徐惠娟，劉文歡，樊展源，劉云云，梁翠誼，許敬亮

（1. 中國科學院廣州能源研究所，中國科學院可再生能源重點實驗室，廣州 510640；2. 廣東省新能源和可再生能源研究開發(fā)與應用重點實驗室，廣州 510640；3. 陜西科技大學 動力工程系，西安 710021；4. 華南師范大學 生物工程系，廣州 510631）

0 引 言

隨著經(jīng)濟的高速發(fā)展和人口的快速增長，全球化石能源的消費速度與日俱增?；茉吹牟豢稍偕约捌涫褂眠^程中產(chǎn)生 CO2、SO2等導致全球酸雨、溫室效應、臭氧層孔洞等一系列環(huán)境問題，迫使人們尋找新的可替代能源?？稍偕纳锬茉淳褪且粋€很好的替代能源，根據(jù)目前全球生物能源領域的戰(zhàn)略目標，預計到2050年生物能源將占世界能源需求的 30%[1]。在眾多的生物能源中，生物乙醇是一種優(yōu)質(zhì)的液體燃料，具有灰分低和硫分低等特點，可以添加到汽油中使用，不僅能夠提供與汽油相當?shù)幕瘜W能，還能提高汽油的抗爆性，降低汽車尾氣排放，被認為是一種極具潛力的化石能源替代品[2]。

目前生物乙醇研究的熱點是利用木質(zhì)纖維素原料來生產(chǎn)乙醇，因為木質(zhì)纖維素原料儲量極其豐富而且可以再生。而如何提高過程效率、降低生產(chǎn)成本是該技術研究的重點，也是決定其能否實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化的關鍵。釀酒酵母或運動發(fā)酵單胞菌是用于乙醇發(fā)酵的主要微生物菌株，但是它們不能分解高度聚合的木質(zhì)纖維素，需要通過纖維素酶將纖維素水解轉(zhuǎn)化為單糖，然后才能進一步發(fā)酵成乙醇，這會降低過程的經(jīng)濟性。整合生物加工（consolidated bioprocessing, CBP）技術將纖維素酶的生產(chǎn)、纖維素的酶解和發(fā)酵幾個過程整合在一起，實現(xiàn)從纖維素原料到產(chǎn)物的直接轉(zhuǎn)化，能夠簡化生產(chǎn)工藝，降低成本[3-4]，因此在纖維素原料生物煉制中極具優(yōu)勢。CBP技術的關鍵是找到一種既能有效分解纖維素成寡糖又能進一步發(fā)酵糖類的微生物或微生物群落[5]，嗜熱厭氧的熱纖梭菌（Clostridium thermocellum）對木質(zhì)纖維素有很強的降解能力，并能發(fā)酵生成乙醇，是CBP制纖維素乙醇的優(yōu)良候選菌株，受到科學家的廣泛關注。本文對熱纖梭菌的特性、降解纖維素機理及其在乙醇發(fā)酵方面的研究進展進行了綜述。

1 熱纖梭菌性質(zhì)及其代謝途徑

熱纖梭菌是一種嗜熱產(chǎn)芽孢的嚴格厭氧菌，在45 ～ 65℃之間可以生長，最適生長溫度55 ～ 60℃，革蘭氏染色陽性，在顯微鏡下細胞呈桿狀，細胞外包裹著由肽聚糖、胞壁質(zhì)等組成的細胞壁結(jié)構(gòu)，能夠以纖維素及其降解產(chǎn)物纖維二糖與纖維糊精為碳源，發(fā)酵產(chǎn)生乙醇、乙酸、乳酸、二氧化碳和氫。1926年 VILJOEN等[6]首次報道了熱纖梭菌具有分解纖維素產(chǎn)乙醇的能力，其穩(wěn)定的純培養(yǎng)物于1948年由 MCBEE[7]分離純化得到。熱纖梭菌能利用纖維素、纖維二糖、葡萄糖、甘露糖、果糖和甘露醇生長，但不能發(fā)酵戊糖和淀粉。與葡萄糖相比較，熱纖梭菌在纖維二糖上生長更迅速，當培養(yǎng)基中同時含有纖維二糖和葡萄糖時，其優(yōu)先利用纖維二糖[8]。

