馮仁才，葉 雷，張笑萍，2，亢宗靜，2，李小林**

（1.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究所，四川 成都 610066；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)資源學(xué)院，四川 成都 611130）

冬蟲夏草（Ophiocordyceps sinensis） 是主要分布在海拔3 000 m～5 000 m高寒地帶、雪山草原所產(chǎn)的名貴中藥材[1]，在生物學(xué)分類上屬子囊菌亞門Ascomycotina、麥角菌科Clavicipitaceae的真菌[2-3]，是冬蟲夏草真菌和蝙蝠蛾科幼蟲的復(fù)合體[4]。我國食用冬蟲夏草歷史悠久，在唐朝藏醫(yī)藥書籍《月王藥診》、清朝本草書籍《本草備要》等中均有其食用功效和食用方法的記載。冬蟲夏草在四川[5]、西藏[6]、青海[7]、甘肅[8]、云南[9]等均有分布，在四川主要分布在阿壩州和甘孜州。其中康定市為最主要的產(chǎn)地之一[10]，據(jù)不完全統(tǒng)計，產(chǎn)區(qū)面積在6 600 hm2以上，年產(chǎn)冬蟲夏草約20 t，已成為國內(nèi)冬蟲夏草交易的重要集散地之一。隨著社會發(fā)展，冬蟲夏草的價值逐漸被認(rèn)識，在利益趨勢下，產(chǎn)地環(huán)境遭受了人為破壞[11]，生態(tài)形勢嚴(yán)峻，產(chǎn)量有逐年下降趨勢[12]。然而冬蟲夏草人工栽培難度大，學(xué)界有關(guān)于其成功人工栽培的報道，而其栽培技術(shù)屬高度的商業(yè)機(jī)密；現(xiàn)階段開展冬蟲夏草人工撫育和發(fā)生機(jī)理研究，成為維持冬蟲夏草產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的方向。本文以冬蟲夏草主產(chǎn)區(qū)人工撫育基地自然出草土壤微生物和土壤理化因子為研究對象，在冬蟲夏草生理成熟的孢子彈射期[13-15]，對3個冬蟲夏草產(chǎn)區(qū)和1個非產(chǎn)區(qū)的土壤細(xì)菌群落組成和土壤性質(zhì)進(jìn)行分析。研究結(jié)果對了解冬蟲夏草子囊孢子彈射期土壤細(xì)菌組成情況和土壤理化性質(zhì)情況，進(jìn)一步探究細(xì)菌菌群組成對冬蟲夏草子囊孢子彈射情況，進(jìn)而對來年產(chǎn)地?fù)嵊桨附ㄔO(shè)和預(yù)測出草情況具有指導(dǎo)意義，為更好的開展冬蟲夏草撫育工作奠定基礎(chǔ)。

1 材料方法

1.1 樣品采集與保存

在康定市長河壩水電站附近的冬蟲夏草人工撫育基地采集樣品 （經(jīng)度 29°53′43″，緯度 101°55′81″，海拔3 438 m）。該基地已經(jīng)進(jìn)行了3年以上的冬蟲夏草人工撫育，撫育期間在每年6月投放蟲卵以及飼料。基地用鐵絲圍欄防護(hù)，無放牧現(xiàn)象，撫育面積1.33 hm2以上，主要植被類型為灌木叢和草坪，土壤類型為沙壤土，帶有少量石子，據(jù)2015年～2016年調(diào)查，冬蟲夏草平均密度約3.11根/m2，主要分布在土壤地表下3 cm～5 cm[16-17]。試驗中非冬蟲夏草產(chǎn)地距離冬蟲夏草產(chǎn)地采樣地點約100 m，地形、植被、氣候和土壤等與冬蟲夏草產(chǎn)地一致。2016年6月進(jìn)行樣品采集。

