郭景玥 徐蘭舉 張琳 王淑芳

南開大學生命科學學院，生物活性材料教育部重點實驗室，天津300071

0 引 言

人的神經(jīng)系統(tǒng)一般分為中樞神經(jīng)系統(tǒng)（腦和脊髓）和周圍神經(jīng)系統(tǒng)（腦神經(jīng)和脊神經(jīng)）兩部分。目前，只有神經(jīng)導管材料在周圍神經(jīng)修復方面取得了一定的成功，而用于解決更復雜神經(jīng)系統(tǒng)問題的商業(yè)化產(chǎn)品極少。例如，對由中樞神經(jīng)系統(tǒng)紊亂導致的神經(jīng)退行性疾病、脫髓鞘疾病和缺血性損傷等疾病，目前還沒有有效的治療或修復手段。當前，上述疾病的治療手段主要有神經(jīng)保護療法和神經(jīng)再生療法[1]。神經(jīng)保護療法主要是減輕疾病的發(fā)病癥狀，旨在防止進一步的組織損傷和疾病復發(fā)。神經(jīng)再生療法是試圖替換損傷的神經(jīng)組織或促進現(xiàn)有組織在神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)再生，但這類方法多數(shù)尚處于實驗階段，許多問題亟待解決。這些問題包括：血腦屏障的存在使許多藥物無法進入神經(jīng)系統(tǒng)[2]；成人的神經(jīng)元再生能力較差，且微環(huán)境中存在大量抑制因子，如髓磷脂相關(guān)糖蛋白和硫酸軟骨素蛋白多糖（chondroitin sulfate proteoglycans，CSPGs）等[3]。

神經(jīng)組織工程是利用基質(zhì)、細胞和生長因子來促進神經(jīng)元分化和再生的方法。水凝膠作為有利于細胞生長的聚合物材料，能提供與細胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)相似的組織發(fā)育所需的平臺。通過對水凝膠系統(tǒng)進行不同的修飾和改進，可應對神經(jīng)修復中遇到的各種挑戰(zhàn)。本文中，對水凝膠在神經(jīng)再生中的作用進行了綜述，對水凝膠在神經(jīng)組織工程中的重要地位進行了分析。

1 水凝膠系統(tǒng)的物理性質(zhì)及其對神經(jīng)再生的引導作用

神經(jīng)元由細胞體和神經(jīng)突起（軸突和樹突）組成，可長距離傳導動作電位。細胞突起中，軸突通過其表面的微結(jié)構(gòu)來探索周圍環(huán)境，從而引發(fā)諸如神經(jīng)伸展或神經(jīng)收縮等適應性反應[4]。盡管神經(jīng)元對神經(jīng)組織的功能至關(guān)重要，但在體內(nèi)還有神經(jīng)膠質(zhì)細胞作為其輔助，起到支持作用。但是，同時將神經(jīng)膠質(zhì)細胞和神經(jīng)祖細胞包封在水凝膠中并不容易，通常是通過模仿體內(nèi)環(huán)境來設(shè)計基質(zhì)支架，讓神經(jīng)突起能沿支架表面移行，并根據(jù)基質(zhì)表面形貌改變移行方向[5-6]。在由軸突損傷造成的脊髓損傷和肌萎縮性側(cè)索硬化等疾病中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)水凝膠具有促進軸突修復、生長和功能恢復的作用[7-8]，其中的一部分就是通過使軸突感知基質(zhì)表面微形貌而實現(xiàn)的[9]。總結(jié)已有的相關(guān)研究，可知水凝膠主要是從影響神經(jīng)細胞膜感受到的機械壓力、基質(zhì)上神經(jīng)元細胞骨架的動態(tài)和神經(jīng)元的力學感受能力3個方面，調(diào)節(jié)軸突的生長和發(fā)育。

