余劍吟，廖有武，顧正清，朱 源

（江蘇大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013）

辣椒堿（capsaicin）是辣椒中含有的一種辛辣的生物堿成分[1]，來(lái)源于茄科植物辣椒的成熟果實(shí)，是常用的食品添加劑中的活性成分。在臨床上主要用于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等神經(jīng)性疼痛，可作為一種作用較溫和、副作用較少的超長(zhǎng)效止痛劑使用[2]。近年，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)辣椒堿具有抗炎[3]、抗氧化[4]、抗腫瘤[5]、減肥[6]等多種活性。但辣椒堿的刺激性、難溶性和吸收差成為其口服制劑開(kāi)發(fā)的瓶頸。已有報(bào)道表明，納米載體如脂質(zhì)體[7]、微乳[8]、納米膠束[9]的包覆作用可提高辣椒堿的口服吸收并降低其胃黏膜刺激性。羥基磷灰石（hydroxyapatite，HA）由鈣磷灰石自然礦物化形成，廣泛應(yīng)用于骨組織再生、修復(fù)、牙科整形及相關(guān)治療[10]，近年亦廣泛用作基因傳遞的非病毒載體[11]及抗腫瘤藥、抗生素、抗炎藥等藥物傳遞的緩控釋載體[12]?？诜﨟A作為蛋白質(zhì)、多肽類藥物的載體也有相關(guān)報(bào)道[13]。作為一種常見(jiàn)的無(wú)機(jī)材料，HA具有較好的降低辣椒堿刺激性的作用，但單一組分的HA存在脆性大、降解速度不易控制等缺點(diǎn)[14]。本文在制備納米HA的基礎(chǔ)上，將二氧化硅（SiO2）引入復(fù)合載體體系，通過(guò)SiO2包覆于載藥HA表面實(shí)現(xiàn)辣椒堿的控制釋放，同時(shí)考察該復(fù)合載體對(duì)于辣椒堿體內(nèi)外釋藥特性的影響，并考察SiO2用量對(duì)復(fù)合納米粒體系體內(nèi)外性質(zhì)的影響。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

BSA124S-CW電子天平（北京賽多利斯）；JY92-II型超聲波細(xì)胞粉粹機(jī)（寧波新芝）；低溫冷凍高速離心機(jī)（德國(guó)Hereaus公司）；DZF-6020型真空干燥箱（上海一恒）；HJ-6A六聯(lián)磁力加熱攪拌器（江蘇金壇佳美儀器廠）；THZ-82水浴恒溫振蕩器（江蘇金壇中大儀器廠）；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司）；Avatar 370傅立葉變換紅外光譜儀（美國(guó)Nicolet公司）；JSM-7001F掃描電鏡（日本電子公司）；D8 ADVANCEX-射線衍射儀（德國(guó)Bruker公司）；島津LC-20ATV高效液相色譜儀（日本島津公司）。

1.2 試藥

辣椒堿原料藥（上海遠(yuǎn)慕，批號(hào)：180821，含量＞95 %）；辣椒堿對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110839-201806，含量99 %）；硝酸鈣，磷酸，三乙醇胺，正硅酸四乙酯，無(wú)水乙醇，氨水，乙酸乙酯，環(huán)己烷等試劑（分析純，國(guó)藥集團(tuán)）；甲醇，乙腈（色譜純，國(guó)藥集團(tuán)）；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 負(fù)載辣椒堿的HA/SiO2復(fù)合納米粒的制備

2.1.1 納米HA的制備 稱取適量硝酸鈣[Ca(NO3)2·4H2O]置燒杯中，加水20 ml，超聲溶解，將超聲波探頭置于硝酸鈣水溶液中，超聲處理（功率：600 W，20 s/次，間隔3 s）20次，逐滴加入磷酸，使Ca:P（摩爾比）=1.67，繼續(xù)逐滴加入氨水10 ml，超聲處理20次，得乳白色混懸液，10 000 r/min離心10 min，所得沉淀用無(wú)水乙醇和水各洗滌3次，轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)皿中，加入少量水分散，置于真空干燥箱中（50 ℃，-100 kPa真空度）干燥，得粉末狀納米HA。

