雷蘇煒，蔡 超，謝意珍，潘鴻輝

（廣東省科學院微生物研究所，華南應用微生物國家重點實驗室，廣東省微生物安全與健康重點實驗室，廣東 廣州 510000）

乳腺癌（breast cancer）是女性發(fā)病中最為常見的惡性腫瘤，2018年全球女性乳腺癌新發(fā)病例約有210萬，其死亡率位列所有腫瘤的第2位[1]。據預測，到2050年，全球女性乳腺癌的發(fā)病率將達到每年約320萬例[2]。由于日益“西化”的生活方式，亞洲地區(qū)的發(fā)病率預計將大幅上升[3]。因此，全球乳腺癌發(fā)病率很可能受到亞洲地區(qū)變化的嚴重影響，特別是中國和印度[4-5]。在我國上海，每年就有5.6%的新增病例，且發(fā)病逐漸趨于年輕化[6]。雖然乳腺癌診斷和治療的方法已經非常先進，其存活率高于其他癌癥，但死亡率仍然很高[7]。腫瘤的復發(fā)與轉移是乳腺癌患者愈后不良的重要原因，也是其死亡的主要原因[8]?；熓悄壳叭橄侔┲委熥畛Ｓ玫闹委煼绞街?，然而化療中使用的藥物通常對正常細胞有毒性[9]，例如阿帕替尼可導致白細胞減少，高血壓，食欲不振和癌痛[10]。因此尋找更加有效的治療藥物是當前的重要課題。

食（藥） 用菌具有多種生理功能，包括抗氧化[11]、抗腫瘤[12]、免疫調節(jié)[13]、抗病毒[14]和抗糖尿病[15]等。這些食（藥） 用菌中的主要活性成分是多糖，其可以通過與細胞表面受體相結合以介導免疫反應，從而達到抗腫瘤的作用[16]。皺蓋假芝（Amauroderma rude） 屬于靈芝科 （Ganoder-mataceae） 假芝屬（Amauroderma），具有重要的藥用價值，主要分布于我國華南地區(qū)[17]。本試驗室曾對皺蓋假芝多糖進行抗腫瘤活性研究，結果顯示其抗腫瘤活性優(yōu)于其他12種食用菌，且差異顯著，尤其是對乳腺癌細胞的抑制更為突出[18]。Pan等[19]進一步證明，皺蓋假芝多糖可顯著抑制乳腺癌小鼠的腫瘤生長，并改善腫瘤小鼠的生活質量。為了進一步研究皺蓋假芝多糖對乳腺癌細胞的抑制作用，采用四甲基偶氮唑鹽（MTT） 法、Transwell試驗、流式細胞術法檢測皺蓋假芝多糖對人乳腺癌（MDA-MB-231、MB-231） 細胞與鼠乳腺癌（4T-1）細胞的抑制效果，為皺蓋假芝多糖的抗腫瘤研究提供科學數據。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

皺蓋假芝（Amauroderma rude） 子實體，購自廣東粵微食用菌技術有限公司，經廣東省微生物研究所食用菌研究發(fā)展中心鑒定。

1.2 供試細胞

人乳腺癌（MDA-MB-231） 細胞、鼠乳腺癌（4T-1）細胞，中國科學院上海生命科學研究院。

1.3 試劑與儀器

Dulbecco’s ModifiedEagle Media（DMEM） 培養(yǎng)液、胰酶，美國Invitrogen公司；胎牛血清（FBS），美國Hyclone公司；噻唑藍（MTT），美國Sigma公司。Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒（AP101）、細胞周期檢測試劑盒（CCS012），杭州聯(lián)科生物技術股份有限公司；組織培養(yǎng)板，美國Nunc Inc公司；Corning Transwell小室購自北京索萊寶科技有限公司。Olympus IX71顯微鏡，日本Olympus公司；Synergy HT多功能微孔板檢測儀，美國Bio-tek公司。

1.4 細胞培養(yǎng)

用含 1%鏈霉素和 10%胎牛血清 （FBS） 的DMEM培養(yǎng)液進行MB-231細胞與4T-1細胞培養(yǎng)，細胞濃度為1×105個/mL。將含有10%FBS的DMEM細胞懸液接種于96孔組織培養(yǎng)板上，每孔100 μL；置于37℃、5%CO2的Thermo Forma 3110組織培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h。

1.5 細胞形態(tài)學觀察

將MB-231細胞與4T-1細胞以1×105個/mL的密度接種于96孔板，4 h之后分別加入0、100 μg·mL-1、200 μg·mL-1、300 μg·mL-1、400 μg·mL-1的皺蓋假芝多糖，孵育48 h后用甲醇固定，然后用吉姆薩染色拍照。

1.6 細胞增殖和抑制率檢測

將MB-231細胞與4T-1細胞以1×105個/mL的密度接種于96孔板，4 h后分別加入0、100 μg·mL-1、200 μg·mL-1、300 μg·mL-1、400 μg·mL-1的皺蓋假芝多糖，孵育44 h后每孔加入20 μL MTT，4 h后加入150 μL的DMSO測定OD490；以OD490值為縱坐標、濃度為橫坐標繪制細胞生長曲線圖。