1.1 細胞膜感受到的機械壓力

周圍環(huán)境與神經(jīng)元的相互作用對神經(jīng)元的形態(tài)和功能具有影響。神經(jīng)元在其膜與水凝膠的交界面感受到的機械壓力，在很大程度上決定了軸突的生長狀態(tài)和方向。基質(zhì)的機械性能在神經(jīng)膠質(zhì)細胞和神經(jīng)細胞的表型調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵作用。例如，施旺（Schwann）細胞適合在彈性模量為2～5 kPa的基質(zhì)上生長[10]，此時其可極化成神經(jīng)突起；神經(jīng)突起適合在彈性模量為0.05～0.275 kPa的基質(zhì)上生長，此時其向外生長能力會得到增強[11-14]。研究者在由海藻酸鹽和鈣離子制備的3D水凝膠基質(zhì)上也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果，即神經(jīng)干細胞在具有相對較低硬度（彈性模量約180 Pa）的海藻酸鹽3D水凝膠基質(zhì)上培養(yǎng)時，神經(jīng)元特異蛋白（β-Ⅲ微管蛋白）的表達增加[15]。上述研究結(jié)果表明，神經(jīng)干細胞的分化和水凝膠基質(zhì)的機械強度之間存在相關(guān)性。類似地，在具有不同彈性模量的經(jīng)甲基丙烯酸酯改性的透明質(zhì)酸制備的3D水凝膠基質(zhì)上，研究者培養(yǎng)了由人誘導多能干細胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）分化成的神經(jīng)祖細胞，結(jié)果表明在低彈性模量組中，神經(jīng)祖細胞向神經(jīng)元分化的效率更高[16]。

此外，軸突傾向于沿著基質(zhì)表面具有的取向結(jié)構(gòu)進行生長。研究者在由聚甲基丙烯酸甲酯制成的水凝膠上培養(yǎng)成熟的神經(jīng)元軸突，發(fā)現(xiàn)軸突更喜歡沿著基質(zhì)表面的納米級脊邊緣黏附和伸長[17]，但是這種趨向性生長的具體機制和原因尚不明確。

1.2 基質(zhì)上神經(jīng)元的細胞骨架動態(tài)

神經(jīng)細胞中的細胞骨架蛋白主要包括中間纖維蛋白、微管蛋白及纖維狀肌動蛋白3種。肌動蛋白存在于神經(jīng)突起的膜下，具有為膜提供穩(wěn)定性和為短距離傳輸提供支持平臺的作用。神經(jīng)突起的外向性生長依賴于兩個既相互獨立又相互作用的細胞骨架系統(tǒng)——肌動蛋白和微管[18]。與肌動蛋白不同，微管是軸突內(nèi)存在的空心管狀結(jié)構(gòu)，其彎曲剛度遠高于肌動蛋白纖維，能抵抗壓縮力。肌動蛋白和微管的交聯(lián)程度可決定軸突的硬度和機械強度[19-20]。最近的一項研究結(jié)果表明，當胚胎和成人來源神經(jīng)元祖細胞在具有不同力學特性的水凝膠上黏附并發(fā)生分化時，當水凝膠的彈性模量為2 kPa時，β1-整合素的表達有顯著增加，說明此時對神經(jīng)突起的生長更有利[21]。

