2.2.1項(xiàng)下方法平行制備 6 份溶液，按2.1 項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣分析，結(jié)果新綠原酸、隱綠原酸、綠原酸、蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷含量RSD分別為 1.7 %，1.5 %，1.6 %，2.1 %，2.7 %，1.8 %。結(jié)果表明方法重復(fù)性良好。

2.3.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取桑葉粉末 0.25 g，平行6份，分別精密加入新綠原酸、隱綠原酸、綠原酸、蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷對(duì)照品甲醇溶液（濃度分別為0.4000，0.5000，1.5000，0.6000，0.7000，0.3000 mg/ml）1 ml，按 2.2.1項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)色譜條件測(cè)定各成分含量，計(jì)算平均加樣回收率和RSD值，見(jiàn)表3。

2.4 樣品含量測(cè)定

分別精密稱取不同產(chǎn)地的桑葉，按 2.2.1項(xiàng)方法制備供試品溶液，平行3份，按2.1項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，計(jì)算新綠原酸、隱綠原酸、綠原酸、蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷的含量。結(jié)果見(jiàn)表4。

表3 桑葉加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

表4 11批桑葉6種成分含量

3 結(jié)論

中藥的活性成分是多個(gè)成分的復(fù)合體。桑葉現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中含量測(cè)定中僅對(duì)單一黃酮類成分蘆丁進(jìn)行了含量控制，而未控制對(duì)其他成分的量，不能真實(shí)反映桑葉質(zhì)量?jī)?yōu)劣。本試驗(yàn)建立的 UPLC 法具有快速，靈敏，重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，能準(zhǔn)確測(cè)定桑葉中6種黃酮類、酚酸類成分，初步判別桑葉藥材質(zhì)量，為桑葉質(zhì)量控制的進(jìn)一步完善提供依據(jù)。