1.7 Transwell細胞侵襲試驗

將4T-1細胞以1×105個/mL的濃度接種于Transwell侵襲小室上室，分別加上 0、100 μg·mL-1、200 μg·mL-1、300 μg·mL-1、400 μg·mL-1的皺蓋假芝多糖，下室中加入含5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液。孵育22 h后，用棉簽輕輕刮去膜上室面的細胞，以甲醛固定和吉姆薩染色，然后在顯微鏡下進行拍照與細胞計數；以每個孔的上、下、左、右4個方位計數總和為縱坐標、濃度為橫坐標繪制細胞生長曲線圖。

1.8 細胞周期分析

將MB-231細胞以2×105個/mL的密度接種于12 孔板，4 h 后加入 0、100 μg·mL-1、200 μg·mL-1、300 μg·mL-1、400 μg·mL-1的皺蓋假芝多糖培養(yǎng) 48 h后，收集細胞；用1 mL PBS離心洗滌1次后，每管加入1 mL的DNA staining solution，渦旋振蕩5 s～10 s秒混勻；室溫避光孵育30 min；上流式細胞儀檢測分析細胞周期。

1.9 流式細胞儀檢測凋亡

將MB-231細胞以2×105個/mL的密度接種于12 孔板，4 h 后加入 0、100 μg·mL-1、200 μg·mL-1、300 μg·mL-1、400 μg·mL-1的皺蓋假芝多糖培養(yǎng) 48 h后，收集細胞；用預冷的PBS離心洗滌2次后，每管加入 500 μL 的 1× Binding Buffer、10 μL 的PI與5 μL的Annexin V-FITC，室溫避光孵育 5 min后，上流式細胞儀檢測分析細胞凋亡。

2 結果與分析

2.1 皺蓋假芝多糖對乳腺癌MB-231與4T-1細胞形態(tài)的影響

不同濃度皺蓋假芝多糖處理MB-231與4T-1細胞48 h后，使用吉姆薩染色，在高倍鏡（400倍）下拍攝MB-231與4T-1細胞，MB-231與4T-1細胞形態(tài)的變化見圖1。

腫瘤細胞一般有不同于正常細胞的形態(tài)特征。如圖1所示，與空白對照組比較，隨著皺蓋假芝多糖濃度的增加，MB-231與4T-1的細胞壞死，如核固縮深染、碎裂、溶解，細胞皺縮，細胞周圍出現(xiàn)空泡、凋亡小體形成。表明皺蓋假芝多糖可以抑制乳腺癌細胞MB-231與4T-1的生長。

2.2 皺蓋假芝多糖對乳腺癌MB-231與4T-1細胞增殖能力的影響

不同濃度的皺蓋假芝多糖處理MB-231與4T-1細胞44 h后，皺蓋假芝多糖對乳腺癌細胞增殖能力的影響見圖2。

不同濃度的皺蓋假芝多糖處理MB-231與4T-1細胞44 h后，圖2A為在高倍鏡下（100倍） 拍攝MB-231與4T-1的細胞圖；圖2B為采用MTT法檢測細胞增殖；圖2C為細胞抑制率。如圖2所示，與空白對照組比較，隨著皺蓋假芝多糖濃度的增加，其細胞密度、細胞數逐漸降低，抑制率逐漸升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。當濃度為200 μg·mL-1的皺蓋假芝多糖作用于MB-231細胞與4T-1細胞時，細胞抑制率分別為26.02%和20.35%。結果表明，皺蓋假芝多糖抑制乳腺癌MB-231與4T-1細胞的增殖，且細胞抑制率隨AR濃度升高而升高。

2.3 皺蓋假芝多糖對乳腺癌4T-1細胞侵襲的影響

細胞侵襲是腫瘤死亡的主要原因，通過Transwell細胞侵襲試驗檢測皺蓋假芝多糖對4T-1細胞侵襲的作用。采用Transwell小室試驗分析不同濃度皺蓋假芝多糖處理4T-1細胞的侵襲能力，孵育22 h后，使用吉姆薩染色，在高倍鏡（100倍） 下拍攝4T-1細胞的圖片，結果見圖3。4T-1細胞侵襲數的比較結果見表1。

表1 4T-1細胞侵襲數的比較 (n±3)Tab.1 Comparison of 4T-1 cell invasion numbers(n±3)

由圖3、表1可知，與空白對照組比較，隨著濃度的增加，4T-1細胞穿透Transwell侵襲小室上室的細胞數明顯減少，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。表明皺蓋假芝多糖可以抑制4T-1的細胞侵襲。

2.4 皺蓋假芝多糖對乳腺癌MB-231細胞周期的影響

細胞周期維持著細胞按序增殖及基因組穩(wěn)定，而腫瘤一般伴隨著細胞周期的紊亂。利用流式細胞術檢測皺蓋假芝多糖對MB-231細胞周期的作用，不同濃度皺蓋假芝多糖作用MB-231細胞48 h后，采用流式細胞儀分析細胞周期，結果見表2。

