查祎凡，聶黎行，于健東，張 毅，戴 忠，馬雙成

（1.中國食品藥品檢定研究院，北京 100050；2.中國藥科大學(xué)，江蘇 南京 211198；3.重慶市食品藥品檢驗(yàn)檢測研究院，重慶 401121）

牛黃清胃丸收載于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑第一冊》，由牛黃、大黃、菊花、麥冬、薄荷、石膏、梔子、玄參、番瀉葉、黃芩、甘草、冰片等17味中藥組成，具有清胃瀉火、潤燥通便的作用，用于心胃火盛，頭暈?zāi)垦?，口舌生瘡，牙齦腫痛，乳蛾咽痛，便秘尿赤[1]?，F(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)收載于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑第一冊》，除性狀外，僅收載了顯微鑒別項(xiàng)。制劑中的黃柏為臣藥，輔助牛黃清瀉胃熱的功效，鹽酸小檗堿是其主要活性成分[2-4]。本文創(chuàng)新性地將對照制劑引入中成藥的質(zhì)量評價(jià)，建立了超高效液相色譜（UPLC）測定牛黃清胃丸中鹽酸小檗堿含量的方法，同時研制了牛黃清胃丸對照制劑，對其在生產(chǎn)過程中黃柏的轉(zhuǎn)移進(jìn)行了考察，提出了相對客觀、可行的限度，可望為含黃柏原粉制劑的質(zhì)量優(yōu)劣區(qū)分提供示范和參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

AE240（十萬分之一）電子天平，F(xiàn)X-200（萬分之一）電子天平（瑞士Mettle Toledo公司）；ACQUITY UPLC 超高效液相色譜儀，Empower工作站（美國Waters公司）；Milli-Q型超純水處理系統(tǒng)（美國Millipore公司）。

1.2 材料

分析純甲醇，鹽酸（北京化學(xué)試劑公司）；硅藻土（北京化學(xué)試劑公司）。乙腈（色譜純，德國 Merck 公司）；水為超純水；鹽酸小檗堿對照品（批號：110713-201814），人工牛黃對照藥材（批號：121197-201204），大黃對照藥材（批號：120902-201311），菊花對照藥材（批號：121384-201504），麥冬對照藥材（批號：121013-201310），薄荷對照藥材（批號：120916-201310），梔子對照藥材（批號：120986-201610），玄參對照藥材（批號：121008-201609），番瀉葉對照藥材（批號：120996-201205），黃芩對照藥材（批號：120955-201309），甘草對照藥材（批號：120904-201620），桔梗對照藥材（批號：121028-201612），連翹對照藥材（批號：120908-201216），冰片對照品（批號：111688-201602），牽牛子對照藥材（批號：121024-201606），枳實(shí)對照藥材（批號：120936-201606，中國食品藥品檢定研究院）；石膏（北京華邈藥業(yè)），由中國食品藥品檢定研究院聶黎行副研究員鑒定為石膏；牛黃清胃丸對照制劑由中國食品藥品檢定研究院按大生產(chǎn)規(guī)模自行研制，其中黃柏原料來自北京同仁堂潤豐醫(yī)藥有限公司；煉蜜（北京同仁堂股份有限公司同仁堂制藥廠）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性

色譜柱：AQUITY UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；檢測波長：265 nm；柱溫：35 ℃；流速：0.2 ml/min；進(jìn)樣量：2 μl；流動相：乙腈-水（每100 ml加十二烷基硫酸鈉0.2 g）（50:50，v/v，用磷酸調(diào)pH至2）。上述色譜條件下，理論板數(shù)以鹽酸小檗堿峰計(jì)應(yīng)不少于5000，與相鄰峰分離度應(yīng)＞1.5。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液制備 取鹽酸小檗堿對照品適量，精密稱定，加1 %鹽酸甲醇制成每1 ml含0.12 mg的溶液，作為對照品儲備液。分別精密量取對照品儲備液適量，逐級稀釋制得濃度分別為0.01，0.02，0.03，0.04，0.05 mg/ml的系列對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液制備 取牛黃清胃丸1.0 g，精密加入1 %鹽酸甲醇50 ml，85 ℃加熱回流1 h，放冷，用1 %鹽酸甲醇溶液補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性對照溶液 取人工牛黃、大黃、菊花、麥冬、薄荷、梔子、玄參、番瀉葉、黃芩、甘草、桔梗、連翹、牽牛子、枳實(shí)對照藥材，冰片對照品，石膏，按處方比例制備缺黃柏的陰性空白樣品，并按2.2.2項(xiàng)下方法制成陰性對照溶液。

