李樹文 ，徐麗麗 ，于 浩 ，郭立忠 **

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 青島 266109；2.山東省應(yīng)用真菌重點實驗室，山東 青島 266109）

鹽堿地是一個世界性資源與環(huán)境問題，由于工業(yè)化的快速發(fā)展和人口數(shù)量的急劇膨脹，造成農(nóng)田、山林、牧地的過渡開墾，化肥的過渡使用、植被的過渡破壞甚至是氣候的異常變化，從而加速了土壤的鹽堿化進程。全球鹽漬化土壤面積約為1×109hm2，我國鹽堿地總面積約為0.991×108hm2，為第三大鹽堿地分布國家，其中潛在鹽漬化土壤為0.173×108hm2[1-2]?？梢?，鹽堿地是重要的后備土地資源，其科學(xué)開發(fā)、合理利用對維護生態(tài)平衡、緩解耕地緊缺、推動國民經(jīng)濟發(fā)展及其可持續(xù)發(fā)展具有重要的經(jīng)濟、社會和生態(tài)意義[1-2]。而鹽堿地耐鹽作物或鹽生作物的栽培對其開發(fā)利用及其改良和治理具有重要意義。

羊肚菌（Morchella spp.）因子實體外形似羊肚而得名，是一種名貴的食（藥） 用菌，具有保肝、降血脂、抗腫瘤、抗氧化以及增強免疫力等保健價值[3]。自21世紀初我國掌握了野外栽培羊肚菌的技術(shù)，由于栽培過程簡單、設(shè)施構(gòu)造低廉、產(chǎn)品價值高、可套種農(nóng)作物等特點，羊肚菌栽培得到了迅速而大面積的推廣，2015年～2016年羊肚菌栽培面積達1 600 hm2[4]。關(guān)于羊肚菌在鹽堿地中栽培菌株的篩選、育種以及栽培管理和設(shè)施優(yōu)化等方面的研究未見報道，通過以試驗室目前保存的能進行人工栽培的羊肚菌菌株以及采集的野生菌株為研究對象，從NaCl濃度和pH兩個方面進行耐鹽堿菌種的篩選試驗，為未來鹽堿地栽培羊肚菌的研究提供菌種資源和實踐指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

菌種于2017年3月～4月分別采集于山東省文登市（命名為文登）、山東省煙臺市（命名為煙臺）、山東省諸城市（命名為51號），及試驗室保存種（命名為2-4），其中文登和煙臺鑒定為梯紋羊肚菌（Morchella importuna），2-4為尖頂羊肚菌（Morchella conica），51號是野外采集種，經(jīng)鑒定為尖頂羊肚菌（Morchella conica），保存于山東省應(yīng)用真菌重點試驗室。PDA培養(yǎng)基115℃滅菌30 min，接菌后培養(yǎng)溫度25℃。

1.2 試驗儀器

MLS-3750全自動高壓蒸汽滅菌器，日本三洋（SANYO）；HWS-250恒溫恒濕培養(yǎng)箱，上海淮宇儀器設(shè)備有限公司；THG-9070A鼓風(fēng)干燥箱，蘇州正合測試設(shè)備有限公司；BSA224S電子天平，Sartorius；PHS-3EpH計，上海雷磁；SW-CJ-2D超凈工作臺，蘇州凈化。

1.3 試驗方法

1.3.1 pH對羊肚菌菌絲生長的影響

PDA培養(yǎng)基滅菌后調(diào)節(jié)pH：培養(yǎng)基滅菌后，經(jīng)pH調(diào)節(jié)預(yù)試驗后，在超凈工作臺內(nèi)以無菌操作方式加入已滅菌的1 mol·L-1NaOH，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH為6.71（對照）、7.50、8.09、8.33和 8.50。倒平板，冷卻凝固后接種4株菌株培養(yǎng)2 d時的菌餅（直徑6 mm），各pH接種3個重復(fù)；培養(yǎng)29 h后直尺測量并記錄菌落直徑。

PDA培養(yǎng)基滅菌前調(diào)節(jié)pH：培養(yǎng)基制備時，加入1 mol·L-1NaOH調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH為 6.39（編號PDA-1）、8.34（編號 PDA-2）、9.28（編號 PDA-3）和10.03（編號PDA-4），高壓蒸汽滅菌后測定培養(yǎng)基pH，倒平板，冷卻凝固后接種4株菌株培養(yǎng)2 d時的菌餅（直徑6 mm），各pH接種3個重復(fù)；培養(yǎng)48 h后直尺測量并記錄菌落直徑。

1.3.2 不同濃度NaCl對羊肚菌菌絲生長的影響

選擇在近似于濱海鹽堿地pH（7.5～8.5）[5]的培養(yǎng)基中接種菌絲生長速度最快的菌株進行不同鹽濃度的試驗。將不同質(zhì)量的NaCl加入培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)滅菌后NaCl濃度（w/v） 為0（對照）、1.0%、2.0%、3.0%、3.5%、4.0%、4.5%、5.0%。倒平板，接種過程和測量過程與2.3.1相同。鹽濃度對菌絲生長的抑制率（Y，%）的計算公式為：

