趙建俊，吉建成，于國民，董相軍，徐麗麗**

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)，山東 青島 266109；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)克什克騰旗樺木溝林場，內(nèi)蒙古 赤峰 025366；3.內(nèi)蒙古自治區(qū)克什克騰旗林業(yè)局，內(nèi)蒙古 赤峰 025378）

羊肚菌（Morchella spp.）又稱羊肚子、羊肚蘑、羊肚菜、蜂窩蛾子等，屬于子囊菌亞門（Ascomycota） 盤菌綱 （Pezizomycetes） 盤菌目 （Pezizales） 羊肚菌科（Morchellaceae）[1]，其屬模式菌株是羊肚菌Morchella esculenta(L.)Pers.?！侗静菥V目》中對羊肚菌有“甘寒無毒，益腸胃，化痰利氣”的描述；北美地區(qū)普遍認(rèn)為羊肚菌是最佳食用菌；在歐洲許多國家對其喜愛程度僅次于塊菌（Tuber sp.）[2]。羊肚菌子實體肉質(zhì)鮮美，香脆可口，含有豐富的蛋白質(zhì)、維生素、氨基酸和多糖等有效成分[3]，有較強(qiáng)的抗腫瘤，抗氧化，增強(qiáng)免疫力的作用，可減輕癌癥患者放化療引起的不良反應(yīng)[4]。其內(nèi)還含有一種羊肚菌獨有的特殊的香味物質(zhì)，即脯氨酸類似物，被廣泛應(yīng)用于調(diào)味品和食品添加劑領(lǐng)域[5]。因此，羊肚菌在食品、藥用、保健品、化妝品等領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用前景。

生長環(huán)境及氣候等因素的變化，可能會導(dǎo)致羊肚菌的形態(tài)特征發(fā)生很大改變，甚至同一物種不同發(fā)育階段的形態(tài)也會有較大差異。傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)分類造成了該屬普遍存在同名異物和同物異名現(xiàn)象[2]。核糖體rDNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū) （internal transcribed spacer，ITS）序列分析技術(shù)，因其快速，準(zhǔn)確，簡便而被廣泛應(yīng)用于真菌的分子鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析中[6-7]。然而杜習(xí)慧等[8]發(fā)現(xiàn)基因庫（GenBank） 中約66%的羊肚菌ITS序列均被貼上了錯誤的物種名稱標(biāo)簽?；诤商m皇家藝術(shù)與科學(xué)研究院真菌培養(yǎng)中心（CBSKNAW）網(wǎng)站，由包括我國在內(nèi)的5個單位合作共同構(gòu)建了一個網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫，即羊肚菌多基因序列模標(biāo)數(shù)據(jù)庫 Morchella MLST（multilocus sequence typing，http://www.cbs.knaw.nl/morchella/）[9]。該數(shù)據(jù)庫中收錄了大量準(zhǔn)確鑒定的羊肚菌分子信息。隨著羊肚菌系統(tǒng)發(fā)育學(xué)研究的深入，羊肚菌屬內(nèi)不同種的ITS序列一般只有幾個堿基的差距，僅依靠ITS序列已不能準(zhǔn)確鑒定羊肚菌的種屬關(guān)系，并且從形態(tài)上進(jìn)行不同種的分類也很困難，而多基因系譜一致性系統(tǒng)發(fā)育種識別法（genealogical concordance phylogenetic species recognition,，GCPSR）作為一種更完備的方法在近年來被廣泛應(yīng)用。因此，鑒定采用ITS、rpb1和ef1-α聯(lián)合矩陣序列分析技術(shù)，對收集到的7株羊肚菌菌株進(jìn)行分子鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析，以期為其人工栽培和菌種選育提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

于山東省濰坊市采集到野生羊肚菌6株，由羊肚菌子實體組織分離培養(yǎng)獲得菌絲，編號分別為Me25、Me27、Me30、M51、Me4-1 和 Me1-2；于山東省臨沂市采集野生羊肚菌1株，編號為Me91。

1.1.2 藥品和試劑

分析純試劑葡萄糖、瓊脂、MgSO4·7H2O、KH2PO4、異丙醇、無水乙醇，柱式試劑盒E.Z.N.A.TM Fungal DNA Mini Kit等均購于生工生物工程股份有限公司。

1.1.3 試驗儀器

SW-CJ-2FD雙人單面凈化工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司；PC214電子天平，OHOUS儀器有限公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海?，攲嶒炘O(shè)備有限公司；PCR儀，大龍醫(yī)療設(shè)備有限公司。

1.1.4 供試培養(yǎng)基

CPDA培養(yǎng)基：馬鈴薯20%、葡萄糖2%、瓊脂2%、KH2PO41%，MgSO4·7H2O 0.05%，pH自然。

1.2 試驗方法

1.2.1 傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定

供試菌株樣品參照《大型真菌圖鑒》，按照子實體性狀、大小和顏色等特征進(jìn)行初步鑒定，并結(jié)合菌絲形態(tài)和菌核特性等微觀特征，進(jìn)行傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)分類鑒定[10]。