Elkin等[22]發(fā)現(xiàn)，當神經(jīng)元細胞培養(yǎng)在力學特性與腦組織相當（約0.17 kPa±0.03 kPa）的水凝膠表面時，其生長情況更好，有利于形成較大的周向網(wǎng)絡，而當在更軟的基質(zhì)上培養(yǎng)時，F(xiàn)-肌動蛋白纖維的平均長度明顯縮短[23]。由此推測，水凝膠的力學特性差異可能通過影響F-肌動蛋白等細胞骨架的排列方式，進而影響神經(jīng)突起的生長。水凝膠基質(zhì)與肌動蛋白的相互作用機制尚未明確，其中最有可能的機制是水凝膠基質(zhì)的力學特性通過影響肌動蛋白的動態(tài)，進而調(diào)節(jié)神經(jīng)細胞內(nèi)募集信號蛋白，如黏著斑激酶、A-肌動蛋白[19]，而這兩種信號蛋白最終會影響神經(jīng)突起和水凝膠基質(zhì)的黏附。通過直接調(diào)節(jié)F-肌動蛋白的調(diào)節(jié)蛋白，如YES相關(guān)蛋白（yes associated protein，YAP）和具有PZD結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄共激活劑（tafazzin，TAZ），可影響 F-肌動蛋白聚合能力和神經(jīng)細胞中應激纖維的形成，這種方法已經(jīng)成功應用于基于水凝膠的神經(jīng)細胞培養(yǎng)研究中[24]。

1.3 神經(jīng)元的力學感知能力

神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元膜上有離子通道參與遞質(zhì)釋放、激素分泌、信號轉(zhuǎn)導、代謝調(diào)控和細胞生長等重要生理過程的調(diào)控。此外，神經(jīng)元所處環(huán)境中，物理參數(shù)的改變（如表面形貌，硬度/強度，親水性和表面電荷等）可能會通過影響其離子通道的狀態(tài)，從而引起細胞動態(tài)變化和響應。神經(jīng)元擁有能被機械力激活的離子通道，所以可將感受到的力轉(zhuǎn)化成生物化學信號。有研究結(jié)果表明，對聚丙烯酰胺水凝膠中培養(yǎng)的神經(jīng)細胞施加機械應力會產(chǎn)生生長錐分解、神經(jīng)突起收縮和細胞骨架改變等反應，這些情況主要是由于機械拉伸使離子通道激活，從而導致神經(jīng)細胞和生長錐細胞內(nèi)鈣離子水平發(fā)生急劇變化[4]。但是，對于更大尺度的水凝膠基質(zhì)，有關(guān)神經(jīng)元的機械敏感性離子通道作用的相關(guān)研究較少，需要進一步研究。

2 水凝膠系統(tǒng)的生物分子控制釋放對神經(jīng)再生的促進作用

水凝膠不僅可為神經(jīng)元再生提供機械支持和物理引導，還可將外源生物分子加入水凝膠基質(zhì)中。水凝膠系統(tǒng)中，這些生物分子控制釋放，可為神經(jīng)再生提供更適宜的環(huán)境。一般來說，水凝膠是通過自降解來釋放生物分子的，主要途徑有2種，分別是聚合物網(wǎng)絡的分解和聚合物內(nèi)部鍵的斷裂[25]。其中，如何通過調(diào)節(jié)聚合物含量、分子量、交聯(lián)程度等因素，控制水凝膠的自降解速率是神經(jīng)組織工程的研究重點之一。

2.1 釋放神經(jīng)元營養(yǎng)因子

神經(jīng)營養(yǎng)因子是一類在神經(jīng)組織工程中備受關(guān)注的生物分子，其能促進神經(jīng)細胞存活、生長和分化。常見的神經(jīng)營養(yǎng)因子有神經(jīng)生長因子（nerve growth factor，NGF）、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brainderived neurotrophic factor，BDNF）、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白 3（neurotrophin 3，NT3）、NT4、膠質(zhì)細胞系衍生的神經(jīng)營養(yǎng)因子（glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF）和睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子（ciliary neurotrophic factor，CNTF）。這些蛋白均可通過結(jié)合反應性神經(jīng)細胞表面受體，促進神經(jīng)元發(fā)育和成熟，加強成熟神經(jīng)細胞的存活能力，增加神經(jīng)細胞的再生作用。例如，BDNF及其受體在神經(jīng)系統(tǒng)廣泛表達，可通過高親和力受體酪氨酸蛋白激酶B（t yrosine kinase receptor B，Trk B）發(fā)揮作用。王瑩等[26]在研究中發(fā)現(xiàn)，二氫睪酮可有效激活BDNF及受體Trk B的表達，減少抑制神經(jīng)軸突再生的有害因素，從而使神經(jīng)突起的環(huán)境得到改善，促進神經(jīng)功能的恢復。Edalat等[27]選用 pDsRed1-N1-NT-3和 pCMX-Trk C質(zhì)粒轉(zhuǎn)染間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs），發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后的MSCs能長時間高表達NT3和Trk C受體，使干細胞的存活率和向神經(jīng)細胞分化的能力得到提高，并減少了細胞凋亡，表明Trk C受體可提高NT3的利用率并促進其修復脊髓損傷。