2.3 測定法

取系列對照品溶液和供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定供試品中鹽酸小檗堿的含量。

2.4 專屬性試驗(yàn)

取2.2項(xiàng)下對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液適量，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜，詳見圖1。結(jié)果表明，牛黃清胃丸在鹽酸小檗堿的保留時間處無其他成分干擾。

圖1 UPLC色譜圖

2.5 線性關(guān)系考察

分別精密量取對照儲備液適量，逐級稀釋制得濃度分別為0.02，0.04，0.06，0.08，0.12 mg/ml的系列對照品溶液，進(jìn)樣測定，以濃度為橫坐標(biāo)x，峰面積為縱坐標(biāo)y，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行線性回歸，結(jié)果鹽酸小檗堿在0.02～0.12 mg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為y=2.42×107x-7.40×105，相關(guān)系數(shù)（r）為0.9999。

2.6 定量限與檢出限

取精密量取濃度為1 mg/L的對照品溶液適量，稀釋至不同濃度，進(jìn)樣測定，測得檢出限（信噪比3:1）為0.22 μg/ml，定量限（信噪比10:1）為0.90 μg/ml。

2.7 精密度試驗(yàn)

精密吸取2.2.1項(xiàng)下對照品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，測定鹽酸小檗堿的峰面積。結(jié)果，鹽酸小檗堿峰面積的RSD為2.23 %（n=6），表明儀器的精密度良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取牛黃清胃丸樣品（批號：17013549）適量，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，于室溫下放置，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，于室溫下放置0，1，2，4，6，8 h，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，測定鹽酸小檗堿的峰面積。結(jié)果，其峰面積的RSD為1.93 %（n=6），表明室溫條件下供試品溶液中的鹽酸小檗堿在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9 重復(fù)性試驗(yàn)

取牛黃清胃丸樣品（批號：17013549）適量，按2.2.2項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行含量測定。結(jié)果，鹽酸小檗堿的含量為1.46 mg/g，RSD為1.37 %（n=6），表明本方法的重復(fù)性良好。

2.10 加樣回收率試驗(yàn)

取鹽酸小檗堿對照品適量，精密稱定，加1 %鹽酸甲醇制成每1 ml含0.93 mg的溶液，分成6份，每份1 ml，分別置于圓底燒瓶中，低溫?fù)]干，取已知含量的牛黃清胃丸樣品（批號：17013549）內(nèi)容物約0.5 g，精密稱定6份，分別加入上述圓底燒瓶中，按2.2.2項(xiàng)下方法制得所需供試品溶液，再按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果詳見表1。

表1 牛黃清胃丸加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

表2 牛黃清胃丸樣品含量測定結(jié)果（n=2）

2.11 樣品含量測定

取49批牛黃清胃丸和1批對照制劑各適量，分別按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，測定鹽酸小檗堿的峰面積，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算含量，每批樣品平行操作2次，結(jié)果詳見表2。

2.12 基于對照制劑的等級限度制訂

根據(jù)《中國藥典》的規(guī)定、對照制劑和實(shí)測樣品的含量，對18個廠家、49批樣品進(jìn)行等級評定。為直觀顯示不同廠家各批次樣品鹽酸小檗堿的含量差異，做圖2。