2.1.2 負(fù)載辣椒堿的HA/SiO2復(fù)合納米粒的制備 按2.1.1 項(xiàng)下工藝操作，加入適量磷酸后，逐滴加入溶解有2 g辣椒堿的無(wú)水乙醇-氨水（3:1）溶液40 ml，超聲處理20次，得乳白色混懸液。取混懸液15 ml，置100 ml三頸瓶中，65 ℃水浴，磁力攪拌下逐滴加入三乙醇胺0.45 ml，繼續(xù)滴加適量正硅酸四乙酯（TEOS），5 h后，10 000 r/min離心10 min，沉淀用水洗滌3次，轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)皿中，加入少量水分散，于真空干燥箱（50 ℃，-100 kPa真空度）干燥，得負(fù)載辣椒堿的HA/SiO2復(fù)合納米粒。為考察TEOS加入量對(duì)負(fù)載辣椒堿的HA/SiO2復(fù)合納米粒成形、釋藥行為及藥動(dòng)學(xué)特征的影響，制備時(shí)TEOS用量分別為3，7.5，15 ml，制得3種載辣椒堿的HA/SiO2復(fù)合納米粒，分別標(biāo)記為處方1、處方2、處方3。

2.2 載辣椒堿的HA/SiO2復(fù)合納米粒性質(zhì)評(píng)價(jià)

2.2.1 色譜條件 負(fù)載藥物的復(fù)合納米粒中藥物含量采用高效液相色譜（HPLC）測(cè)定，紫外檢測(cè)器檢測(cè)，具體色譜條件如下：色譜柱為Symmetry?C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動(dòng)相為甲醇-水（含0.1 % 磷酸）（70:30），流速為1.0 ml/min，柱溫為30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 取適量的辣椒堿對(duì)照品，精密稱定，用甲醇溶解后配制濃度分別為0.5，1.0，5.0，10.0， 25.0，50.0 μg/ml的辣椒堿對(duì)照品溶液。精密量取對(duì)照品溶液20 μl，注入效液相色譜儀中，記錄樣品峰面積。以辣椒堿峰面積為縱坐標(biāo)（Y），辣椒堿對(duì)照品溶液濃度為橫坐標(biāo)（X），最小二乘法進(jìn)行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=13 922X+467.76，線性范圍0.5～50 μg/ml，表明辣椒堿濃度與其HPLC峰面積有良好的線性關(guān)系（r=0.9999）。

2.2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.2.3.1 精密度試驗(yàn) 取辣椒堿對(duì)照品適量， 精密稱定，用甲醇溶解后配制濃度分別為1.0，25.0，50.0 μg/ml的辣椒堿對(duì)照品溶液。精密量取對(duì)照品溶液20 μl，注入效液相色譜儀。高、中、低3個(gè)濃度對(duì)照品溶液含量RSD分別為2.13 %，1.36 %，2.57 %（n=5），表明該方法精密度較好。

2.2.3.2 準(zhǔn)確度試驗(yàn) 取辣椒堿對(duì)照品適量， 精密稱定，用甲醇溶解后配制濃度分別為1.0，25.0，50.0 μg/ml的辣椒堿對(duì)照品溶液。精密量取對(duì)照品溶液20 μl，注入效液相色譜儀。測(cè)得高、中、低3個(gè)濃度對(duì)照品溶液的平均回收率分別為99.5 %±1.26 %，103.1 %± 1.92 %和99.1 %±1.44 %（n=5），RSD分別為1.27 %，1.86 %和1.45 %，表明該方法準(zhǔn)確度較高。

2.2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取辣椒堿對(duì)照品適量， 精密稱定，用甲醇溶解后配制濃度分別為1.0，25.0，50.0 μg/ml的辣椒堿對(duì)照品溶液。分別在0，2，4，8，12，24，36，48，72 h精密量取對(duì)照品溶液20 μl，注入效液相色譜儀。高、中、低3個(gè)濃度對(duì)照品溶液在72 h內(nèi)含量RSD分別為2.53 %，0.91 %，1.20 %，表明該方法穩(wěn)定性較好。