培養(yǎng)基中的纖維二糖通過與三磷酸腺苷（ATP）結(jié)合的轉(zhuǎn)運蛋白轉(zhuǎn)運進入熱纖梭菌細胞內(nèi)，隨即在纖維二糖磷酸化酶的作用下轉(zhuǎn)化為葡萄糖-1-磷酸和葡萄糖，進而形成葡萄糖-6-磷酸，然后進入 EMP（Embden-Meyerhof-Parnas）途徑，最終轉(zhuǎn)化為丙酮酸。研究發(fā)現(xiàn)，熱纖梭菌中沒有EMP途徑普遍存在的丙酮酸激酶，磷酸烯醇式丙酮酸是由磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶催化生成草酰乙酸，接著被蘋果酸脫氫酶還原成蘋果酸，最后由蘋果酸酶催化生成丙酮酸[9-11]。生成的丙酮酸通過以下三種路徑進一步轉(zhuǎn)化：①被乳酸脫氫酶催化生成乳酸；②在丙酮酸鐵氧還蛋白氧化還原酶催化下生成乙酰輔酶 A，乙酰輔酶A經(jīng)磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶和乙酸激酶先后催化生成乙酸；③乙酰輔酶A在乙醛脫氫酶和乙醇脫氫酶的作用下先生成乙醛，再轉(zhuǎn)化為乙醇（圖1）。隨著乙酸及乳酸的積累，培養(yǎng)基的 pH值逐漸下降，細胞進入穩(wěn)定期和衰亡期，對纖維素的分解速率和產(chǎn)物的生成速率也隨之降低。

與傳統(tǒng)的釀酒酵母發(fā)酵相比，熱纖梭菌的乙醇產(chǎn)量較低，且不能耐受高濃度的乙醇。據(jù)報道，當外加乙醇濃度大于 1%（w/v）時，野生型熱纖梭菌的生長受到明顯的抑制[13-15]。WILLIAMS等[15]通過逐漸增加培養(yǎng)基中乙醇濃度的方法得到了一株能夠耐受5%（w/v）乙醇的熱纖梭菌，在對這株菌及其野生菌株的蛋白質(zhì)組學進行分析后，發(fā)現(xiàn)與野生株相比，很多涉及碳水化合物運輸和代謝的膜結(jié)合蛋白的表達在乙醇耐受株中都明顯降低，尤其是纖維小體（cellulosome）的一些酶和結(jié)構(gòu)組分表達下調(diào)；這株菌仍然能降解纖維素，但是降解速度及程度都比野生株低。

然而，熱纖梭菌的特性使其在乙醇發(fā)酵中具有以下優(yōu)勢[16]：①同時具備分解纖維素和產(chǎn)乙醇的能力，使得糖化和發(fā)酵過程可以一步完成；②厭氧菌發(fā)酵過程中不需要提供氧氣。厭氧菌通常細胞產(chǎn)量低，因此更多的底物可用于轉(zhuǎn)化生成乙醇；③屬于嗜熱菌，最適生長溫度達到60℃，可以降低發(fā)酵罐的冷卻成本，而且高溫發(fā)酵有利于乙醇的回收，還可以降低染菌的幾率。此外，嗜熱菌具有魯棒性，所含的酶蛋白比較穩(wěn)定；④可以和其他產(chǎn)乙醇或發(fā)酵戊糖的微生物一起培養(yǎng)。

2 熱纖梭菌降解纖維素的機制

熱纖梭菌降解纖維素的機制與真菌不同，真菌如里氏木霉（Trichoderma reesei）的纖維素酶為非復合型，各纖維素酶組分獨立存在，由細胞分泌并游離于胞外，而熱纖梭菌是通過形成纖維小體這一多酶復合體來實現(xiàn)纖維素的高效降解：多種纖維素酶、半纖維素酶基于錨定?黏附機制組裝成多酶復合體，該復合體通過黏附蛋白固定于細胞表面。這一空間結(jié)構(gòu)高度有序化的多酶復合體除了有催化協(xié)同作用外，還會促發(fā)酶?酶鄰近協(xié)同效應及酶?底物?細胞復合協(xié)同效應，因此在纖維素降解能力上優(yōu)于非復合型的纖維素酶。

1983年，LAMED等[17]首先在熱纖梭菌中發(fā)現(xiàn)纖維小體，其分子大小為 2 × 106～ 6 × 106Da，由大小為37 ～ 210 kDa不等的14 ～ 50個亞基組成。目前已知的產(chǎn)纖維小體的微生物主要包括熱纖梭菌、解纖維梭菌（Clostridium cellulyticum）、食纖維梭菌（Clostridium cellulovorans）、約休梭菌（Clostridium josui）等[18-20]。纖維小體主要由兩部分組成：一部分是含有錨定域（dockerin domain）的多酶亞基，另一部分是含有一個或多個黏附域（cohesin domain）的腳手架蛋白（scaffoldin）[21]。纖維素酶通過錨定域與腳手架蛋白上的黏附域特異性結(jié)合，組裝成多酶復合體。腳手架蛋白上還含有一個纖維素結(jié)合域（cellulose-binding domain, CBD），其作用是結(jié)合底物纖維素。不同微生物中纖維小體的結(jié)構(gòu)組分和組裝模式是不同的，導致它們在纖維素降解能力上存在差異。

