鄭 旋，康 超，楊 玲，向 準，王萬坤，王 芳，楊彝華

（貴州省生物研究所，貴州 貴陽 550009）

羊肚菌（Morchella spp.）屬子囊菌門（Ascomycota） 盤菌綱 （Pezizomycetes） 盤菌目 （Pezizales）羊肚菌科 （Morchellaceae） 羊肚菌屬 （Morchella）[1]，又名羊肚菜、羊肚蘑等，因其菌蓋表面凹凸不平，形似羊肚而得名，是一種珍貴的食（藥）用菌。羊肚菌具有化痰理氣，益腸胃[2]，抗氧化、抗腫瘤及保肝保腎等功效，兼具食用價值和藥用價值[3]，市場價格高，但深受人們喜食。羊肚菌是羊肚菌屬所有種類的統(tǒng)稱，并非單一物種，常見品種有黑脈羊肚菌（M.angusticeps）、粗柄羊肚菌 （M.crassipes）、美味羊肚菌（M.esculenta）、梯棱羊肚菌（M.importuna）、六妹羊肚菌（M.sextelata） 等[4]。目前國內(nèi)羊肚菌栽培品種主要為梯棱羊肚菌（M.importuna）、六妹羊肚菌（M.sextelata） 和七妹羊肚菌（M.septimelata）[4-5]，栽培方式主要采用固體菌種大田栽培、林下栽培2種模式[6]。固體種在栽培過程中存在成本高、勞動強度大、栽培周期長、污染率高等問題[7]，無法滿足羊肚菌規(guī)?；耘嘈枨蟆６捎靡后w菌種栽培，具有發(fā)菌時間短、生長速度快、萌發(fā)點多、污染率低、成本低廉等優(yōu)勢[8-9]。目前，金針菇、杏鮑菇等食用菌已經(jīng)開展了液體菌種工廠化栽培[10-11]，而羊肚菌的液體菌種生產(chǎn)還處于探索階段。研究羊肚菌液體菌種生產(chǎn)技術(shù)，對羊肚菌的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展具有重要意義。近幾年，羊肚菌液體培養(yǎng)研究主要集中在碳源、氮源，溫度、pH、接種量等因素對菌絲生物量[12-16]及對胞外多糖產(chǎn)量的影響[9]。因此，通過考察不同培養(yǎng)條件對羊肚菌菌絲生長形態(tài)的影響，可為羊肚菌液體培養(yǎng)條件優(yōu)化和菌種制備提供一定依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種

試驗采用國內(nèi)栽培面積較大的六妹羊肚菌（M.sextelata），GZCC 0016菌株分離自貴州省銅仁市石阡縣采集的鮮標本，保存于貴州省生物研究所。

1.2 試劑

葡萄糖、KH2PO4、MgSO4·7H2O、NaNO3、FeSO4、腐殖酸酸鈉均為分析純，酵母粉、蛋白胨、酵母膏均為生化試劑，馬鈴薯、黃豆粉、腐殖土等為市購。

1.3 儀器

LDZX-75KBS立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；SW-CJ-2D超凈工作臺，蘇州凈化設備有限公司；MGC-300H人工氣候箱、DHP-9082恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學儀器有限公司；ZWY-1102恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海智誠分析儀器制造有限公司；TGL-16臺式離心機，四川蜀科儀器有限公司；GZX-9140MBE鼓風干燥箱，上海博訊實業(yè)有限公司。

1.4 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基（PDA）：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g，自來水1 000 mL，pH自然；PDA加富培養(yǎng)基（PDAP）：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g，KH2PO41.5 g、MgSO4·7H2O 1.0 g，水 1 000 mL，pH自然；黃豆粉加富培養(yǎng)基（PHD）：黃豆粉5 g～10 g、葡萄糖20 g、蛋白胨1 g，酵母粉0.5 g，水1 000 mL，pH自然；普通標準培養(yǎng)基（PT）：葡萄糖10 g、酵母膏2 g、瓊脂 20 g，KH2PO40.5 g，水1 000 mL，pH自然；葡萄糖硝酸鈉培養(yǎng)基（NA）：葡萄糖 30 g、瓊脂 20 g，NaNO31.5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、KH2PO41.0 g，F(xiàn)eSO40.01 g，水 1 000 mL，pH自然；土汁培養(yǎng)基（PTZ）：馬鈴薯200 g、腐殖土 100 g、葡萄糖 20 g、瓊脂 20 g，水 1 000 mL，pH自然；腐殖酸鹽培養(yǎng)基（PFZ）：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g，腐殖酸酸鈉0.5 g，水1 000 mL，pH自然；液體種基礎培養(yǎng)基（PD）：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g，自來水1 000 mL，pH自然。