有研究者在中風小鼠模型中，用透明質(zhì)酸水凝膠遞送BDNF，發(fā)現(xiàn)因子經(jīng)過3周時間可從中風處擴散到梗死的周圍組織，能誘導成熟的神經(jīng)元遷移到梗死周圍皮層中，并長期存活，還能促進現(xiàn)有的皮質(zhì)和皮質(zhì)紋狀體系統(tǒng)內(nèi)的突觸發(fā)芽，加快運動功能的恢復[28]。然而，通過釋放營養(yǎng)因子促進神經(jīng)再生也存在一些問題，如再生神經(jīng)細胞在特定的生長階段需要特定的因子濃度，因此水凝膠系統(tǒng)也需要配合這種需要。針對該問題，有研究者對常用的聚乳酸（polylatic acid，PLA）-聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）水凝膠進行了一系列的化學修飾，使其可在最初突釋后，緩慢持續(xù)釋放NT3，以實現(xiàn)對神經(jīng)生長的積極作用[29]。此外，這種裝載了NT3的水凝膠在脊髓損傷的動物模型上也得到了成功應用，相關(guān)研究中觀察到了軸突再生的改善[30]。

不僅水凝膠的物理和化學特性會對生物分子釋放的持續(xù)時間和遞送劑量有重要影響，某些營養(yǎng)因子也會與水凝膠產(chǎn)生相互作用，而使其生物分子釋放曲線受到影響[31]。此外，在水凝膠基質(zhì)中摻入包有營養(yǎng)因子的微米或納米顆粒，可實現(xiàn)多種生物分子的順序控制釋放，從而達到最佳治療效果[32]。

2.2 釋放神經(jīng)生長抑制劑的拮抗劑

神經(jīng)組織修復過程中的一項重大挑戰(zhàn)是損傷組織周圍存在各種抑制性分子，導致這一區(qū)域處于抑制環(huán)境中，而影響修復效果。由星形膠質(zhì)細胞和結(jié)締組織組成的神經(jīng)膠質(zhì)瘢痕是軸突再生的主要障礙之一。瘢痕內(nèi)的活化神經(jīng)膠質(zhì)細胞會產(chǎn)生抑制分子，如勿動蛋白（nogoprotein，Nogo）、CSPGs[33]、少突膠質(zhì)細胞髓鞘糖蛋白（oligodendrocyte myelin glycoprotein，OMgp）[34]、髓鞘相關(guān)糖蛋白（myelinassociatedglycoprotein，MAG）[35]等，這些蛋白極大地阻礙了神經(jīng)再生過程。Nogo、OMgp和MAG都通過其共同的受體Nogo-66（NgR）結(jié)合轉(zhuǎn)導抑制活性，但將NgR基因敲除僅有輕度作用，表明這些分子還有其他的受體存在。隨著科技的不斷發(fā)展，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)存在一種成對的免疫球蛋白樣的受體B（p aired immunoglobulin-like receptor B，Pir B），是Nogo、MAG、OMgp的高親和力受體。因此，當同時阻斷NgR和PirB的活性時，研究者發(fā)現(xiàn)髓鞘相關(guān)的抑制作用幾乎被完全消除[36]。硫酸軟骨素酶ABC（chondritinase ABC，Ch ABC）是由普通變形桿菌產(chǎn)生的一種酶類，可催化分解黏多糖類。有研究結(jié)果表明，Ch ABC不僅可通過降低損傷脊髓局部的CAPGs促進損傷的軸突修復和再生，還能加速脊髓損傷后功能障礙的恢復[37]。

