張瑋 李華南 駱雄飛 劉斯文 趙娜 包安 陳英英 王金貴

天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院推拿科300193

0 引 言

非酒精性脂肪性肝病[1]（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是與胰島素抵抗和遺傳易感密切相關(guān)的代謝應激性肝損傷。近年來，隨著生活水平的提高，人們的飲食結(jié)構(gòu)逐漸改變，NAFLD 的發(fā)病率不斷升高且呈低齡化趨勢[2]，已成為21 世紀全球重要的公共健康問題之一。調(diào)查報告顯示，全球的NAFLD 患病率已達25.24%[3]。在我國漢族人群中，NAFLD 的發(fā)病率達33.3%[4]，已成為僅次于病毒性肝炎的常見肝病。有研究人員對瑞士的36 例NAFLD 患者進行了27 年的跟蹤隨訪，發(fā)現(xiàn)最后有25%的患者被診斷為肝硬化，14%的患者被診斷為肝細胞癌[5]。據(jù)統(tǒng)計，中國也已成為年齡標準化發(fā)病率最高的地區(qū)之一[6]，而NAFLD 正是誘發(fā)肝癌風險的首要因素[7-8]。因此，防治NAFLD 已成為降低肝癌發(fā)病率和死亡率的重要醫(yī)學策略。目前，隨著“腸-肝軸”概念的廣泛認知，NAFLD 的研究焦點也逐步前移至腸道。剖釋NAFLD 的發(fā)病機制，其關(guān)鍵環(huán)節(jié)為腸道機械屏障的破壞[9]。因此，如何維護腸道機械屏障功能，重建“腸-肝軸”平衡，已成為未來潛在的研究熱點。

1 腸道通透性是NAFLD 發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)

腸道是人類能源物質(zhì)遞呈的主要器官，同時也參與人體各類代謝、免疫等重要功能。腸道與肝臟擁有共同的胚胎起源，故兩者在生物學功能及解剖結(jié)構(gòu)之間存在諸多聯(lián)系，并擁有共同的血液、營養(yǎng)等功能單元。因此，在Marshall[10]正式提出“腸-肝軸”概念后，腸道成為NAFLD 防治研究的熱點。

腸道屏障包括機械屏障、免疫屏障、生物屏障及化學屏障。其中對于機械屏障，即通常所稱的腸上皮屏障的功能研究最為集中。腸道機械屏障在維持人體與外環(huán)境穩(wěn)態(tài)上發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。其作為抵御外源性物質(zhì)的第一道防線，不僅要與腸道菌群共存，更要防止菌群失調(diào)易位后引起的一系列反應。而腸道黏膜通透性正是反映腸道機械屏障功能的重要指標。雖然腸道菌群已成為全球研究熱點，但NAFLD 發(fā)病機制中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)為腸道黏膜通透性的增加。無論是菌群失調(diào)還是易位，均要通過內(nèi)毒素等途徑增加腸道黏膜的通透性。在正常情況下，腸內(nèi)菌群及毒素均不能通過機械屏障進入肝臟。然而，由于人們對飲食控制的不節(jié)制，使腸道內(nèi)脂多糖不斷蓄積，引發(fā)一系列炎癥反應，逐步破壞了腸道機械屏障功能，導致腸道通透性增加。此時，脂多糖等毒素會透過被破壞的機械屏障進入門靜脈，使肝細胞脂肪變性，引發(fā)NAFLD 發(fā)生。

腸道通透性的作用最初在NAFLD 機制研究中被證實[11]。多項研究結(jié)果顯示，NAFLD 的嚴重程度與腸道通透性的高低顯著相關(guān)[12-15]。早期的一些研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在腸道形態(tài)學發(fā)生變化之前，腸道通透性即已增加[16]。

2 維持NAFLD 腸道通透性的主要因素

腸道機械屏障的解剖基礎(chǔ)源自于腸上皮細胞（intestinal epithelial cell,IEC）及相鄰細胞之間的連接構(gòu)成。兩者均為維持NAFLD 腸道通透性的主要因素。IEC 的連接裝置主要包括緊密連接和黏附連接，兩者統(tǒng)稱為頂端連接復合體（apical junctional complex，AJC）。IEC 需要AJC 組裝，而AJC 又需要錨定IEC，兩者作用不能孤立存在，故IEC 功能的正常和AJC 結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定在調(diào)控NAFLD 腸道通透性中發(fā)揮著重要作用。下文將對IEC 功能和AJC 結(jié)構(gòu)涉及的主要因素進行系統(tǒng)整理。