用于高通量測序的樣品采集時，在撫育基地人畜不能干預(yù)的冬蟲夏草出草區(qū)域（800 m2），按照蛇形取樣法隨機(jī)劃分27個小區(qū)（每個小區(qū)10 m2），每9個小區(qū)隨機(jī)為一組（每個重復(fù)含3小區(qū)），分為J1、J2和J3三個組。每組樣品取樣時（如J1），在每個小區(qū)隨機(jī)找3根冬蟲夏草，每根冬蟲夏草緊貼蟲體1 cm的土壤采樣；采集時用無菌鐵鏟去除表層土壤，然后垂直下挖至冬蟲夏草實生土壤，用無菌勺子和無菌毛刷取樣；取樣時按照無菌操作流程進(jìn)行，所取樣品立即存放在無菌EP管中，編號J1并存放在車載冰箱（4℃）中進(jìn)行臨時保存。以此類推開展各樣地樣品的采集。非冬蟲夏草產(chǎn)地編號為J4，采集方法同冬蟲夏草產(chǎn)地，采集地表以下3 cm～5 cm的土壤作為樣品。

用于土壤理化因子測定土壤與用于高通量測序的樣品同期采集，采集時選取距離蟲體5 cm以內(nèi)的土壤，采集后注明標(biāo)簽立即放置在低溫冰箱保存。所有樣品立即帶回實驗室進(jìn)行下一步試驗，用于高通量測序樣品經(jīng)液氮浸泡1 min后放置在-80°C超低溫保藏箱中，用于后續(xù)試驗。

1.2 土壤理化性質(zhì)分析

土壤理化性質(zhì)按相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行測定。pH、有機(jī)質(zhì)、全氮、堿解氮、有效磷、速效鉀含量測定參照Li等[18]介紹的方法進(jìn)行，土壤重金屬鎘、鉛、汞和砷含量測定參照王芮[19]介紹的方法進(jìn)行，并依次編號為pH、OM、TN、AN、AP、AK、Cd、Pb、Hg、As。

1.3 土壤微生物基因組DNA提取、擴(kuò)增及測序

土壤基因組DNA提取使用Omega Bio-tek公司的 E.Z.N.ATMSoil DNA kit（D5625-01)），DNA 提取后用0.8%的瓊脂糖作膠在0.5倍的TAE液中進(jìn)行電泳，檢測質(zhì)量滿足袁天英等[20]所述；然后采用Nano Drop-2000紫外分光光度計測定提取DNA濃度，對質(zhì)量合格的DNA樣品按照葉雷等[21]所述方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增、切膠回收（采用AXYGEN公司的凝膠回收試劑盒）、定量和檢測；再將PCR產(chǎn)物送往北京諾禾致源生物信息科技有限公司Illumina MiSeq平臺進(jìn)行高通量測序，其中文庫構(gòu)建和相關(guān)分析等均委托該公司進(jìn)行。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

對高通量下機(jī)數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾、拼接和去嵌合體后，按照Li等[18]介紹的方法進(jìn)行測序數(shù)據(jù)的處理與分析，如物種組成分析，多樣性指數(shù)，α多樣性分析和β多樣性分析等；其他數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用SPSS 22.0軟件和Excel行統(tǒng)計分析、方差分析等；土壤細(xì)菌群落與理化性質(zhì)的相關(guān)性分析按照Fu等[22]所述的的方法進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤理化性質(zhì)分析

對所采集土壤樣品嚴(yán)格按照相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)測定方法進(jìn)行測定，結(jié)果見表1。

表1 土壤理化性質(zhì)及重金屬Tab.1 Soil physicochemical composition

由表1可知，在0.05水平上，J4的pH、OM、TN和AN顯著高于其他組，但是AP和AK顯著低于其他組，說明在產(chǎn)冬蟲夏草的土壤中有相對較高的AP和AK，相對較低的pH、OM、TN和AN。從重金屬分析數(shù)據(jù)來看，在非產(chǎn)冬蟲夏草的J4重金屬Cd、Pb和As都顯著高于產(chǎn)冬蟲夏草的地點，Hg在土壤含量沒有顯著差異。根據(jù)GB 15618-2018土壤環(huán)境質(zhì)量農(nóng)用地土壤污染風(fēng)險管控標(biāo)準(zhǔn)（試行）的相關(guān)要求，可知該地區(qū)土壤質(zhì)量達(dá)到一級，環(huán)境優(yōu)良，對冬蟲夏草質(zhì)量安全、生長的風(fēng)險低，可見康定蟲草產(chǎn)地環(huán)境非常好。