以上培養(yǎng)基均121℃滅菌30 min，備用。

1.5 試驗方法

1.5.1 菌種活化

將保存的六妹羊肚菌GZCC 000016菌株接種到PDA平板（直徑9 cm），活化5 d～7 d，備用。

1.5.2 不同固體培養(yǎng)基中羊肚菌菌絲的變化

分別將1.4中的培養(yǎng)基制作成平板（直徑9 cm）培養(yǎng)基，挑取活化的六妹羊肚菌菌塊（0.3 cm2）1塊接種于培養(yǎng)基中央，重復3次，25℃恒溫黑暗培養(yǎng)32 d，測定培養(yǎng)期內(nèi)菌絲疏密度、長勢、顏色、生長速率等指標。

1.5.3 液體種培養(yǎng)條件單因素試驗

1） 添加玻璃珠試驗

配置液體種基礎培養(yǎng)基（PD），500 mL培養(yǎng)瓶裝液100 mL，分別添加10顆、20顆、30顆、50顆、100顆、150顆、200顆玻璃珠，重復3次，121℃滅菌30 min。冷卻至室溫后，接種3塊0.5 cm2活化后的六妹羊肚菌菌塊，置于恒溫振蕩器上，150 r·min-1、25℃恒溫黑暗培養(yǎng)5d，以不加玻璃珠為對照試驗。測定液體培養(yǎng)液中菌絲球數(shù)量、大小、菌絲生物量、菌液顏色等。

2）增稠劑篩選試驗

根據(jù)前期預試驗結(jié)果，按質(zhì)量、體積濃度分別在PD培養(yǎng)基中添加0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%海藻酸鈉 （SA），及 0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%、1.1%、1.3%、1.5%羧甲基纖維素鈉（CMC-Na），共13種處理，每個處理3次重復，500 mL玻璃三角瓶裝液100 mL，121℃滅菌30 min。冷卻至室溫后，接種3塊0.5 cm2活化的六妹羊肚菌菌塊，置于恒溫振蕩器上，150 r·min-1、25℃恒溫黑暗培養(yǎng)5 d，以不加粘稠劑為對照試驗。測定液體培養(yǎng)液中菌絲球數(shù)量、大小、菌絲生物量、菌液顏色等。

3） 靜置培養(yǎng)試驗

在添加增稠劑試驗的基礎上，配置PD+增稠劑培養(yǎng)基，500 mL玻璃三角瓶裝液100 mL，121℃滅菌30 min。冷卻至室溫后，接種3塊0.5 cm2活化的六妹羊肚菌菌塊，在25℃恒溫黑暗條件下，先分別靜置培養(yǎng)0、1 d、2 d、3 d、4 d、5 d，后置于恒溫振蕩器上，150 r·min-1分別培養(yǎng)5 d、4 d、3 d、2 d、1 d、0，以不添加增稠劑為對照試驗。測定液體培養(yǎng)液中菌絲球數(shù)量、大小、菌絲生物量、菌液顏色等。

4）裝液體積篩選試驗

在前期試驗基礎上，分別在500 mL玻璃三角瓶中添加50 mL、100 mL、150 mL、200 mL、250 mL、300 mL、350 mL、400 mL的液體培養(yǎng)基，121℃滅菌30 min。冷卻至室溫后，接種3塊0.5 cm2活化的六妹羊肚菌菌塊，置于恒溫振蕩器上，150 r·min-1、25℃恒溫黑暗培養(yǎng)5 d，測定液體培養(yǎng)液中菌絲球數(shù)量、大小、菌絲生物量、菌液顏色等。