2.1 細胞凋亡

細胞凋亡是機體清除衰老、畸形細胞的一種主動程序化過程。在生物組織中，損傷和衰老細胞均以凋亡形式被清除，以控制機體內(nèi)細胞質(zhì)量和數(shù)量的平衡。IEC 作為腸道機械屏障組成的主體，其凋亡功能是維持腸道通透性的基礎(chǔ)。IEC 具有較強的再生和修復能力，在機體受到外界因素侵襲時，可在一定范圍內(nèi)維持凋亡穩(wěn)態(tài)，保證IEC 及時修復和更新。若超出IEC 自穩(wěn)代償期，則會誘發(fā)IEC 凋亡紊亂，IEC 功能受損，腸道通透性增加[17]。有研究人員通過遺傳方法加速IEC 凋亡，結(jié)果引起IEC 分化不全，腸道通透性增加[18]。糾正凋亡進程，不僅可降低腸道黏膜通透性[19]，甚至還可上調(diào)AJC 中緊密連接的表達[20]，從而共同修復受損的腸道通透性。上述研究結(jié)果證明，IEC 凋亡功能在維護腸道黏膜通透性中起到關(guān)鍵作用。

2.2 細胞自噬

細胞凋亡與細胞自噬是維持IEC 正常功能的兩種生命活動。雖然兩者在代謝途徑方面有著顯著區(qū)別，但均為調(diào)控腸道通透性的關(guān)鍵機制。細胞自噬是細胞用來回收利用細胞質(zhì)成分、廢棄或受損細胞器的一種自體降解途徑。當細胞受到外源性刺激時會啟動自噬，形成雙層膜囊泡結(jié)構(gòu)的自噬體，自噬體在內(nèi)吞廢棄細胞器后與溶酶體融合，將內(nèi)容物及自噬體本身分解成細胞的基本成分，從而實現(xiàn)循環(huán)利用。例如細胞營養(yǎng)匱乏時，自噬會通過循環(huán)回收利用的途徑提供能量，以維持細胞凋亡水平。

文獻報道，腸道機械屏障破壞后，自噬相關(guān)蛋白Beclin l 及微管相關(guān)蛋白1 輕鏈3B（LC3B）表達上調(diào)[21]，表明細胞自噬的活性在機械屏障損傷后增強，自噬可能參與保護腸道機械屏障，其機制可能是通過清除受損細胞器以發(fā)揮修復受損IEC 的作用。通過干預自噬的方法，可引發(fā)細胞凋亡延遲，從而導致宿主細胞被病毒持續(xù)感染，這也證明自噬為凋亡所需，兩者關(guān)系密切。自噬可通過調(diào)控IEC凋亡穩(wěn)態(tài)參與修復腸道機械屏障功能。抑制自噬發(fā)生會促進IEC 過度凋亡[22]，導致腸道黏膜通透性增加[23]。而上調(diào)自噬相關(guān)蛋白Beclin 1 的表達，可恢復正常細胞凋亡節(jié)奏，降低腸道黏膜通透性[24]。

2.3 AJC

緊密連接和黏附連接是AJC 的主要組成部分。緊密連接位于AJC 的最頂端，是AJC 最重要的連接方式，在維持腸道通透性中發(fā)揮重要作用[25-26]。脂多糖等毒素從兩個IEC 之間的縫隙通過時會受到緊密連接的限制。緊密連接由閉合蛋白Claudin、咬合蛋白Occludin 和連接黏附分子3 種膜蛋白以及閉鎖小帶蛋白[閉鎖小帶蛋白1（zonula occludens 1，ZO-1）、ZO-2 和ZO-3]等外周胞漿蛋白組成，可與相鄰細胞包裹形成一個連續(xù)的漁網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。文獻報道，緊密連接蛋白的含量與腸道通透性成反比[27-28]，證明緊密連接蛋白與腸道通透性關(guān)系密切。給予體外培養(yǎng)IEC 加載一定的機械力，可干預緊密連接ZO-1 蛋白的表達[29]，這為組裝AJC 提供了基礎(chǔ)，有利于改善腸道機械屏障功能。然而緊密連接的結(jié)構(gòu)穩(wěn)態(tài)需要通過錨定細胞骨架蛋白來實現(xiàn)。ZO-1 蛋白與緊密連接的功能變化密切相關(guān)[30]，常被作為緊密連接通透性的指標[31]。ZO-1 蛋白可與細胞骨架蛋白進行廣泛連接，并通過錨定細胞骨架蛋白來組裝和穩(wěn)固AJC，故其在AJC 的組裝和功能變化中起著重要作用。