2.2 冬蟲夏草土壤細(xì)菌的高通量測序結(jié)果

樣品稀釋曲線能很好的反映樣品測序的深度和樣品的物種豐富度，通過在相似度0.97下各土壤樣品的稀釋曲線分析，顯示當(dāng)測序數(shù)據(jù)量達(dá)到20 000條及以上時，曲線趨于平緩，隨著測序量的增加，觀測到的物種數(shù)量不再增加，說明測序量已經(jīng)達(dá)到飽和，測序深度能很好的反映樣品的物種組成，測序結(jié)果可信。

樣品測序得到有效序列在24 500條以上，且所占百分比在75%以上。對處理序列采用相關(guān)分形軟件在0.97相似度下聚類得到OTU，樣品測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計見表2，并制作韋恩圖見圖1。

表2 樣品測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計Tab.2 Sequencing date statistics of sample

為了解樣品細(xì)菌菌群物種數(shù)目、豐富度和均勻度等情況，利用相關(guān)軟件分析物種多樣性指數(shù)。用α多樣中的Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)、Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)來展現(xiàn)，各樣品多樣性指數(shù)見表3。

表3 各樣品多樣性指數(shù)Tab.3 Diversity index

由表3可知，從Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)來看，樣地土壤細(xì)菌群落內(nèi)物種數(shù)目差異不顯著（P＜0.05），從Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)來看，各樣地細(xì)菌群落內(nèi)物種數(shù)目差異較大，優(yōu)勢種的地位不明顯。α多樣性指數(shù)與土壤理化性質(zhì)作相關(guān)性分析結(jié)果見表4。

表4 細(xì)菌多樣性與土壤理化性質(zhì)的相關(guān)性Tab.4 The correlation analysis of soil bacterial diversity and soil physiochemical properties

由表4可知，觀測到的物種與TN、OM呈正相關(guān)；Chao1和ACE指數(shù)與pH、AP、AK、Cd和Hg等呈負(fù)相關(guān)，與TN呈正相關(guān)；simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)與TN、AN、AP、Cd、Pb、Hg和 As呈負(fù)相關(guān)，與AK呈正相關(guān)。

2.3 冬蟲夏草土壤樣品的菌群組成分析

對采集樣品進(jìn)進(jìn)行高通量測序，經(jīng)數(shù)據(jù)處理，在0.97相似度下進(jìn)行聚類，每個樣平均得到3 227個OTU，分為33個細(xì)菌門、126綱、230目、375科、592屬。樣品中門水平細(xì)菌群落分布見圖2。

如圖2所示，在門分類水平上，各樣品均以Proteobacteria、Acidobacteria和Actinobacteria為前 3個相對豐度最高的門，三者占樣品相對豐度比78.29%～81.47%。其次為Verrucomicrobia、Chloroflex和Bacteroidetes等。Proteobacteria相對豐度在非冬蟲夏草產(chǎn)地（J4） 中最高為44.76%，且以J1樣品最低為31.35%。

土壤微生物群落與土壤理化性質(zhì)緊密相關(guān)，且互相影響[7]。將微生物多樣性指數(shù)與門分類水平上進(jìn)行相關(guān)性分析，能更好的展現(xiàn)土壤細(xì)菌門與土壤理化因子的關(guān)系，門水平與土壤理化的相關(guān)性分析結(jié)果見表5。

表5 門水平與土壤理化的相關(guān)性分析Tab.5 The correlation analysis of soil physiochemical properties and phylum level

由表5可知，Chloroflexi與pH呈顯著負(fù)相關(guān)，與AP呈極顯著負(fù)相關(guān)，F(xiàn)irmicutes與重金屬Cd、Pb呈顯著正相關(guān)。pH是影響土壤微生物組成的關(guān)鍵因子；結(jié)合上圖2可知，相對豐度較高的Proteobacteria與Hg、AN和OM呈正相關(guān)；Acidobacteria與AP呈正相關(guān)，與OM、TN、Pb和As呈負(fù)相關(guān)；Actinobacteria與AK和OM呈正相關(guān)，與TN、AN、AP、Cd、Pb、Hg和As呈負(fù)相關(guān)。

在科分類水平，對4組樣品細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。結(jié)果顯示J1分270個科；J2份281個科；J3分318個科；J4分309個科。樣品中科水平細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及分布見圖3。