腳手架蛋白也稱為纖維小體整合蛋白（cellulosome integrating protein, CipA），既有結(jié)合纖維素的功能，也具有細胞錨定功能。熱纖梭菌的腳手架蛋白包含一個單獨的 CBD和 9個非常相似的黏附域，還有一個額外的結(jié)構(gòu)域幫助纖維小體附著在細胞表面。CBD和黏附域具有相似的折疊類型，但它們的功能組件明顯不同。熱纖梭菌纖維小體的結(jié)構(gòu)及其與纖維素和細胞表面的相互作用如圖 2所示。其中I型錨定?黏附作用指的是腳手架蛋白上的黏附域和酶亞基上的錨定域之間的相互作用，而II型錨定?黏附作用為腳手架蛋白的羧基末端錨定域與細胞表面錨定蛋白的黏附域之間的相互作用。

纖維小體的催化域根據(jù)其序列相似性和折疊情況可以歸到不同的糖苷水解酶（GH）家族。熱纖梭菌纖維小體的酶組分主要包括內(nèi)切葡聚糖酶（endoglucanase），外切葡聚糖酶（exoglucanase）、木聚糖酶（xylanase）等，此外還含有1個幾丁質(zhì)酶（chitinase）和 1個地衣酶（lichenase），其中纖維素酶類主要來源于GH5、GH9及GH48家族，而木聚糖酶主要由GH10、GH11家族組成。表1為熱纖梭菌纖維小體中的亞基組成。除催化域和錨定域外，某些酶組分還包括其他的結(jié)構(gòu)域，如CBD和Ig（免疫球蛋白類似結(jié)構(gòu)域）等。

表1 熱纖梭菌纖維小體中的亞基[16,22]Table 1 Subunits of Clostridium thermocellum cellulosome[16,22]

大多數(shù)降解纖維素的細菌只有一個來自糖苷水解酶家族48（GH48）的纖維素酶，而熱纖梭菌含有兩個：Cel48S（即CelS）和Cel48Y。Cel48S是纖維小體的重要組分，屬于外切葡聚糖酶；Cel48Y則是一個游離的纖維素酶。纖維二糖會抑制Cel48S的活性，但 Ca2+和巰基乙醇能提高其穩(wěn)定性。OLSON等[23]敲除熱纖梭菌的Cel48S基因后發(fā)現(xiàn)，突變株的細胞產(chǎn)量及纖維素水解速率均下降，而且其纖維小體對微晶纖維素的比活降低了 35%，而 Cel48S和Cel48Y雙敲除突變株對纖維素的降解性能卻與Cel48S單敲除突變株基本相同。

研究表明，生長條件顯著地影響熱纖梭菌的纖維素降解活性。熱纖梭菌產(chǎn)纖維素酶的水平與生長所用的碳源有關，在含果糖的培養(yǎng)基中，細胞產(chǎn)生的纖維素酶效價比生長于纖維二糖時高7倍，比生長于葡萄糖時高4倍[24]。此外，纖維小體的組分也受到碳源的影響，在結(jié)晶纖維素和經(jīng)預處理的柳枝稷存在時，GH9的酶水平上升，而只要有纖維素（普通、無定形或結(jié)晶）存在時，GH5的酶都顯示水平增加[25]。里氏木霉水解纖維素的產(chǎn)物是纖維二糖，熱纖梭菌的產(chǎn)物則為較高分子量的纖維糊精（平均聚合度約為 4），這是由于熱纖梭菌纖維小體上的催化酶大部分是內(nèi)切葡聚糖酶[26]。熱纖梭菌中纖維糊精磷酸化酶的活性較高，可以快速吸收由內(nèi)切葡聚糖酶隨機水解產(chǎn)生的纖維糊精。

纖維小體在降解纖維素底物方面具有優(yōu)勢，這不僅是因為其腳手架蛋白聚集的多酶，還因為其構(gòu)象靈活多變。GARCíA-ALVAREZ等[27]用冷凍電子顯微鏡研究熱纖梭菌纖維小體的結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)三個相鄰的催化域以相反的方向交替地從腳手架蛋白向外突出，該結(jié)構(gòu)可以擴大底物對催化域的可及范圍。黏附域之間的柔性連接使得纖維小體在降解非溶解性底物時能夠延伸變換構(gòu)型，從而增強與底物的接觸，提高降解效率。