2.2.4 載藥量測(cè)定 取載辣椒堿HA/SiO2復(fù)合納米粒（處方1、處方2、處方3）各約50 mg，精密稱定，置于離心管中，分別加入甲醇3 ml、乙醇3 ml，4000 r/min超聲處理20 min，取上清，沉淀繼續(xù)重復(fù)以上操作2次，合并上清，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件操作，將峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算樣品的載藥量，載藥量=納米粒中藥物量/納米粒重量，結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可見(jiàn)，隨著TEOS加入量的增加，復(fù)合納米粒的載藥量降低，當(dāng)TEOS用量達(dá)15 ml時(shí)（處方3），載藥量極大降低。以乙醇為溶劑測(cè)得的載藥量高于甲醇，其原因可能是辣椒堿在乙醇中溶解度較高。HA/SiO2復(fù)合納米粒載藥量最高可達(dá)約20 mg/100 mg。

表1 復(fù)合納米粒載藥量測(cè)定結(jié)果

2.2.5 載藥復(fù)合納米粒形態(tài)學(xué)考察 取少量載藥HA/SiO2復(fù)合納米粒，用導(dǎo)電膠固定于樣品座上，噴金，掃描電鏡（SEM）觀察其形態(tài)，結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可見(jiàn)，載藥復(fù)合納米粒電鏡形態(tài)為類球形分布，當(dāng)TEOS加入量為3 ml時(shí)，載藥復(fù)合納米粒粒徑約為200～400 nm，隨著TEOS加入量增加，載藥復(fù)合納米粒粒徑逐漸增大，達(dá)約1 μm，并有黏聚的趨勢(shì)。

圖1 載藥HA/SiO2復(fù)合納米粒SEM照片

2.2.6 HA/SiO2復(fù)合納米粒X-射線衍射（XRD）分析 取HA納米粒和3種不同處方的HA/SiO2復(fù)合納米粒進(jìn)行XRD分析。工作條件：CuKα靶，電壓40 kV，電流40 mA；測(cè)量范圍：15～60°；掃描速度：4°/min。結(jié)果見(jiàn)圖2。與HA納米粒相比，HA/SiO2復(fù)合納米粒XRD圖譜中在20～25°出現(xiàn)較為寬泛的SiO2特征衍射峰，隨TEOS用量增加，在25.9°和31.8°等處的HA特征結(jié)晶峰顯著減小并逐漸消失，說(shuō)明SiO2對(duì)HA的包裹增加，這與SEM觀察到的復(fù)合納米粒粒徑的增加是一致的。

圖2 HA/SiO2復(fù)合納米粒XRD圖譜

2.2.7 HA/SiO2復(fù)合納米粒紅外（IR）分析 取HA納米粒和3種不同處方的HA/SiO2復(fù)合納米粒，采用傅立葉變換紅外光譜（FT-IR）對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，結(jié)果見(jiàn)如圖3。HA和SiO2在某些波段的特征峰是重疊的，如1093 cm-1、965 cm-1處有HA中P-O的伸縮振動(dòng)峰，而在1110 cm-1處有SiO2中Si-O-Si 反對(duì)稱伸縮振動(dòng)峰；965 cm-1處有HA中P-O的伸縮振動(dòng)峰，而SiO2的 FT-IR光譜在970 cm-1處有Si-OH的彎曲振動(dòng)吸收峰。另有一些特征峰是二者特有的，如566 cm-1、604 cm-1兩處HA中P-O的彎曲振動(dòng)峰在HA/SiO2復(fù)合納米粒圖譜中消失；而HA/SiO2復(fù)合納米粒圖譜中出現(xiàn)了800 cm-1和470 cm-1左右的Si-O鍵對(duì)稱伸縮振動(dòng)峰，3445 cm-1處較弱的寬峰可能為結(jié)構(gòu)水中-OH的反對(duì)稱伸縮振動(dòng)峰。同時(shí)，1038 cm-1處HA中的P-O的伸縮振動(dòng)峰在HA/SiO2復(fù)合納米粒圖譜中消失，HA/SiO2復(fù)合納米粒圖譜中970 cm-1處的吸收峰應(yīng)為Si-OH的彎曲振動(dòng)吸收峰。結(jié)果顯示，3種處方的HA/SiO2復(fù)合納米粒FT-IR圖譜中，HA的特征峰均消失，SiO2的特征峰明顯，且隨著復(fù)合比例中TEOS的用量增大其峰強(qiáng)度也有所增加。