由圖3可知，各樣品前五個具有相對較高豐度的科為 Koribacteraceae（相對豐度 6.7%～9.26%）、Bradyrhizobiaceae（相對豐度 4.64%～9.89%）、Hyphomicrobiaceae（相對豐度 2.66%～6.51%）、Chthoniobacteraceae（相對豐度 2.68%～7.11%）、Rhodospirillaceae（相對豐度3.47%～5.71%），且無論是否在冬蟲夏草產(chǎn)地其相對豐富度組成差異不顯著。將物種相對豐度不足1%的歸為others，無法鑒定的歸到Unidentified，發(fā)現(xiàn)Others和Unidentified占整個樣品細(xì)菌組成的41%～52%。另在蟲草產(chǎn)地J1、J2、J3樣品中Oxalobacteraceae（相對豐度0.24%～1.0%）顯著低于非蟲草產(chǎn)地J4（相對豐度8.11%），說明Oxalobacteraceae有可能是影響冬蟲夏草出草的菌群。

從樣品屬分類水平來看，J1、J2、J3、J4樣品分別鑒定出了389個屬、417個屬、487個屬和468個屬，且相對豐度大于1%的屬分別有18個、23個、24個、27個。對各樣品主要菌屬進(jìn)行統(tǒng)計分析，樣品中細(xì)菌群落在屬水平上的相對豐度見表6。

表6 樣品中細(xì)菌群落在屬水平上的相對豐度表Tab.6 The relative abundance of bacteria in soil samples at the genus level

由表6可知，Rhodoplanes、DA101（未命名）、Candidatus Solibacter、Ralstonia、Ochrobactrum、Rhodococcus、Candidatus Koribacter等無論是否在冬蟲夏草產(chǎn)區(qū)都有分布，其中Rhodoplanes在J1、J2和J3中平均相對豐度分別為6.33%、6.28%和4.41%，顯著高于J4的1.96%，據(jù)王寶山等[23]介紹，該屬具有石油烴類污染物降解的功能，且能夠利用NO2--N和NO3--N作為電子受體用于反硝化作用[24]。在J1中DA101和J4沒有差異顯著性，J3顯著低于其他樣地。Candidatus Solibacter在各樣地間無差異顯著性。Ralstonia在J4顯著高于冬蟲夏草各產(chǎn)地土壤的相對豐度，該菌細(xì)菌多與植物致病性有關(guān)[25]，對土壤重金屬污染有修復(fù)能力[26]，這預(yù)示著在非產(chǎn)冬蟲夏草土壤中可能有相對含量更好的重金屬，這與前面土壤理化性質(zhì)分析的結(jié)果一致（表1）。Ochrobactrum在J4中相對豐度顯著高于產(chǎn)冬蟲夏草的土壤，該屬能降解苯酚[27]、有機(jī)磷[28]和對Pb、Cd具有耐性等特點[29]，結(jié)合表6數(shù)據(jù)分析表明，可能在非產(chǎn)冬蟲夏草土壤中有相對較低的AP。Rhodococcus在J4中顯著高于產(chǎn)冬蟲夏草的樣品，且J1顯著低于了其他樣品，該屬具有耐重金屬特性和很好的脫氮作用，將自身氮供給環(huán)境利用[30]，可能是J4中TN和AN高于產(chǎn)冬蟲夏草的原因。了解冬蟲夏草發(fā)生土壤細(xì)菌組成對進(jìn)一步探究出草機(jī)理具有重要意義。

2.4 土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)主成分分析

樣品土壤細(xì)菌的主成分分析見圖4。

圖4表明，第1主成分PC1解釋42.26%的物種變量，第2主成分PC2解釋20.56%的物種變量，第3主成分PC2解釋20.1%的物種變量。冬蟲夏草產(chǎn)地與非產(chǎn)地土壤細(xì)菌類群差異明顯，三軸累計貢獻(xiàn)率達(dá)82.92%。J4樣品距離J1、J2和J3較遠(yuǎn)，說明非產(chǎn)冬蟲夏草土壤細(xì)菌組成與產(chǎn)冬蟲夏草土壤有一定差異。J2和J3有更相對相似的菌群組成。