黏附連接位于緊密連接下方，決定著IEC 的黏附能力。其對于保持IEC 的完整性和細胞間的協(xié)調(diào)起著至關(guān)重要的作用[32-33]。黏附連接包括E-鈣黏蛋白、γ-連環(huán)蛋白、α-連環(huán)蛋白和p120 連環(huán)蛋白。其中E-鈣黏蛋白在維持黏附連接結(jié)構(gòu)穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著重要作用。納米力學測量結(jié)果顯示，E-鈣黏蛋白可識別細胞骨架蛋白纖維形肌動蛋白（fibrous actin，F(xiàn)-actin）之間的縫隙，從而錨定細胞骨架蛋白[34]，利于AJC 的穩(wěn)固。此外，E-鈣黏蛋白的聚合和解離平衡對于維持細胞的正常形態(tài)和結(jié)構(gòu)亦十分重要。E-鈣黏蛋白表達下調(diào)會加重缺氧誘導的IEC 凋亡，而E-鈣黏蛋白表達上調(diào)對IEC 具有保護作用[35]。人工干預打破E-鈣黏蛋白的聚合和解離平衡后，E-鈣黏蛋白的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，黏附連接解離[36]，細胞間的黏附力下降，不僅可引起細胞脫落和凋亡，還可干擾緊密連接上皮屏障功能[37]。

2.4 細胞骨架

細胞骨架是真核細胞中重要的組成部分和功能組件。其為位于細胞膜內(nèi)側(cè)的蛋白質(zhì)纖維網(wǎng)架系統(tǒng)，主要由微絲、微管、中間絲組成。但其并非真正的“骨”，而是一個高度動態(tài)的結(jié)構(gòu)，在細胞膜下方組裝成機械支撐裝置，并根據(jù)外界機械力改變而調(diào)控細胞骨架的空間分布和動力學行為，將外界刺激信號轉(zhuǎn)化為細胞骨架的動力學行為。細胞骨架不僅可直接連接于IEC 上，對細胞間的AJC 也起到組裝和支撐作用[38]。

IEC 之間的排列組合形成了溝通腸道內(nèi)外的最大和最重要的屏障。IEC 之間的縫隙雖需緊密連接和黏附連接進行密封而保持腸道屏障功能[39]，但在緊密連接和黏附連接密封的同時，還需錨定細胞骨架蛋白，借助細胞骨架的力學結(jié)構(gòu)組裝AJC，以使其結(jié)構(gòu)和功能達到穩(wěn)定。微絲骨架可通過靶點錨定緊密連接和黏附連接蛋白，從而維持AJC 的穩(wěn)態(tài)和組裝。一些早期的研究結(jié)果證實，微絲骨架蛋白破壞素可誘導AJC 快速解體，表明微絲骨架在AJC 組裝中具有重要作用。其中緊密連接的ZO-1 蛋白和黏附連接的E-鈣黏蛋白與微絲骨架蛋白肌動蛋白相連，承擔著細胞信號溝通的重要作用，也已成為細胞骨架相關(guān)研究的熱點。藥理學研究結(jié)果顯示，肌動蛋白解聚試劑（如細胞松弛素）可使鼠回腸黏膜上皮的通透性增加[31]，而撤去藥物干預后，微絲骨架又可逆轉(zhuǎn)，證明可通過外界干預對細胞骨架進行重塑和改造。此外，一定的力學刺激也可改善F-actin的解聚狀態(tài)，使細胞內(nèi)游離的球形肌動蛋白（Gactin）彼此結(jié)合形成F-actin，進而通過自身螺旋形成微絲，此過程即為細胞骨架的重塑[40]。另有研究結(jié)果證實，給予體外培養(yǎng)細胞一定的機械外力可誘導細胞微絲骨架蛋白重塑，且機械力是骨架蛋白重塑所必需的[41]。機械力可調(diào)控細胞骨架重塑，使其與緊密連接相互錨定成復合結(jié)構(gòu)。因此，腸道通透性的高低與細胞骨架組裝AJC 的穩(wěn)態(tài)關(guān)系密切。而ZO-1蛋白和E-鈣黏蛋白均可直接錨定于細胞骨架上，故細胞骨架已成為NAFLD 的潛在研究熱點。