2.3 釋放藥物分子

甲強龍（methylprednisolone，MP）是一種抗炎糖皮質(zhì)激素，具有抗氧化作用，其已在脊髓損傷的臨床治療中得到了應用，但損傷修復所需的MP巨大用量會導致嚴重的副反應，在臨床應用中一直有爭議[38-39]。因此，如何對藥物進行高效靶向傳輸，延長藥物循環(huán)的半衰期是相關(guān)治療技術(shù)發(fā)展的重點。越來越多的研究結(jié)果表明，納米載體具有靶向給藥和增加藥物的生物利用度的潛力[40]。不僅如此，已發(fā)現(xiàn)由納米尺度的多巴胺聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidone，PVP）-聚 丙 烯 酸（polyacrylic acid，PAAc）制成的凝膠可穿過血腦屏障，在腦實質(zhì)內(nèi)釋放神經(jīng)遞質(zhì)[41]。

可注射水凝膠已被廣泛應用于各種神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的治療性分子遞送，尤其是用于治療神經(jīng)系統(tǒng)中出現(xiàn)的腫瘤。水凝膠系統(tǒng)在神經(jīng)膠質(zhì)瘤治療的相關(guān)中已得到廣泛應用，有研究者通過一種高通量的定量測量3D技術(shù)，研究神經(jīng)膠質(zhì)瘤的增殖和入侵的方法，將硫醇化透明質(zhì)酸和明膠組成的光學透明水凝膠與硫醇反應性聚(乙二醇)聚合物進行化學交聯(lián)，以形成人造3D腫瘤微環(huán)境[42]。該3D腫瘤微環(huán)境對尋找、篩選抗癌藥物的體外實驗和用于安全性評估等體內(nèi)實驗有重要作用，尤其能彌補藥物實驗在動物模型上的效果差距，因為動物模型既昂貴又費時，且不能完全反映人類腫瘤的生物學特征。

2.4 水凝膠中的細胞成分

作為組織工程三要素之一，種子細胞在神經(jīng)組織工程中已經(jīng)得到了應用。但直接局部注射種子細胞雖能提高再生和修復效果[43]，但存在種子細胞大量流失，利用效率低等問題。而使用水凝膠系統(tǒng)可模仿細胞基質(zhì)環(huán)境，利于細胞保持活性和增殖，提高細胞利用率。有研究者將負載有iPSCs誘導產(chǎn)生的神經(jīng)干細胞的3DGelMA水凝膠植入脊髓損傷部位，發(fā)現(xiàn)其可減少炎癥，促進軸突和神經(jīng)元再生，并抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘢痕增生[44]。另外，有研究者通過疊氮苯基光化學反應將甲基丙烯酸化肝素接枝到聚甲基丙烯酸-2-羥乙酯制成的水凝膠中，通過肝素負載成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）和神經(jīng)干細胞，結(jié)果表明這種基質(zhì)支架可使干細胞的黏附和分化能力增強，有利于小鼠脊髓損傷模型的神經(jīng)元再生[45]。上述研究結(jié)果表明，聯(lián)合使用負載細胞和藥物分子可起到協(xié)同作用。