3 討論與結(jié)論

對自然生冬蟲夏草周際土壤微生物和土壤理化性質(zhì)進(jìn)行分析，土壤理化性質(zhì)結(jié)果顯示，冬蟲夏草產(chǎn)地與非冬蟲夏草產(chǎn)地土壤理化性質(zhì)存在一定差異，產(chǎn)冬蟲夏草的土壤中有相對較高的AP和AK，相對較低的pH、OM、TN和AN。Rhodococcus能釋放氮素可能是引起非冬蟲夏草產(chǎn)地總氮含量較高的關(guān)鍵因子[30]。從重金屬分析數(shù)據(jù)來看，在非產(chǎn)冬蟲夏草產(chǎn)地J4土壤重金屬Cd、Pb和As均顯著高于冬蟲夏草產(chǎn)地，土壤Hg含量沒有顯著差異。蟲草產(chǎn)區(qū)土壤的AP和AK含量明顯高于非蟲草產(chǎn)區(qū)，這與常毓巍等[17]的研究結(jié)果一致，這可能與OM和土壤各種酶活性相關(guān)，冬蟲夏草產(chǎn)地土壤有機(jī)質(zhì)分解較快，促進(jìn)了AP和AK的轉(zhuǎn)化，提高了土壤的養(yǎng)分，進(jìn)而影響了冬蟲夏草的出草，成為同海拔、氣候和含水量等影響出草的關(guān)鍵因子。在冬蟲夏草產(chǎn)地中含有相對豐度較高的Rhodoplanes、Ralstonia、Ochrobactrum等屬，據(jù)文獻(xiàn)介紹[25,29]這些菌屬有分解轉(zhuǎn)化重金屬的能力，可能是這些菌屬的存在降低了冬蟲夏草產(chǎn)地土壤的重金屬含量。從土壤理化性質(zhì)與土壤細(xì)菌門的相關(guān)性分析來看，土壤理化因子對土壤細(xì)菌門影響很顯著，4個樣地存在一定差異，pH對Chloroflexi影響最顯著，該菌不能培養(yǎng)，且具有聚集磷元素的功能[31]，厚壁菌門Firmicutes與土壤Cd和Pb呈強(qiáng)負(fù)相關(guān)性，這都與本文研究結(jié)果具有一致性，說明土壤細(xì)菌菌群組成對土壤理化和土壤動植物、微生物等均有顯著影響。

pH是影響土壤微生物組成的關(guān)鍵因子，在本研究結(jié)果中相對豐度較高的Proteobacteria與Hg、AN和OM呈正相關(guān)；Acidobacteria與AP呈正相關(guān)，與OM、TN、Pb和As呈負(fù)相關(guān)；Actinobacteria與AK和OM呈正相關(guān)，與TN、AN、AP、Cd、Pb、Hg和As呈負(fù)相關(guān)，說明在冬蟲夏草產(chǎn)地能否出草是多方面綜合影響的結(jié)果，與蝙蝠蛾、土壤理化、微生物組成均密切相關(guān)。冬蟲夏草是冬蟲夏草菌寄生在蝙蝠蛾科幼蟲上形成的蟲菌復(fù)合體[32]。在人工種植環(huán)境下發(fā)現(xiàn)，土壤細(xì)菌是影響冬蟲夏草菌能否正常感染蝙蝠蛾的關(guān)鍵[33]，李輝等[34]對采摘自四川康定等地的野生蟲草進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)變形菌門Proteobacteria、厚壁菌門Firmicutes和擬桿菌門Bacteroidetes是冬蟲夏草的主要優(yōu)勢菌門，這與本研究在冬蟲夏草產(chǎn)區(qū)土壤的結(jié)果一致。Zhang等[35]對冬蟲夏草進(jìn)行了研究，指出 Ascomycota（88.0%）、Basidiomycota（3.3%）和Zygomycota（8.7%） 為冬蟲夏草相對豐度前三的門。

Xia等[36]對青藏高原的5個地點的中國冬蟲夏草樣品，采用高通量測序方法研究相關(guān)細(xì)菌群落組成和多樣性，結(jié)果其優(yōu)勢菌群為Proteobacteria和Actinobacteria，這與本研究結(jié)果較一致。本文介紹了冬蟲夏草成熟期土壤細(xì)菌和土壤因子的組成情況，分析了冬蟲夏草孢子彈射期土壤理化和土壤細(xì)菌組成的關(guān)系，找出了部分關(guān)鍵優(yōu)勢菌屬，但是關(guān)于其影響冬蟲夏草彈射孢子的機(jī)理機(jī)制和在冬蟲夏草生長整個周期所期的關(guān)鍵性作用還有待深入研究。