圖3 HA/SiO2復(fù)合納米粒FT-IR圖譜

2.3 HA/SiO2復(fù)合納米粒體外釋藥研究

取辣椒堿原料藥5 mg及含辣椒堿5 mg的3種HA/SiO2復(fù)合納米粒，精密稱定，封裝于透析袋（截留分子量3500）中，分別加入相應(yīng)的釋藥介質(zhì)1 ml，兩端扎緊后置于錐形瓶中，分別加入pH 1.2鹽酸溶液和pH 7.4磷酸鹽緩沖液100 ml作為釋藥介質(zhì)，37±1 ℃水浴振蕩，振蕩頻率為100 r/min。分別于0.25，0.5，1，2，4，6，8，12，24，36，48，60，72 h取樣1 ml，同時(shí)補(bǔ)充相應(yīng)釋藥介質(zhì)1 ml。按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算樣品累積釋藥率。兩種介質(zhì)中辣椒堿原料藥和3種載有辣椒堿的HA/SiO2復(fù)合納米粒的體外釋藥曲線見(jiàn)圖4。

由圖4可見(jiàn)，TEOS的用量會(huì)影響HA/SiO2復(fù)合納米粒中藥物的釋放速率，隨著TEOS用量增多，辣椒堿累積釋藥率降低。處方1累積釋藥率在兩種介質(zhì)中均最高。

圖4 不同介質(zhì)中原料藥及復(fù)合納米粒的體外釋藥曲線

2.4 載辣椒堿HA/SiO2復(fù)合納米粒大鼠口服藥動(dòng)學(xué)研究

2.4.1 血漿樣品預(yù)處理方法 取大鼠血漿200 μl，置離心管中，加內(nèi)標(biāo)溶液（10 μg/ml α-萘酚甲醇溶液）50 μl和乙腈500 μl，渦旋1 min，加乙酸乙酯和環(huán)己烷各1.5 ml，渦旋3 min，4000 r/min離心 10 min，取上清，置干凈離心管中，37 ℃水浴氮?dú)鈸]干溶劑，用甲醇100 μl復(fù)溶后渦旋1 min，4000 r/min離心5 min，吸取上清 20 μl，進(jìn)行HPLC分析。

2.4.2 血漿樣品標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 稱取辣椒堿對(duì)照品適量，甲醇溶解，分別配制濃度為0.5，1.0，2.0，4.0，8.0，16.0 μg/ml的辣椒堿對(duì)照品溶液。取空白血漿200 μl加入離心管，分別加入50 μl上述辣椒堿對(duì)照品溶液，配制辣椒堿濃度為125，250，500，1000，2000，4000 ng/ml的大鼠血漿標(biāo)準(zhǔn)溶液，按2.4.1項(xiàng)下方法處理后取20 μl，高效液相色譜儀分析，色譜柱為Symmetry?C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈:水（含0.05 % 磷酸）=45:55，流速1.0 ml/min，柱溫30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm。以辣椒堿峰面積（As）對(duì)內(nèi)標(biāo)峰面積（Ai）的比值為縱坐標(biāo)（Y），辣椒堿血漿標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)（X），最小二乘法進(jìn)行線性回歸，得血漿樣品標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=0.0001X-0.0031，線性范圍125～4000 ng/ml（n=6，r=0.9989）。