由于AJC 需與結(jié)構(gòu)功能正常的IEC 配合才能共同發(fā)揮調(diào)控腸道黏膜通透性的作用，因此IEC 結(jié)構(gòu)穩(wěn)態(tài)也是調(diào)控通透性的關(guān)鍵因素之一。細胞是生命體活動的結(jié)構(gòu)和功能的基本單位，時刻都在感受來自內(nèi)外環(huán)境的各種信息的刺激，并根據(jù)信息作出相應的功能調(diào)整。而在整個信號傳導鏈條中，貫穿整個細胞的細胞骨架是調(diào)控力學信號傳導的樞紐[42]，使力學刺激從細胞表面向內(nèi)傳播，為力學信息-化學信息傳導提供了物理基礎(chǔ)。

新近的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，細胞骨架在凋亡過程中的改變非?；钴S，其在細胞內(nèi)的狀態(tài)直接影響凋亡信號的終點。細胞骨架是真核細胞中復雜的纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)體系，在細胞內(nèi)物質(zhì)運輸、細胞運動、信息傳遞等活動中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[43]。在正常細胞凋亡過程中，細胞骨架會重新排列，形成一個橢圓形的凋亡微管網(wǎng)絡以保證細胞的形態(tài)。因此，正常、可控的細胞凋亡最終形態(tài)為橢圓形。當細胞骨架破壞后，會引起骨架無序重組，排列畸形，細胞空間結(jié)構(gòu)也隨之重構(gòu)，嚴重影響了細胞的功能活動，導致細胞凋亡穩(wěn)態(tài)的失衡。已有研究人員采用破壞細胞骨架的方式誘導小鼠卵母細胞凋亡，以降低細胞早期胚胎的發(fā)育能力[44]。特別是在腫瘤領(lǐng)域，細胞骨架已成為新藥開發(fā)的新靶點。細胞自噬是細胞自我保護的機制，其正常運轉(zhuǎn)需要細胞骨架的支持。其中微管與微絲參與自噬活動的全部進程[45]，可為自噬活動提供定向運動軌道，并指引自噬體的運輸。NAFLD腸道內(nèi)蓄積的脂多糖會誘發(fā)炎癥破壞細胞骨架，致使骨架無序重組，排列畸形，細胞空間結(jié)構(gòu)也隨之重構(gòu)，同時致使細胞內(nèi)自噬體蓄積，且分布混亂，嚴重影響了細胞的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，導致細胞過度凋亡[46]。有研究結(jié)果顯示，誘導大鼠IEC 炎癥反應，早期時細胞反應明顯，自噬活性較高，但隨著病程進展自噬反而被抑制[47]。其原因即為長期的炎癥刺激導致細胞骨架拆分塌陷，無法支持自噬的正常啟動和轉(zhuǎn)運。微絲蛋白可為自噬體的轉(zhuǎn)運提供一個通暢的纖維網(wǎng)絡[44]。該網(wǎng)絡可在結(jié)構(gòu)上支撐自噬泡的擴張[48]，并于自噬體成熟后在尾部聚合并快速循環(huán)組裝與分解，形成一個“彗星拖尾”，以推動自噬體從網(wǎng)膜體分離，并負責其早期的移動與轉(zhuǎn)運[49]。采用解聚劑和基因敲除方法拆解微絲蛋白，不僅可抑制自噬體的產(chǎn)生[45]，還可導致細胞凋亡增加。微管也是細胞骨架的主要組成之一，具有支持物質(zhì)運輸、細胞器定位的作用。因此，細胞骨架結(jié)構(gòu)對于IEC 的正常凋亡和自噬功能具有重要意義。

2.5 主要信號通路

關(guān)于信號在IEC 內(nèi)的傳遞途徑，目前國內(nèi)外學者主要認為有Rho 家族、蛋白激酶C、整合素、絲裂霉素激活的蛋白激酶、Ca2+通道等途徑。其中Ca2+通道與細胞骨架結(jié)構(gòu)聯(lián)系緊密。有研究人員認為，細胞的壞死和凋亡主要由4 種細胞毒性機制調(diào)節(jié)。細胞骨架為破壞機制之一，而細胞內(nèi)固有游離Ca2+濃度的持續(xù)增加便是主要結(jié)局。因此，許多研究人員利用Ca2+通道選擇性地使微絲和微管穩(wěn)定或去穩(wěn)定，以調(diào)控腸道黏膜的通透性?，F(xiàn)階段對于調(diào)控腸道黏膜通透性的信號通路研究更多聚焦于Rho 家族與肌球蛋白輕鏈激酶（myosin light chain kinase，MLCK）兩個信號通路。Rho 家族下游的效應分子Rho 激酶（Rho-associated kinase，ROCK）在調(diào)控AJC拆解中發(fā)揮作用，但其多定位于細胞中央，而MLCK多定位于細胞外圍，這種定位差異意味著細胞骨架蛋白在細胞中央遠比細胞外圍穩(wěn)固，且細胞外圍對外界刺激更為敏感。因此，MLCK 信號通路被認為是參與調(diào)控腸道黏膜上皮屏障最重要的信號通路之一[50]。