3 熱纖梭菌轉(zhuǎn)化纖維素合成乙醇的研究

熱纖梭菌因具有分解纖維素并將其轉(zhuǎn)化為乙醇的能力而受到關注，但是能夠直接轉(zhuǎn)化纖維素的微生物通常表現(xiàn)出低的乙醇產(chǎn)率，熱纖梭菌也不例外。據(jù)報道，野生型熱纖梭菌產(chǎn)生的最高乙醇濃度小于30 g/L[28]。目前，熱纖梭菌利用纖維素原料產(chǎn)乙醇仍存在以下幾個問題：①還原性糖的積累及副產(chǎn)物乙酸、乳酸、氫等的形成會抑制乙醇的生成；②雖然熱纖梭菌能夠分解木聚糖，但缺乏木糖異構(gòu)酶和木酮糖激酶，因此無法代謝木糖或低聚木糖[16]；③產(chǎn)物乙醇和有機酸對細胞具有毒性。

針對上述問題，可以采取以下措施：采用熱纖梭菌與其他能利用木糖的厭氧菌共培養(yǎng)的方式來提高乙醇產(chǎn)量；選育耐乙醇的熱纖梭菌菌株，通過優(yōu)化培養(yǎng)條件來提高乙醇得率；對熱纖梭菌進行基因工程改造，抑制副產(chǎn)物的生成或強化乙醇合成途徑，或者將代謝木糖的基因?qū)霟崂w梭菌以提高其底物利用率及乙醇產(chǎn)率。

嗜熱硫化氫梭菌（Clostridium thermohydrosulfuricum）能發(fā)酵纖維二糖、葡萄糖和木糖，但不能發(fā)酵纖維素。NG等[29]研究了熱纖梭菌菌株LQRI和嗜熱硫化氫梭菌菌株39E在某些纖維素底物上的共培養(yǎng)，例如MN300纖維素、Avicel、Solka Floc、SO2處理過的木材以及蒸汽爆破法處理的木材等，最高乙醇得率為0.46 g/g MN300纖維素。Thermoanaerobacterium saccharolyticum是一株能夠直接發(fā)酵半纖維素和木聚糖的嗜熱厭氧菌，還能發(fā)酵纖維素生物質(zhì)中的纖維二糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖和阿拉伯糖等[30]。ARGYROS等[31]將熱纖梭菌和T. saccharolyticum共培養(yǎng)進行纖維素發(fā)酵，在146 h內(nèi)從92 g/L Avicel產(chǎn)生了38 g/L的乙醇，而且由于這兩株菌都是阻斷了乳酸和乙酸合成途徑的工程菌，因而在發(fā)酵產(chǎn)物中未檢測到乙酸和乳酸。

野生型熱纖梭菌通?？梢阅褪艿陀?6 g/L的乙醇[13]，但經(jīng)過適應或工程改造的菌株可以在40 g/L的乙醇中穩(wěn)定生長[15,32]，而適應后的菌株甚至可在高達80 g/L的乙醇中存活，盡管其生長非常有限[15]。對熱纖梭菌野生型ATCC 27405菌株和衍生的乙醇適應型（EA）菌株重測序以鑒定與表型相關的突變[32]，結(jié)果發(fā)現(xiàn)EA菌株具有突變的adhE基因，該基因編碼雙功能的醇/醛脫氫酶。將此adhE突變轉(zhuǎn)移至熱纖梭菌DSM 1313，遺傳分析表明該突變賦予了菌株耐受乙醇的表型。但是，盡管菌株對乙醇的耐受性更高，其在乙醇產(chǎn)率上并沒有優(yōu)勢，這說明還存在其他的代謝瓶頸。

OGUNTIMEIN等[33]開發(fā)了一種利用96孔板進行高通量（high throughput）篩選的方法，通過比較兩株熱纖梭菌（Δhpt和LL1210）分別以兩種纖維素原料（Avicel和柳枝稷）為底物產(chǎn)乙醇的情況，證明該方法可行，可用于纖維素乙醇生產(chǎn)中的大規(guī)模篩選研究。LI等[34]研究了熱纖梭菌發(fā)酵乙醇過程中氫酶抑制劑（H2、CO和甲基紫精）對產(chǎn)物選擇性的影響。結(jié)果顯示，在一個底物（纖維二糖）有限的恒化器里，將通入的氣體由N2切換為H2時，乙酸減少，乙醇產(chǎn)量增加 350%。熱纖梭菌通過產(chǎn) H2、乳酸或乙醇將NADH氧化為NAD+，當氫酶被抑制時，后面兩種產(chǎn)物增加。如果可利用底物過多會導致 1,6-二磷酸果糖增加，從而觸發(fā)乳酸的生產(chǎn)。而甲基紫精可以降低底物的轉(zhuǎn)運速率，對乙醇生產(chǎn)有促進作用。此外，培養(yǎng)基的組成也是一個重要影響因素。BALUSU等[35]對熱纖梭菌SS19的培養(yǎng)基進行了優(yōu)化，優(yōu)化后的培養(yǎng)基含濾紙、玉米漿、半胱氨酸鹽酸和硫酸亞鐵分別為45 g/L、8.0 g/L、0.25 g/L和0.01 g/L，利用該培養(yǎng)基發(fā)酵生產(chǎn)乙醇，其乙醇得率達到0.41。