式中：CKR為對照菌落直徑（mm）；R為各鹽度菌落直徑（mm）。

1.3.3 耐鹽菌株的傳代馴化

選擇最耐鹽菌株進行傳代馴化試驗，接種過程和測量過程與2.3.1同，傳代馴化流程試驗設(shè)計見圖1～圖3。

如圖1～圖3所示，3%～3%逐級馴化為菌株在不含鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 d后依次轉(zhuǎn)接于含鹽量1%、2%、3%的培養(yǎng)基中，分別培養(yǎng)5 d，后于鹽含量3%的培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 d后測量菌落直徑。0～3%傳代培養(yǎng)為菌株在不含鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 d后連續(xù)轉(zhuǎn)接于不含鹽培養(yǎng)基，分別培養(yǎng)5 d，后于鹽含量3%的培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 d后測量菌落直徑。0～0對照傳代培養(yǎng)為菌株在不含鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 d后連續(xù)轉(zhuǎn)接于不含鹽培養(yǎng)基，分別培養(yǎng)5 d，于最后1個不含鹽培養(yǎng)基培養(yǎng)2 d后測量菌落直徑。

2 結(jié)果與分析

2.1 pH對羊肚菌菌絲生長的影響

試驗選擇了近似濱海鹽堿地的pH（7.50～8.50）[5]。PDA培養(yǎng)基滅菌后調(diào)節(jié)pH，培養(yǎng)29 h后各菌株的菌落直徑見圖4。

由圖4可知，各菌株均可在pH 7.50～8.50內(nèi)生長，其中菌株51號pH在7.50時菌絲生長速率為1.21 mm·h-1，高于對照 1.17 mm·h-1，總體與對照近似；菌株2-4在pH 7.50時菌絲生長速率與對照1.52 mm·h-1相近，但總體低于對照；文登菌絲生長速率在pH 8.09時為1.76 mm·h-1，但總體均低于對照1.79 mm·h-1；煙臺菌株pH在8.33時菌絲生長速度與對照1.48mm·h-1相近，但總體低于對照。不同pH對菌株生長影響的方差分析結(jié)果，見表1。

表1 不同pH條件下各菌株菌落直徑的方差分析Tab.1 Anova analysis of the colony diameters of Morchella spp.under the condition of different pH

由表1可知，試驗設(shè)置的pH對51號菌株、2-4菌株和文登菌株的生長均未有顯著影響（F＜Fcrit，P＞0.05），而對煙臺菌株的生長具有顯著影響（F＞Fcrit，P＜0.05）。結(jié)合圖4試驗整體結(jié)果，各菌株的生長速率快慢為：文登菌株＞2-4菌株＞煙臺菌株＞51號菌株。綜上所述，應(yīng)選擇生長速率快且試驗pH對其生長未有顯著抑制作用的文登菌株和2-4菌株進行后續(xù)試驗。PDA培養(yǎng)基滅菌前調(diào)節(jié)pH，經(jīng)過滅菌后，培養(yǎng)基pH變化見表2。

表2 PDA培養(yǎng)基滅菌前后pH變化情況Tab.2 pH changes before and after sterilizing PDA medium

由表2可知，滅菌后培養(yǎng)基pH均比原來低，且滅菌前pH越高，滅菌后pH下降越快。滅菌前調(diào)節(jié)pH為6.39～10.03，滅菌后pH為6.12～7.14，其對羊肚菌菌落直徑的影響見圖5，滅菌前調(diào)節(jié)PDA培養(yǎng)基pH對羊肚菌菌落直徑的方差分析結(jié)果見表3。

表3 PDA滅菌后pH變化對羊肚菌菌落直徑的方差分析Tab.3 Anova analysis of the colony diameters of of Morchella spp.with changes of pH after sterilizing PDA medium

由圖5、表3可知，滅菌前調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH，其滅菌后對文登和2-4菌株菌絲的生長有顯著影響（P＜0.05），其中對2-4菌株菌絲生長的影響極顯著（P＜0.001），如果依據(jù)該結(jié)論，則得出pH 6.12～7.14對菌絲生長有顯著影響，而與前面的研究結(jié)果不一致。不同羊肚菌生長pH范圍和培養(yǎng)基種類見表4。

表4 不同羊肚菌生長的pH范圍和培養(yǎng)基種類Tab.4 pH ranges and culture media of Morchella spp.in the references

