劉麟文 周雅春 姚俊巖

（上海交通大學醫(yī)學院附屬第一人民醫(yī)院麻醉科，上海 200080）

中樞神經(jīng)系統(tǒng)的缺血再灌注損傷，包括缺血性腦梗塞和脊髓缺血再灌注損傷，其后果嚴重，不僅導(dǎo)致不同程度的神經(jīng)功能缺失如偏癱、截癱，甚至引起死亡[1-4]。近年的流行病學研究結(jié)果表明，全球缺血性腦血管疾病的發(fā)病率和病死率逐年上升，且呈現(xiàn)出年輕化發(fā)展的趨勢[5，6]，如何減輕神經(jīng)缺血再灌注損傷日益受到重視。眾多學者力求采取低溫、缺血預(yù)處理后處理等措施保護缺血的神經(jīng)系統(tǒng)，但效果有限[7-10]。藥物保護措施因具備可行性高、創(chuàng)傷小等優(yōu)點，具有更廣闊的臨床應(yīng)用前景，但目前尚缺乏公認有效的神經(jīng)保護藥物。[D-Ala2，D-Leu5]enkephalin（DADLE）是一種人工合成的 δ 阿片受體（δ opioid receptor，DOR）激動劑，DADLE 可誘發(fā)冬眠，保護外周器官，促進細胞生存，這種保護作用在心、肝和腎等器官均有所體現(xiàn)[11-12]。但δ 阿片受體激動劑能否減輕神經(jīng)系統(tǒng)缺血再灌注損傷，目前研究尚少。且臨床上應(yīng)用大劑量阿片受體激動劑將帶來呼吸抑制等嚴重副作用，因此如何更好地利用其保護作用，減少或避免副作用值得深入探討。人神經(jīng)母細胞瘤細胞SH-SY5Y細胞是神經(jīng)保護領(lǐng)域普遍采用的工具細胞，本研究采用體外培養(yǎng)的SH-SY5Y細胞進行不同時間的缺氧，復(fù)制神經(jīng)細胞不同程度的缺氧復(fù)氧損傷，繼而在缺氧過程中給予不同濃度的DADLE，探討其對神經(jīng)細胞有無保護作用，且該作用是否具有劑量效應(yīng)關(guān)系，確定其最佳保護劑量。

1 材料和方法

1.1 試劑

人神經(jīng)母細胞瘤細胞SH-SY5Y細胞來源于中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心；高糖DMEM 培養(yǎng)基、無糖DMEM 培養(yǎng)基、噻唑藍MTT（3-[4，5-dimethyl-2-thiazolyl]-2，5-diphenyl-2Htetrazolium bromide）和DMSO 均購自美國Sigma公司；胎牛血清購自美國Gibco 公司。

1.2 細胞培養(yǎng)及分組

將SH-SY5Y細胞用含10%胎牛血清和1%雙抗（青霉素加鏈霉素）的高糖DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中使細胞貼壁生長，隔天換液。當細胞生長到80%～90%時，用0.25%胰酶進行消化傳代。待細胞處于生長對數(shù)期時，進行細胞計數(shù)、鋪板等操作，用于后續(xù)實驗。

將上述細胞隨機分為以下5 組：缺氧0 h 組，即無缺氧對照組；缺氧6 h 組；缺氧12 h 組；缺氧24 h 組；缺氧48 h 組。將4 組中的正常細胞培養(yǎng)液更換為無糖DMEM 培養(yǎng)基，并置于37℃自制恒溫缺氧罐中，使缺氧罐中逐漸充滿5%CO2和95%N2混合氣，直至達到無氧狀態(tài)。將上述細胞按照分組條件，置于無氧罐中分別行缺氧6、12、24 h 和48 h 后取出，更換高糖DMEM 培養(yǎng)基，置于正常培養(yǎng)箱中復(fù)氧4 h。缺氧0 h 組組細胞則于其余各組細胞缺氧開始及結(jié)束兩個時間點，相應(yīng)更換2 次正常培養(yǎng)基，并全程置于正常CO2細胞培養(yǎng)箱中使細胞正常生長，未行缺氧和復(fù)氧操作。分別于缺氧即刻及復(fù)氧后，將各組細胞置于顯微鏡下觀察，了解并記錄細胞的形態(tài)變化。

1.3 MTT 法檢測細胞生存率

根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，將上述96 孔板中每孔接種 5 000 個細胞，每孔100 μL 細胞懸液。待缺氧6、12、24 h 和48 h 各組細胞分別缺氧6、12、24 h或48 h 后，吸去無糖培養(yǎng)基，加入無酚紅高糖DMEM 培養(yǎng)基100 μL，同時進行復(fù)氧，此時每孔細胞加入MTT 溶液20 μL，小心操作避免污染，繼續(xù)避光孵育4 h 后終止復(fù)氧。缺氧0h組細胞僅更換2 次正常培養(yǎng)基。各組細胞均予400 g×3 min 離心后吸取上清液，每孔再加入150 μL DMSO 溶液，振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解，繼而在酶標儀上選擇490 nm 波長測定各組細胞光吸收值，以缺氧時間為橫坐標，生存率為縱坐標繪制細胞生長曲線。生存率計算公式為細胞生存率% =（缺氧組細胞吸光度值-調(diào)零孔吸光度值）/（對照組吸光度值-調(diào)零組吸光度值）×100%。