肌球蛋白輕鏈（myosin light chain，MLC）磷酸化是腸道通透性改變的分子基礎(chǔ)，其可通過調(diào)控微絲骨架結(jié)構(gòu)影響腸道通透性。MLCK 信號通路則可通過干預MLC 磷酸化水平，進而調(diào)控骨架蛋白來影響腸道通透性。諸多研究結(jié)果證實，脂多糖等毒素的蓄積可誘導MLCK 基因轉(zhuǎn)錄活性增加，MLC 磷酸化水平升高，引起細胞微絲骨架結(jié)構(gòu)改變和AJC 解體，從而導致細胞間隙增大，通透性增加[51-52]。上述研究結(jié)果也證實，MLCK 蛋白表達上調(diào)是腸道通透性增加的重要原因。因此，特異性抑制MLCK 信號通路是調(diào)控腸道通透性的關(guān)鍵。

半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（cysteine aspartic acid specific protease，Caspase）級聯(lián)反應的激活是細胞發(fā)生凋亡的標志性事件。特別是半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）作為凋亡下游的終末剪切酶，在細胞凋亡執(zhí)行過程中起到至關(guān)重要的作用。當Caspase-3 非正常活化后，可介導ROCK1 活化及MLC 磷酸化，從而激活Caspase-3/ROCK1/MLC 信號通路的層級級聯(lián)，引起細胞凋亡[53]。同時，Caspase-3的活化還可切割ULK1 激酶。ULK1 激酶是自噬啟動的關(guān)鍵分子機制，其可通過磷酸化Beclin-1，激活脂酶VPS34，從而誘導自噬啟動。因此，Caspase-3 活化不僅是凋亡的級聯(lián)反應，更是深藏于細胞骨架、自噬和凋亡中的樞紐元件，是調(diào)控腸道黏膜通透性的關(guān)鍵。

MLC 磷酸化是Caspase-3/ROCK1/MLC 信號通路誘導細胞凋亡的終末效應，也是細胞骨架拆解的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。文獻報道，在凋亡過程中通過拮抗細胞骨架拆解的方式，可抑制MLC 磷酸化，而這種抑制可反向調(diào)節(jié)Caspase-3 的活性，從而阻斷Caspase-3/ROCK1/MLC 信號通路的激活，實現(xiàn)細胞凋亡的逆轉(zhuǎn)[43]。這與筆者所在課題組的前期研究結(jié)果一致：揉腹法可通過特異性抑制MLC 磷酸化的途徑重塑細胞骨架。上述研究結(jié)果高度證實了重塑細胞骨架借助阻滯Caspase-3/ROCK1/MLC 信號通路逆轉(zhuǎn)細胞凋亡的可能性。然而，單純阻滯細胞凋亡仍不足以使細胞恢復正常代謝狀態(tài)。如何清除凋亡啟動后的廢棄受損細胞器和錯誤折疊蛋白，以促使細胞步入正常的凋亡進程，尚需進一步深入研究。

3 結(jié)語與展望

NAFLD 是僅次于病毒性肝炎的常見肝病，目前尚無確切有效的治療藥物，若不及時干預，會引發(fā)一系列全身系統(tǒng)疾病，嚴重影響患者的生活質(zhì)量和生命安全。越來越多的研究結(jié)果證實，NAFLD 的嚴重程度與心血管疾病、腎臟疾病的嚴重程度密切相關(guān)，其已成為腎功能衰竭、高血壓病、大腸癌的一個獨立危險因素[54-56]。然而據(jù)調(diào)查，在美國僅有18%的NAFLD 患者意識到NAFLD 的潛在危險[57]。在當今醫(yī)療衛(wèi)生工作發(fā)展的趨勢已向預防前移的同時，及時治療并預防NAFLD 的進一步發(fā)展已受到國內(nèi)外廣大學者的高度重視。其中以改善腸道通透性為干預靶點的治療方法可逆轉(zhuǎn)腸道黏膜屏障損傷，預防NAFLD 的進一步發(fā)展[58-59]。因此，如何正確認知細胞骨架、AJC、凋亡、自噬之間的關(guān)系，平衡各環(huán)節(jié)的有效銜接以調(diào)控腸道黏膜通透性將成為未來研究NAFLD 的主流方向。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突