圖2 牛黃清胃丸樣品含量測定結(jié)果

《中國藥典》2015年版一部規(guī)定黃柏“含小檗堿以鹽酸小檗堿計(jì)，不得少于3.0 %”，其中水分項(xiàng)規(guī)定“不得超過12.0 %”[5]。取牛黃清胃丸對照制劑投料用黃柏，依法測定鹽酸小檗堿含量，結(jié)合對照制劑中鹽酸小檗堿含量及黃柏在處方中所占比例，計(jì)算得到牛黃清胃丸對照制劑中鹽酸小檗堿在生產(chǎn)過程中的轉(zhuǎn)移率為98 %。根據(jù)牛黃清胃丸中的黃柏藥材含量折算相對應(yīng)的鹽酸小檗堿理論含量，得二等制劑的鹽酸小檗堿限度為0.74 mg/g，即使用符合藥典規(guī)定的藥材足量投料應(yīng)達(dá)到的含量。暫定對照制劑鹽酸小檗堿含量的70 %（1.34 mg/g）為一等限度，即使用優(yōu)質(zhì)藥材足量投料達(dá)到的含量。按上述擬定限度判斷，所有批次樣品都達(dá)到二等限度，29批次樣品達(dá)到一等限度。

3 討論

3.1 提取溶劑的選擇

根據(jù)黃柏藥材與其他含黃柏的中成藥中鹽酸小檗堿含量測定的文獻(xiàn)[6-9]，采用甲醇、1 %甲酸和1 %鹽酸甲醇作為提取溶劑。結(jié)果表明，采用1 %鹽酸甲醇溶液作為提取溶劑時，提取效率最高，故選定1 %鹽酸甲醇溶液為本試驗(yàn)的提取溶劑。

3.2 提取方式的考察

對超聲和熱回流兩種提取方式進(jìn)行考察，結(jié)果顯示熱回流提取效率更高。對不同熱回流時間30，45，60，75 min進(jìn)行考察，75 min的提取效率相比60 min的提取效率不再顯著增加。故選擇熱回流60 min作為本試驗(yàn)的提取方式。對熱回流溫度進(jìn)行考察，結(jié)果顯示85 ℃下，提取溶劑能保持微沸狀態(tài)，冷凝管回流液體滴速適中。

3.3 測定方法的選擇

與傳統(tǒng)的HPLC相比，UPLC具有分離度高、檢測速度快、溶劑消耗少、靈敏度高的特點(diǎn)。由于本試驗(yàn)只測定一種成分的含量，故選擇UPLC，有利于減少分析時間與溶劑消耗，建立快速的測定方法。

3.4 色譜柱的選擇

因牛黃清胃丸處方量較大，成分干擾較多，參考其他文獻(xiàn)[10]，采用親水作用色譜對鹽酸小檗堿進(jìn)行含量測定。但由于提取溶劑酸性較強(qiáng)，導(dǎo)致親水作用色譜下鹽酸小檗堿色譜峰出現(xiàn)分叉，故無法選用。改用適用于較大pH范圍的反相色譜柱。

3.5 流動相的選擇

參考文獻(xiàn)[11]，選用0.5 %甲酸乙腈-0.5 %甲酸水作為流動相，結(jié)果發(fā)現(xiàn)鹽酸小檗堿峰形拖尾嚴(yán)重。參考文獻(xiàn)[12]，選用乙腈-0.05 mol/L KH2PO4（用磷酸調(diào)pH至3）作為流動相，在鹽酸小檗堿峰附近，基線不平穩(wěn)。參考文獻(xiàn)[13]，選用乙腈-水（每100 ml加十二烷基硫酸鈉0.2 g）（用磷酸調(diào)pH至3）作為流動相，基線平穩(wěn)，峰形較好，調(diào)整pH為2，分離效果最佳。

3.6 對照制劑的意義

中藥對照制劑作為中藥標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的新形式，系指采用道地、優(yōu)質(zhì)、規(guī)范加工的原料藥材（飲片）和輔料，嚴(yán)格按照制法和生產(chǎn)工藝規(guī)程，并遵循藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范制備的實(shí)物對照，主要用于中成藥的質(zhì)量控制，評價(jià)產(chǎn)品投料的真實(shí)性（是否投正確的原料）和投料量的可靠性（是否按處方量投料）[14]。將對照制劑引入中成藥等級評價(jià)限度的制訂，可得到藥材有效成分轉(zhuǎn)移率及相對優(yōu)質(zhì)制劑的含量等關(guān)鍵信息，保證限度設(shè)置的合理性。