1.5.4 培養(yǎng)條件正交試驗

通過單因素試驗方法對靜置天數(shù)，培養(yǎng)基粘度，裝液體積3個因素進行篩選，以最優(yōu)結(jié)果進行正交試驗設計，因素與水平表見表1。

表1 L9(34)正交試驗設計因素及水平表Tab.1 Orthogonal experiment factors and levels of L9(34)

1.5.5 菌絲球計數(shù)

培養(yǎng)完成后，分別取1 mL不同處理的培養(yǎng)液，加蒸餾水稀釋至10 mL并搖勻，取1 mL稀釋液倒入底面有方格的平板中，置于黑色背景下，記錄菌絲球數(shù)量[16]。

1.5.6 菌絲生物量測定

培養(yǎng)完成后，過濾三角瓶內(nèi)的培養(yǎng)液，收集過濾后的菌絲體置于墊有聚丙烯薄膜的玻璃平板內(nèi)，并在55℃烘箱中烘干至恒重，記錄羊肚菌菌絲體生物量。

1.5.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基對羊肚菌菌絲形態(tài)影響

考察不同培養(yǎng)基中羊肚菌菌絲的生長狀態(tài)，結(jié)果見圖1、表2。

表2 不同培養(yǎng)基對羊肚菌菌絲生長的影響Tab.2 Effects of different mycelium on the growth of Morchella sextelata

由圖1可知，隨著培養(yǎng)時間的增加，菌落顏色逐漸變深，產(chǎn)生由“白色→灰白→黃色→棕色”的變化。PHD、PTZ、PFZ培養(yǎng)基中菌絲量大，菌絲較細，致密，氣生菌絲多，貼壁生長，菌絲呈帚狀分支；NA、PT培養(yǎng)基中菌絲量較少，菌絲較粗、稀、氣生菌絲少，絨毛狀；在PDA、PDAP培養(yǎng)基中生長適中。表明各培養(yǎng)基均適合羊肚菌生長，且生長速率快，后續(xù)試驗則以PDA培養(yǎng)基為活化培養(yǎng)基。不同培養(yǎng)基對六妹羊肚菌菌絲生長的影響見表2。

由表2可知，隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加，菌落直徑逐漸增加。PHD、PTZ、NA、PFZ、PT培養(yǎng)基中菌絲生長最快，到第3天則鋪滿整個平板，PDA、PDAP培養(yǎng)基中生長較慢；第4天鋪滿平板。其中NA培養(yǎng)基中菌絲萌發(fā)最快，在接種后的4 h～6 h時后即開始萌發(fā)，PT培養(yǎng)基菌絲萌發(fā)最慢。通過對前5 d菌絲日平均生長速率的統(tǒng)計，不同培養(yǎng)基中羊肚菌菌絲生長速率表現(xiàn)不同。第1天時，NA培養(yǎng)基中菌絲生長速率最快，隨后趨于平緩，于第3天后下降；PT培養(yǎng)基中日平均生長速率最慢，隨培養(yǎng)時間的增加，第3天時生長速率最快，隨后下降。

2.2 玻璃珠對羊肚菌菌絲的影響

考察液體培養(yǎng)基中添加不同數(shù)量玻璃珠對羊肚菌菌絲形態(tài)的影響，結(jié)果見表3。

表3 玻璃珠數(shù)量對羊肚菌菌絲形態(tài)的影響Tab.3 Effects of glass beads on the mycelium morphology of Morchella sextelata

從表3可以看出，無論是否添加玻璃珠，羊肚菌菌絲均僅形成一個團塊狀菌絲（菌絲團），而無菌絲球的形成。且隨著玻璃珠數(shù)量的增加，菌絲團大小和菌絲生物量逐漸減小，但菌絲團大小變化不明顯，而菌絲生物量減少具有顯著性差異。表明培養(yǎng)基中添加玻璃珠，并不能形成菌絲球，且對菌絲生長和菌絲生物量積累有一定抑制作用。