由表4可知，本試驗研究所得羊肚菌菌絲可生長的pH與謝放[6]、陳易飛[7]、肖鋒[8]的研究結(jié)果具有一致性。而李潔[9]、李小燕[10]、周潔[11]的研究表明，pH＞8.00羊肚菌菌絲生長將受到抑制。原因可能是培養(yǎng)基成分產(chǎn)生差異，當(dāng)加入NaOH進行pH調(diào)節(jié)高壓滅菌后，導(dǎo)致沉淀物的生成或發(fā)生美拉德反應(yīng)[12]，不利于菌絲生長；或者培養(yǎng)基pH的調(diào)節(jié)造成，培養(yǎng)基滅菌前調(diào)節(jié)的pH與滅菌后培養(yǎng)基的pH存在差異[13]，滅菌后pH變化太大時抑制菌絲生長。

2.2 NaCl濃度對羊肚菌菌絲生長的影響

不同NaCl濃度對2-4及文登菌株菌落直徑的影響見圖6。

由圖6所示，在試驗鹽度范圍內(nèi)（鹽濃度大于1.0%），文登菌株和2-4菌株菌絲均可生長，但隨鹽度的增加，與對照比較，菌絲生長量受到明顯抑制。鹽度對2株菌的抑制率不同，文登菌株在各鹽度下的耐鹽能力均高于2-4菌株，鹽濃度5.0%時，其對2-4菌株和文登菌株的抑制率分別為92%和86%，可見文登菌株耐鹽性更強。隨培養(yǎng)時間的延長，2株菌株均能在高鹽的培養(yǎng)基中生長，但菌絲生長速率存在差異。不同培養(yǎng)時間段鹽度對菌絲生長速度的影響見圖7，其抑制率結(jié)果見表5。

表5 鹽度對菌絲生長的抑制率（105 h）Tab.5 The inhibition rate of salt concentration on mycelial growth(105 h)

由圖7、表5可知，對于2-4菌株，在3.0%～3.5%鹽濃度下，后期培養(yǎng)（培養(yǎng)時間為105 h～132 h）生長速率略有下降外，其他濃度后續(xù)培養(yǎng)的速率均高于前期培養(yǎng)（培養(yǎng)時間為48 h～105 h） 速率。對于文登菌株，在3.5%～4.5%鹽濃度下，后期生長速率明顯下降，尤其在3.5%～4.0%時的鹽濃度；2.0%～3.0%鹽濃度下生長速率前期與后期基本一致或后期生長速度略高于前期；當(dāng)鹽濃度達到5.0%時，后期菌絲生長速率高于前期。雖然鹽濃度對文登菌株的生長速率影響較大，但是在各鹽濃度的培養(yǎng)基上，文登菌株的生長速率均高于2-4菌株，所以后續(xù)耐鹽試驗將以文登菌株為馴化對象以期提高其耐鹽性。

2.3 耐鹽菌株馴化

對文登菌株進行3組馴化試驗，其馴化結(jié)果見圖8。馴化菌株與未馴化菌株菌落直徑的差異性分析見表6。

表6 馴化菌株與未馴化菌株菌落直徑的差異性分析Tab.6 Difference analysis of colony diameters between acclimated strain and original strain

由圖8、表6可知，以文登菌株為試驗對象，采用逐級增加鹽濃度（3%～3%） 的方式進行耐鹽菌株馴化，結(jié)果表明在鹽度3%的培養(yǎng)基中，雖然馴化后菌株菌落直徑（18.2 mm） 略高于未經(jīng)馴化（15.5 mm），但是逐級馴化后的菌株與未經(jīng)馴化的菌株菌絲生物量之間無顯著差異，F(xiàn)＜Fcrit。還需通過物理、化學(xué)、生物誘變以及基因工程等方法選育耐鹽的新菌株，以進一步適應(yīng)鹽漬化土壤和鹽土環(huán)境的生長。

3 結(jié)論

從pH和NaCl濃度2個方面進行耐鹽堿性羊肚菌菌株的篩選研究，51號菌株、2-4菌株、文登菌株、煙臺菌株均能在鹽堿地的pH范圍內(nèi)生長，其環(huán)境pH對51號菌株、2-4菌株、文登菌株生長無顯著影響，且文登菌株和2-4菌株的生長速率高于51號菌株。耐鹽性研究表明，文登菌株和2-4菌株均可生長在鹽度1.0%～5.0%的培養(yǎng)基中，與對照相比較，隨鹽度的增加，菌絲生長受到明顯抑制，但均具有較強的耐鹽能力，其中文登菌株具有較快的生長速度，但逐級馴化的抗鹽文登菌株與未經(jīng)馴化菌株的耐鹽性未見顯著性差異。

據(jù)報道，在華北地區(qū)的鹽堿地，含鹽量＜0.2%為非鹽漬化土壤；0.2%～0.3%為輕度鹽漬化土壤；0.3%～0.4%為中度鹽漬化土壤；0.4%～0.6%為重度鹽漬化土壤；含鹽量大于0.6%或1.0%為鹽土[5]。在東營市鹽堿地pH為8.09～8.35，鹽度在0.3%～3.0%[14]。因此，文登菌株具有較強的耐鹽能力，為鹽堿地栽培羊肚菌及其育種提供了菌種資源。