2.4.3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法 健康雄性SD大鼠18只[180±20 g，SPF,江蘇大學(xué)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SCXK（蘇）2018-0012]，隨機(jī)分為3組，每組6只，給藥前禁食12 h，自由飲水。按90 mg/kg的劑量分別口服灌胃辣椒堿原料藥CMC-Na混懸液和2種載辣椒堿的HA/SiO2復(fù)合納米粒（處方1、處方2）的水混懸液，于給藥后0.083，0.25，0.5，1，2，4，6，8，12，24，48，72 h，大鼠眼球后叢靜脈采血約0.4 ml，置肝素抗凝管中，4000 r/min 離心10 min，分離血漿，-20 ℃下冷凍存儲(chǔ)直至分析，解凍分析前離心處理（10 000 r/min，10 min）。

2.4.4 參數(shù)擬合及結(jié)果 按2.4.2項(xiàng)下色譜條件測(cè)定血漿樣品中辣椒堿濃度，采用BAPP2.3生物利用度研究數(shù)據(jù)處理通用程序（中國(guó)藥科大學(xué)藥代中心提供）進(jìn)行參數(shù)擬合，按非隔室模型法計(jì)算相關(guān)藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。辣椒堿原料藥、處方1和處方2的載辣椒堿的HA/SiO2復(fù)合納米粒大鼠體內(nèi)藥時(shí)曲線見(jiàn)圖5。主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見(jiàn)表2。

與原料藥相比，載有辣椒堿的HA/SiO2復(fù)合納米粒的t1/2、MRT顯著延長(zhǎng)，其中t1/2為原料藥的5.2～6.2倍，MRT為原料藥的4.7～5.7倍，達(dá)峰時(shí)間顯著延長(zhǎng)，達(dá)到6～12 h，且最大血藥濃度提高至原料藥的1.6～2.4倍；72 h內(nèi)體內(nèi)藥時(shí)曲線下面積AUC0-72h顯著提高，與原料藥相比，處方1與處方2的相對(duì)生物利用度分別提高至1546.1 %和921.6 %。結(jié)果顯示，HA/SiO2復(fù)合納米粒能顯著提高辣椒堿大鼠體內(nèi)生物利用度，且具有一定的緩釋作用，隨著SiO2包覆的增加，生物利用度提高程度有所下降。處方1對(duì)于辣椒堿生物利用度的提高更為明顯。

圖5 辣椒堿原料藥及載藥HA/SiO2復(fù)合納米粒大鼠口服給藥體內(nèi)藥時(shí)曲線

表2 辣椒堿原料藥及載藥HA/SiO2復(fù)合納米粒大鼠口服給藥藥動(dòng)參數(shù)

3 討論

本文研究了TEOS用量對(duì)所制備的載辣椒堿HA/SiO2復(fù)合納米體系的影響，相比于辣椒堿原料藥，復(fù)合納米粒中藥物體外釋藥與體內(nèi)生物利用度均有所提高，但隨著TEOS用量的增加，即SiO2包覆程度的增加，納米粒的粒徑增加，載藥量下降，體外累積釋藥率下降，體內(nèi)增加口服生物利用度的水平也有所下降。因此TEOS用量的優(yōu)化對(duì)HA/SiO2載藥復(fù)合納米粒的增溶、緩釋、提高生物利用度作用尤為重要。

除了TEOS用量，HA的納米化對(duì)實(shí)現(xiàn)難溶性活性成分辣椒堿的增溶促吸也很重要。本文在構(gòu)建復(fù)合納米粒體系時(shí)，首先考察了制備工藝與參數(shù)、前驅(qū)體溶液種類與濃度、干燥方式等多種因素，獲得了粒徑為50 nm左右的納米HA，為復(fù)合載體的構(gòu)建奠定了基礎(chǔ)。

難溶性活性成分的增溶緩釋技術(shù)與高效傳遞載體研究是解決其臨床應(yīng)用的重要方向，無(wú)機(jī)納米載體因其穩(wěn)定性和可控釋藥成為該方向的熱點(diǎn)之一。但關(guān)于其體內(nèi)生物降解及其復(fù)合體系的協(xié)同作用，仍需深入研究，以真正發(fā)揮其高效、穩(wěn)效作用并加速產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程。