2.3 增稠劑對羊肚菌菌絲的影響

考察液體培養(yǎng)基中添加不同增稠劑對羊肚菌菌絲形態(tài)的影響結(jié)果見表4，增稠劑對羊肚菌菌絲生物量的影響見圖2，增稠劑對羊肚菌菌絲濃度的影響見圖3。

表4 增稠劑對羊肚菌菌絲形態(tài)的影響Tab.4 Effects of thickening agent on the mycelium morphology of Morchella sextelata

由表4可知，培養(yǎng)基中添加0～0.3%海藻酸鈉時，僅形成菌絲團，而無菌絲球；當添加濃度為0.5%時，培養(yǎng)液菌絲以菌絲團為主，有少量菌絲球形成，但菌絲表面光滑，無毛刺，形似黃豆。由圖2、圖3可知，當海藻酸鈉添加濃度為0.7%～0.9%時，菌絲團變小，菌絲球數(shù)量逐漸增多，且光滑菌絲球減少，放射狀菌絲球增多，至濃度0.9%時，菌絲球密度達0.72×103個/mL。隨著海藻酸鈉濃度增加，菌絲球逐漸形成，但羊肚菌菌絲團大小、菌絲團生物量及生物量總量變化不顯著。

由表4可知，培養(yǎng)基中添加0～0.3%羧甲基纖維素鈉時，僅形成菌絲團，而無菌絲球。由圖2、圖3可知，當添加濃度為0.5%～1.5%時，隨濃度的增加，菌絲團變小，菌絲球數(shù)量逐漸增多，呈放射狀，有毛刺，均勻分布于培養(yǎng)液中，至濃度1.5%時，菌絲球密度達2.39×103個/mL。隨著羧甲基纖維素鈉濃度增加，羊肚菌菌絲團生物量逐漸減少，差異顯著；菌絲球生物量及總生物量逐漸增加，差異顯著；表明添加羧甲基纖維素鈉，有利于羊肚菌菌絲生物量的積累。

結(jié)果表明，菌絲團的形成與增稠劑濃度呈負相關(guān)，菌絲球形成及數(shù)量與增稠劑濃度呈正相關(guān)。且在同一濃度下，羧甲基纖維素鈉能形成放射狀菌絲球，且數(shù)量多，菌絲球小，菌絲球均勻，可認為羧甲基纖維素鈉為最優(yōu)增稠劑。食用菌液體菌種菌絲球密度一般要達到 1.0×103個/mL～1.5×103個/mL[17]，同時結(jié)合生產(chǎn)成本，研究以0.9%濃度為羧甲基纖維素鈉最優(yōu)添加濃度，此時菌絲球密度為1.44×103個/mL。

2.4 靜置培養(yǎng)對羊肚菌菌絲的影響

在添加0.9%濃度羧甲基纖維素鈉增稠劑的基礎上，考察靜置培養(yǎng)天數(shù)對羊肚菌菌絲形態(tài)的影響，結(jié)果見圖4。

從圖4可以看出，對照組菌絲體隨著靜置培養(yǎng)天數(shù)的增加，由菌絲團向菌膜變化，至第5天，菌膜與液面大小一致，并漂浮于液面上。添加羧甲基纖維素鈉菌絲萌發(fā)后則形成小菌絲團和菌絲球，隨著靜置培養(yǎng)時間的增加，菌絲團向菌膜變化，至第5天，菌膜與液面大小一致，并漂浮于液面上，較對照組長勢差；菌絲球則隨靜置培養(yǎng)時間的增加逐漸減少，至第5天，則無菌絲球形成。靜置培養(yǎng)對羊肚菌菌絲生物量及菌絲球密度的影響見圖5。

由圖5A可知，隨著靜置培養(yǎng)天數(shù)的增加，試驗組菌絲球密度呈先上升后下降的趨勢，靜置第1天時，菌絲球密度最大，為2.70×103個/mL；由圖5B可知，菌絲球生物量亦先上升后下降，最大值也在靜置第1天。試驗組和對照組菌絲生物總量先上升后下降，但二者有明顯區(qū)別，試驗組在靜置1 d時最高，對照組在靜置2 d時最高，隨后下降。結(jié)果表明，添加增稠劑，靜置培養(yǎng)1 d為最優(yōu)靜置天數(shù)。