1.2.2 分子鑒定

1） 菌絲體DNA提取

采用Ezup柱式真菌DNA抽提試劑盒提取DNA，具體步驟詳見試劑盒說明書。

2） 樣品rDNA ITS、rpb1和ef1-α序列PCR擴(kuò)增樣品PCR擴(kuò)增和測序引物見表1。

表1 PCR和測序引物Tab.1 PCR and sequencing primers

PCR擴(kuò)增采用 50 μL體系，其中 2×Taq PCR Master Mix 25 μL，10 μmol·L-1的引物各 2 μL，DNA 模板 2 μL，ddH2O 補(bǔ)齊至 50 μL；ITS 序列PCR反應(yīng)程序為94℃變性4 min，94℃變性1 min，57℃退火1 min，72℃延伸1 min，完成35個循環(huán)，72℃延伸10 min。ef1-α和rpb1的PCR反應(yīng)程序為94℃初始變性 3 min，94℃變性 1 min，50℃退火30 s，72℃延伸1 min，完成35個循環(huán)，72℃最終延伸10 min[11]。PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，電壓為100 V，產(chǎn)物和Marker上樣量均為5 μL，電泳結(jié)果于BioDoc-It UVP凝膠成像系統(tǒng)成像。

3）擴(kuò)增產(chǎn)物的序列測定

將1.2.2中得到的樣品ITS、rpb1和ef1-α序列擴(kuò)增產(chǎn)物直接送至上海生工公司測序。

4）擴(kuò)增產(chǎn)物序列對比及分析

將測序得到的序列，通過NCBI在線Blast，與GenBank中已被測序成功的羊肚菌序列進(jìn)行同源性比對。相關(guān)序列從Morchella MLST數(shù)據(jù)庫下載。采用MEGA 5.0軟件Neighbor-joining聚類分析方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，后用Maximum-parsimony法構(gòu)建聯(lián)合矩陣系統(tǒng)發(fā)育樹，并進(jìn)行聚類分析[12]。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品子實體形態(tài)學(xué)鑒定

樣品子實體參照《大型真菌圖鑒》[10]，按照子實體大小、顏色和形狀等分析，樣品形態(tài)特征見圖1。

由圖1可知，Me25子實體較大，顏色土黃，高12 cm～14 cm，其中菌帽長7 cm～8 cm，表面有不規(guī)則凹坑；菌柄長5 cm～6 cm，污白色，表面光滑。Me27子實體較大，顏色淺土黃，高10 cm～12 cm，菌帽表面凹坑不規(guī)則，凹坑間的脊厚；菌柄5 cm～6 cm，粗壯，污白色，柄基部不膨大。M51子實體較大，顏色灰褐色，高13 cm～15 cm，其中菌帽長6 cm～7 cm，表面凹坑不規(guī)則，脊厚；菌柄長7 cm～8 cm，白色，表面有細(xì)小顆粒，菌柄基部稍膨大。Me91子實體中等大小，顏色土黃，高12 cm～13 cm，菌帽鈍圓，表面有不規(guī)則凹坑，菌柄長，表面不光滑。Me30子實體較小，高約4 cm～6 cm，菌帽頂部鈍圓，淺灰褐色，表面凹坑不規(guī)則，脊厚而脆，菌柄污白色，空心，偶有基部膨大。Me4-1子實體小，高約2 cm～4 cm，淺灰褐色，頂部鈍圓。Me1-2子實體小，高約2 cm～4 cm，土黃色，頂部鈍圓，生于火燒地上。

2.2 樣品ITS、rpb1和ef1-α序列的PCR擴(kuò)增及測序分析

試驗樣品的各位點片段經(jīng)PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，各片段大小見圖2。

將獲得序列通過NCBI在線Blast對比，與Gen－Bank中已被測序成功的羊肚菌序列進(jìn)行同源性比對，相似性超過99%的物種名稱統(tǒng)計結(jié)果見表2。

表2 羊肚菌ITS、rpb1和ef1-α區(qū)序列測序結(jié)果Tab.2 Sequencing results of Morchella spp.ITS、rpb1 and ef1-α fragment

2.3 系統(tǒng)發(fā)育分析

采用MEGA 7.0對樣品序列進(jìn)行排列，采用ITS、rpb1、ef1-α序列聯(lián)合矩陣分析構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖3。

由圖 3可以看出，供試菌株 Me25、Me27、Me51與寬圓羊肚菌Morchella robusta親緣關(guān)系較近，Me30與羊肚菌Morchella esculenta親緣關(guān)系較近，Me91與Morchella sp.Mes-19親緣關(guān)系很近，Me1-2和Me4-1與小海綿羊肚菌Morchella spongiola親緣關(guān)系很近。

3 討論與結(jié)論

由于環(huán)境氣候等外界條件和個體發(fā)育的改變，羊肚菌子實體的形狀、大小等形態(tài)特征會發(fā)生較大變化，單一的傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)分類很難對其進(jìn)行準(zhǔn)確的分類鑒定。采用常規(guī)傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定，并結(jié)合ITS、rpb1、ef1-α序列聯(lián)合矩陣分析，將得到的7株羊肚菌樣品進(jìn)行分類鑒定，確定供試菌株Me25、Me27、Me51為寬圓羊肚菌，Me30為羊肚菌，Me91為羊肚菌屬某種，Me1-2和Me4-1為小海綿羊肚菌。

分子生物學(xué)結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育學(xué)的研究，在真菌的分類鑒定中起到了主要作用[13]。rDNA的ITS、rpb1、ef1-α序列測定及限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR RFLP） 技術(shù)等方法[14]的應(yīng)用，成為了羊肚菌屬分類鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析的有效手段。Taylor等[15]提出了多基因譜系一致性系統(tǒng)發(fā)育學(xué)物種識別法，即通過比對DNA核酸序列，進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，比較拓?fù)鋵W(xué)關(guān)系，從而界定物種。該方法近年來逐漸被廣泛應(yīng)用，解決了分類學(xué)上的諸多問題，為羊肚菌的分類研究提供了新的思路。