除了在水凝膠中摻入簡單的肽外，也有研究者嘗試使用某些自組裝肽（self-assemblypeptide，SAP）形成水凝膠。SAP是一種小肽，可自我組裝后形成納米纖維基質(zhì)，可摻入生物活性序列并適于外部刺激觸發(fā)的響應，如pH值、離子梯度、疏水性、溫度[46]。分子與分子間或分子內(nèi)部之間存在非共價鍵相互協(xié)同作用力，使分子能在空間上實現(xiàn)重排和堆積，利用這種作用力就能通過分子自組裝，產(chǎn)生具有所需特性的凝膠。例如，將神經(jīng)干細胞植入RADA16-YIGSR自組裝短肽，可自發(fā)性地組裝成的納米纖維。與單獨使用神經(jīng)干細胞相比，SAP水凝膠中的神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元的分化能力更強，并可減少由β淀粉樣蛋白誘導的凋亡細胞數(shù)，具有治療阿爾茨海默癥的發(fā)展前景[47]。上述研究結(jié)果已經(jīng)顯示出SAP水凝膠系統(tǒng)對神經(jīng)再生的積極作用，但SAP水凝膠在大腦內(nèi)發(fā)揮作用后，是否會影響大腦反應功能或產(chǎn)生行為變化等影響尚不明確。

3 電傳導水凝膠在神經(jīng)再生中的作用

從常規(guī)的肌肉運動到復雜的腦部能力（如記憶和推理），都是依靠中樞神經(jīng)和周圍神經(jīng)通過復雜的神經(jīng)元細胞網(wǎng)絡不斷產(chǎn)生并接受電和生化信號來完成的。越來越多的研究結(jié)果表明，對受損的神經(jīng)組織施加電刺激，對神經(jīng)再生和修復過程有影響。由單寧酸、吡咯和Fe3+混合形成的具有多孔結(jié)構(gòu)的導電水凝膠可抑制星形膠質(zhì)細胞發(fā)育，并加速神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元的分化，將其植入體內(nèi)后，發(fā)現(xiàn)其導電性能可刺激新的神經(jīng)產(chǎn)生和功能性神經(jīng)網(wǎng)絡的形成，利于受損脊髓的修復[48]。雖然關(guān)于電刺激促進神經(jīng)元再生的具體機制尚不明確，但已有研究開始對電壓依賴性鈣通道的作用[49]、細胞外基質(zhì)成分局部電場變化的作用[50]和神經(jīng)營養(yǎng)因子的釋放依賴電刺激調(diào)節(jié)的作用[51]進行研究。

在水凝膠的相關(guān)應用中，還有另一個重要領(lǐng)域是研究神經(jīng)調(diào)節(jié)裝置，其已被用于制造可植入大腦或脊髓的電極和電路。在神經(jīng)電極上覆蓋由海藻酸鹽與聚吡咯或聚（3,4-乙撐二氧噻吩）制成的水凝膠，可降低電阻，從而得到更好的神經(jīng)檢測結(jié)果[52-53]。另外，由聚（3,4-乙撐二氧噻吩）-聚苯乙烯磺酸鹽制成的導電水凝膠也已被用于開發(fā)“可伸展電極”，這種電極的電荷存儲能力更高，可用于長時間的神經(jīng)刺激[54]。

4 結(jié)語

神經(jīng)組織工程是組織工程中的一個新興領(lǐng)域，目的是制造出能促進神經(jīng)組織生長的模擬體內(nèi)環(huán)境的人工材料。盡管已開發(fā)出了一些較為理想的水凝膠系統(tǒng)，可促進神經(jīng)元的修復和再生，但其距離臨床轉(zhuǎn)化還相差很遠。對神經(jīng)再生生物學基本原理的研究，有利于基質(zhì)支架的結(jié)構(gòu)設(shè)計，從而開發(fā)出與生理環(huán)境更相似的系統(tǒng)。從轉(zhuǎn)化的角度看，多從患者體內(nèi)再生環(huán)境出發(fā)考慮修復策略，可能會增加神經(jīng)組織工程成功的可能；根據(jù)神經(jīng)系統(tǒng)的復雜特性，綜合考慮基質(zhì)硬度、導電性、藥物釋放等情況并選擇最適條件施用，成功概率會更大。從更遠的角度看，隨著科技不斷進步，對一些如記憶、性格和行為等在腦部核心區(qū)域的高級功能的研究將受到關(guān)注。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突