2.5 裝液體積對羊肚菌菌絲的影響

考察液體培養(yǎng)時裝液體積對羊肚菌菌絲形態(tài)的影響，結(jié)果見表5。

表5 裝液體積對羊肚菌菌絲形態(tài)的影響Tab.5 Effects of working volume on the mycelium morphology of Morchella sextelata

從表5可以看出，隨著裝液體積的增加，菌絲團大小和菌團生物量逐漸減少，菌絲球生物量和生物量總量逐漸增加，至最大裝液量時，質(zhì)量均達到最大。當體積達150 mL時，達到菌絲球最大密度3.35×103個/mL，而體積在200 mL、250 mL時，也能獲得較好的菌絲球密度，分別為2.78×103個/mL和3.11×103個/mL。從菌絲球總量看，其變化趨勢也呈先上升后下降的趨勢，當體積達250 mL，菌絲球總量達最大，為7.78×105個。結(jié)合試驗最終目的，即獲得最大菌絲球總量，同時結(jié)合菌絲濃度，以裝液體積250 mL為最優(yōu)體積。

2.6 正交試驗結(jié)果

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，以靜置天數(shù)、增稠劑濃度、裝液體積為試驗因素，設計3因素3水平正交試驗。分別以菌絲生物量，菌絲球密度，菌絲球總量為考察對象，進行正交設計表L9（33），試驗結(jié)果及直觀分析表見表6，各考察對象方差分析表見表7、表8、表9。

表6 L9（33）正交試驗結(jié)果及直觀分析表Tab.6 The L9（33）orthogonal table and visual analysis

表7 羊肚菌菌絲生物量方差分析表Tab.7 Variance test of mycelial biomass for Morchella sextelata

表8 羊肚菌液體種菌絲球密度方差分析表Tab.8 Variance test of concentration of mycelial pellets for Morchella sextelata

表9 羊肚菌菌絲球總量方差分析表Tab.9 Variance test of total number of mycelial pellets for Morchella sextelata

由表6可知，3個試驗因素對羊肚菌菌絲生物量影響的R值大小為RC＞RA＞RB，表明各因素影響順序為C＞A＞B。由表7可知，A、C兩個因素對羊肚菌菌絲生物量影響顯著，其中裝液體積（C）為最主要因素，其次為靜置培養(yǎng)天數(shù)（A），羧甲基纖維素鈉濃度（B）影響不顯著；表明在培養(yǎng)過程中，靜置培養(yǎng)天數(shù)及裝液體積對羊肚菌菌絲生物量的形成具有顯著作用。按照各因素的最優(yōu)水平，A2B3C3水平組合為菌絲生物量試驗最優(yōu)組合。由表8可知，菌絲球密度方差分析模型不顯著，表明各試驗因素對菌絲球密度無顯著影響，通過直觀分析表直接選擇最優(yōu)組合A2B3C3。

從表6可以看出，3個試驗因素對羊肚菌菌絲球總量影響的R值大小為RC＞RA＞RB，表明各因素影響順序為C＞A＞B。從表9看出，A、B、C三個因素對羊肚菌菌絲球總量影響顯著，其中裝液體積（C）為最主要因素，靜置培養(yǎng)天數(shù)（A）為次要因素，羧甲基纖維素鈉濃度（B）影響最小；表明在培養(yǎng)過程中，3個因素對羊肚菌菌絲球總量的形成具有顯著作用。按照各因素的最優(yōu)水平，A2B2C3水平組合為菌絲球總量試驗的最優(yōu)組合。