在基因工程改造方面，KANNUCHAMY等[36]將來自運動發(fā)酵單胞菌（Zymomonas mobilis）的丙酮酸脫羧酶（pdc）和醇脫氫酶（adh）基因克隆至pNW33N，然后電轉(zhuǎn)化熱纖梭菌DSM1313，獲得重組菌株 CTH-pdc、CTH-adh和CTH-pdc-adh。盡管異源的pdc和adh基因均在熱纖梭菌中起作用，但是adh的存在嚴重抑制了重組菌株的生長。與野生型菌株相比，重組菌株CTH-pdc的丙酮酸脫羧酶活性和乙醇產(chǎn)量提高了兩倍。

H2是熱纖梭菌產(chǎn)乙醇過程的一個副產(chǎn)物，抑制產(chǎn)氫可以使得更多的電子用于將乙酰輔酶A還原為乙醇。BISWAS等[37]敲除了涉及三個 [FeFe] 氫酶成熟（從脫輔基酶轉(zhuǎn)變成全酶）的酶基因hydG，進一步敲除 [NiFe] 氫酶基因（ech）后獲得了功能上缺失全部氫酶的突變株。在突變株ΔhydGΔech中檢測不到產(chǎn)氫，且乙醇產(chǎn)量幾乎翻了一倍，達到最大理論產(chǎn)量的64%。對突變株ΔhydG的基因組進行分析后顯示adhE基因發(fā)生突變，導致菌株獲得可依賴NADH或NADPH的醇脫氫酶活性。

XIONG等[38]將來自嗜熱厭氧菌Thermoanaerobacter ethanolicus的xylA（編碼木糖異構(gòu)酶）和xylB（編碼木酮糖激酶）基因?qū)霟崂w梭菌DSM 1313，使其不僅在纖維素上還可以在木糖上生長。將xylAB定向整合到熱纖梭菌基因組中，可實現(xiàn)葡萄糖、纖維二糖或纖維素與木糖的同時發(fā)酵，而且沒有碳分解代謝物阻遏。結(jié)果還顯示同時利用木糖和纖維素時，H2和乙醇的產(chǎn)量是單獨利用纖維素時的兩倍。此外，工程菌還可以在木糖存在時利用木糖低聚物（聚合度為 2 ～ 7）。

4 展 望

熱纖梭菌因其在整合生物加工技術上的優(yōu)勢而備受關注。近年來由于分子生物學技術的發(fā)展，用于梭菌的新的遺傳工具陸續(xù)被開發(fā)出來，比如基于II型內(nèi)含子的定向誘變系統(tǒng) targetron、選擇性標記和反向選擇性標記的發(fā)展、基于反轉(zhuǎn)座子的基因阻斷技術等，這些工具的改進使得熱纖梭菌的代謝工程得到快速發(fā)展。此外，蛋白質(zhì)組學、轉(zhuǎn)錄組學等各種組學技術的發(fā)展也為進一步闡明熱纖梭菌的代謝調(diào)控機制提供了幫助。

但是，盡管已經(jīng)取得了長足的進步，熱纖梭菌用于纖維素乙醇的生產(chǎn)仍然處于實驗研究階段，距離工業(yè)化生產(chǎn)還有一定的差距，其中主要的問題包括以下幾個方面：①纖維素發(fā)酵速度慢，細胞產(chǎn)量低，從而導致酶效低，乙醇產(chǎn)量不高；②受木質(zhì)纖維素?水混合物機械性能的限制，難以制備超過5%或6%（w/v）的乙醇，固含量高于20%（w/v）時物料的混合將是個大的挑戰(zhàn)；③菌株的工業(yè)粗放性有待加強，需要提高其對原料預處理時產(chǎn)生的抑制物的耐受性能。因此，開發(fā)在工業(yè)條件下具有魯棒性的菌株以及提升高底物負載下的底物轉(zhuǎn)化率是未來工作的重要方向。