表2 皺蓋假芝多糖對MB-231細胞周期的影響(n±3)Tab.2 Effects of Amauroderma rude polysaccharides on MB-231 cell cycle(n±3)

由表2可知，與空白對照組比較，MB-231的G2/M期細胞總比例隨皺蓋假芝多糖濃度呈依賴性下降，S期細胞總比例隨濃度呈依賴性上升。結果表明，皺蓋假芝多糖可將MB-231細胞阻滯在S期。

2.5 皺蓋假芝多糖對乳腺癌MB-231細胞凋亡的影響

腫瘤的產生不僅與細胞異常增殖和遷移有關，細胞凋亡也被認為是抗癌作用最關鍵的一環(huán)。不同濃度皺蓋假芝多糖作用MB-231細胞48 h后，利用流式細胞術檢測皺蓋假芝多糖對MB-231細胞凋亡的作用，結果見圖4。

由圖4可知，與空白對照組比較，MB-231細胞的凋亡數明顯上升，分別達到20.7%、25%、28.1%、35.1%，且具有濃度依賴性。表明皺蓋假芝多糖促進MB-231細胞的凋亡。

3 討論

研究證明，抑癌機制錯綜復雜，其中包括調節(jié)信號轉導途徑、抑制細胞增殖、誘導細胞凋亡和抑制腫瘤轉移等[20]。因此驗證藥物產生作用的機制，是抗癌藥物開發(fā)的重要內容。近年來，多糖作為天然抗癌藥物，因其具有顯著的抗癌活性和較少的副作用而受到越來越多癌癥專家和學者的關注[21]，多糖不僅抑制腫瘤細胞增殖，而且可以結合化療直接誘導細胞凋亡[22]。數千年來，菌類一直是重要的可食用和藥用資源。而大量研究證明，槐栓菌（Trametes robiniophila）、云芝（Coriolus versiolor）、灰樹花（Grifola frondosus）、香菇 （Lentinus edodes） 等菌類多糖被證實具有多種藥理活性[23-27]。Hu等[23]發(fā)現(xiàn)槐栓菌多糖可抑制三陰性乳腺癌細胞的增長。此次研究結果發(fā)現(xiàn)，以不同濃度的皺蓋假芝多糖處理后，乳腺癌細胞MB-231與4T-1的增殖率明顯降低，細胞也隨著濃度的升高而碎裂、溶解，細胞核皺縮。而且，Daniel等[24]發(fā)現(xiàn)，云芝與灰樹花的多糖不僅能夠直接抑制人結腸癌細胞的增殖，而且能夠抑制細胞非依賴性生長、遷移和侵襲。本次試驗結果顯示，皺蓋假芝多糖能顯著抑制4T-1細胞的侵襲數。Wang等[25]發(fā)現(xiàn)香菇多糖可抑制結腸癌細胞增殖并誘導細胞凋亡。猴頭菇（Hericium erinaceus） 多糖被證實可促進胃癌細胞周期阻滯在S期與誘導細胞凋亡以抑制細胞增殖[26]。靈芝多糖可以抑制宮頸癌細胞的活性和侵襲，阻斷細胞周期并促進宮頸癌細胞的凋亡[27]。本研究發(fā)現(xiàn)，皺蓋假芝多糖處理MB-231細胞48 h后，細胞在S期所占百分比逐漸升高，而在G2/M期所占百分比逐漸降低，細胞凋亡數明顯上升，即皺蓋假芝多糖能顯著促進腫瘤細胞的凋亡。Chen等[28]證實，經灰樹花多糖處理肝癌細胞后，caspase-9和caspase-3蛋白含量增加，促進Bax蛋白的表達并抑制Bcl-2蛋白的表達，這表明灰樹花多糖可通過線粒體介導的細胞凋亡途徑抑制肝癌細胞增殖。Wang等[25]與Ya等[29]證實，香菇多糖可通過線粒體介導的細胞凋亡途徑抑制結腸癌細胞與宮頸癌細胞增殖。香菇多糖還可通過抑制Wnt/βcatenin信號通路減少甲狀腺癌荷瘤小鼠腫瘤的增殖[30]。Lemieszek等[31]發(fā)現(xiàn)牛肝菌多糖和糖蛋白可通過調節(jié)p16/cyclinD1/CDK4-6/pRb通路抑制人結腸腺癌LS180細胞的增殖，誘導G0/G1期細胞周期阻滯。此次研究前期發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXO3a參與了皺蓋假芝多糖抑制腫瘤細胞的過程，但相關信號調節(jié)通路并不清楚，下一步將對調節(jié)通路進行研究。

4 結論

此次研究結果顯示皺蓋假芝多糖可顯著抑制乳腺癌細胞MB-231和4T-1增殖，并能抑制4T-1侵襲，還可誘導MB-231細胞周期阻滯于S期，并引起細胞凋亡的形態(tài)變化，從而加速其凋亡。根據本項研究，皺蓋假芝多糖可作為乳腺癌的抗腫瘤藥物進行進一步評估。然而，皺蓋假芝多糖的分子機制和藥代動力學仍需進一步研究，以為其抗乳腺癌提供更強有力的證據。