通過對菌絲生物量及菌絲球總量的分析和比較，分別得出A2B3C3和A2B2C3兩個不同組合，結(jié)合Design-Expert軟件分析及推薦組合（A2B2C3），分別對A2B3C3和A2B2C3組合進行驗證。結(jié)果表明，A2B3C3菌絲生物量（1.73±0.11） g·300-1mL-1，菌絲球總量（8.66±1.24） ×105個；A2B2C3菌絲生物量 （2.45±0.05） g·300-1mL-1，菌絲球總量 （10.65±0.39）×105個；而軟件預測結(jié)果為2.61 g·300-1mL-1，菌絲球總量11.24×105個。試驗結(jié)果與預測結(jié)果接近，故本研究選擇A2B2C3組合，即羧甲基纖維素鈉0.9%，500 mL裝液量300 mL，靜置培養(yǎng)天數(shù)1 d。

3 討論

3.1 培養(yǎng)方法對羊肚菌菌絲生長的影響

試驗比較了不同培養(yǎng)基、玻璃珠、增稠劑、靜置天數(shù)和裝液量對羊肚菌菌絲、生物量和菌絲球密度的影響，不同培養(yǎng)方法對羊肚菌菌絲生長影響差異顯著。研究結(jié)果表明，玻璃珠可以作為菌絲分散劑[18-20]，降低菌絲球的大小，改變菌絲形態(tài)。試驗添加不同數(shù)量玻璃珠后，對羊肚菌菌絲形態(tài)影響不大，僅形成菌絲團，且隨著數(shù)量增加，生物量逐漸減少，表明玻璃珠的剪切力對菌絲生長及生物量積累有抑制作用，與報道一致[20]。

3.2 增稠劑對羊肚菌菌絲生長的影響

增稠劑能明顯改變液體粘性，可以改變真菌菌絲形態(tài)[21-23]。研究選擇食品行業(yè)普遍使用的羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）[24]和海藻酸鈉[25]作為增稠劑，添加低濃度羧甲基纖維素鈉和海藻酸鈉時，只產(chǎn)生菌絲團；隨著濃度增加，菌絲球數(shù)量增多，菌物生物量增加，同等條件下以羧甲基纖維素鈉效果最好。試驗以0.9%的羧甲基纖維素鈉為最優(yōu)濃度。分段培養(yǎng)對菌絲形成及代謝物積累有一定的影響[26-27]，試驗以靜置1 d時，菌絲球及菌絲生物量最大，表明前期靜置培養(yǎng)有利于菌種對培養(yǎng)基環(huán)境適應，利于后期菌絲的形成，而隨著靜置時間增加，菌絲生物量逐漸減少，可能是菌絲萌發(fā)過多，且總培養(yǎng)時間較短，不利于菌絲球及菌絲的形成。

3.3 對羊肚菌生物量的影響

制備液體菌種時，以單次培養(yǎng)獲取最大生物量最佳，但同時要考慮液體培養(yǎng)時，培養(yǎng)基中溶氧量對微生物的影響。試驗以菌絲球密度及菌絲球總量為考察指標，結(jié)果以500 mL裝液300 mL液體培養(yǎng)基為最佳裝液量，菌絲球密度高，菌絲球總量大，較劉達玉等[28]和季向陽等[29]結(jié)果更優(yōu)。對增稠劑、靜置天數(shù)、裝液量進行優(yōu)化試驗，菌絲生物量最大達2.45 g·300-1mL-1（8.17 mg·mL-1），優(yōu)于李紅[12]和金朝霞等[9]的研究結(jié)果。菌絲球密度達到3.55×103個/mL，較許瀛引等[13]的結(jié)果稍高，菌絲球密度高，萌發(fā)點多。

4 結(jié)論

以六妹羊肚菌為試驗材料，通過單因素試驗，正交優(yōu)化試驗對玻璃珠、增稠劑、靜置天數(shù)、裝液體積4個因素進行篩選及優(yōu)化。最優(yōu)培養(yǎng)條件為0.9%羧甲基纖維素鈉，500 mL裝液體培養(yǎng)基300 mL，在25℃黑暗條件下先靜置培養(yǎng)1 d后，150 r·min-1條件培養(yǎng)4 d；菌絲生物量最大可達2.45 g·300-1mL-1，菌絲球密度達到3.55×103個/mL，生物量大，菌球濃度高。為羊肚菌液體菌種制備和液體發(fā)酵培養(yǎng)提供了技術(shù)支撐。