1.4 評估缺氧和復(fù)氧4 h 對細胞的損傷程度。

首先將SH-SY5Y 單細胞懸液稀釋為5×104/mL，于96 孔板中種板，使得每孔含100 μL 細胞懸液，隨機分為缺氧對照組、PBS 對照組和DADLE藥物處理組3 組。將上述3 組細胞分別加入等量無糖DMEM 培養(yǎng)基，置于37℃恒溫的5% CO2和95% N2缺氧罐中同步缺氧12 h。缺氧期間，缺氧對照組僅給予單純?nèi)毖跆幚聿唤o予任何藥物；而DADLE藥物處理組細胞每孔加入1 μL 濃度為100 pmol/L的DADLE 藥物進行孵育；PBS 對照組細胞每孔按照等容原則給予PBS 1 μL。缺氧12 h 結(jié)束后，從缺氧罐中取出3 組細胞，吸去無糖培養(yǎng)基，更換為高糖DMEM 培養(yǎng)基，置于正常培養(yǎng)箱中復(fù)氧，同時給予MTT 孵育4 h，復(fù)氧結(jié)束后采用MTT 法測定細胞生存率。

另選SH-SY5Y細胞研究其保護作用有無量效關(guān)系。即將SH-SY5Y細胞隨機分為6 組：D0 組：單純?nèi)毖踅M；D1 組：DADLE 10 pmol/L 組；D2組：DADLE 100 pmol/L 組；D3 組：DADLE 1 nmol/L 組；D4 組：DADLE 10 nmol/L 組；D5 組：DADLE 100 nmol/L 組。將上述6 組細胞同步缺氧12 h，缺氧期間，D0 組細胞僅給予單純?nèi)毖跆幚恚患尤肴魏嗡幬锓跤?；而D1、D2、D3、D4 和D5組則加入等容量（每孔1 μL）分別含有10 pmol/L、100 pmol/L、1 nmol/L、10 nmol/L 或100 nmol/L的DADLE 溶液進行處理。缺氧12 h 結(jié)束后，各組細胞同時復(fù)氧，并給予MTT 試劑孵育4 h 后檢測細胞生存率。

采用SPSS 24 進行統(tǒng)計學分析，所有數(shù)據(jù)以±s表示，各組間整體比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），兩兩比較采用LSD 檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 光鏡下SH-SY5Y細胞形態(tài)

結(jié)果顯示（圖1），可見正常SH-SY5Y細胞呈棒狀、桿狀或梭狀，有較短的或者中等長度的放射狀神經(jīng)突起，細胞核粗大。

圖1 正常SH-SY5Y細胞形態(tài)，×200Fig 1 Normal SH-SY5Y cell morphology，×200

2.2 SH-SY5Y細胞缺氧不同時間的顯微鏡下形態(tài)變化

光鏡下（圖2）可見：缺氧6 h后，SH-SY5Y細胞形態(tài)出現(xiàn)異常，表現(xiàn)為細胞形態(tài)變得細長，細胞間連接不再緊密。絕大部分細胞離開底壁，折光度變差。而復(fù)氧4 h后，部分細胞重新貼壁，但細胞狀態(tài)仍無法恢復(fù)正常。缺氧12 h后，SH-SY5Y細胞形態(tài)變化更為明顯，表現(xiàn)為細胞失去正常形態(tài)，變圓、腫脹，聚集成團，全部細胞均脫離底壁，而復(fù)氧4 h后，細胞仍不能貼壁，仍保持懸浮于培養(yǎng)液中。

2.3 SH-SY5Y細胞缺氧不同時間和復(fù)氧4 h 的生存率

無缺氧對照組的細胞生存率為100%。缺氧6 h 后復(fù)氧4 h 組細胞生存率為（68.1±4.3）%；缺氧12 h 后復(fù)氧4 h 組細胞生存率為（52.6±2.8）%；缺 氧24 h 后復(fù)氧4 h 組細胞生存率為（26.7± 1.5）%；而缺氧48 h 后復(fù)氧4 h 組細胞生存率為（3.5±1.7）%。缺氧6、12、24 h 和48 h 組與無缺氧對照組比較，細胞生存率的差異均有統(tǒng)計學意義，表現(xiàn)為隨著缺氧時間的延長，細胞的生存率逐漸降低（P＜0.05）。說明SH-SY5Y細胞體外缺氧6、12、24 h 或48 h，復(fù)氧4 h 后可導(dǎo)致不同程度的細胞損傷。

圖2 缺氧及復(fù)氧后的細胞形態(tài)，×200Fig 2 Cell morphology of SH-SY5Y after hypoxia and reoxygenation，×200

2.4 給藥DADLE 100 pmol/l 后細胞生存率變化

與單純?nèi)毖踅M比較，SH-SY5Y細胞缺氧12 h 期間給予DADLE100 pmol/L 處理可使細胞生存率上升到（58.7±0.5）%，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。而溶媒PBS 對照組細胞生存率無明顯增高（P＞0.05），說明用于溶解DADLE 的溶媒無作用，該保護作用是由DADLE 藥物本身產(chǎn)生。DADLE 對SH-SY5Y細胞缺氧12 h 復(fù)氧4 h生存率的影響如圖3 所示。

圖3 DADLE 100 pmol/L 對SH-SY5Y細胞缺氧復(fù)氧后 生存率的影響與缺氧對照組比較Fig 3 The effect of DADLE 100 pmol/L on the survival rate of SH-SY5Y cells after hypoxia-reoxygenation

2.5 不同濃度DADLE 對細胞缺氧復(fù)氧損傷的影響結(jié)果

結(jié)果顯示DADLE 10 pmol/L和100 pmol/L 2 個藥物劑量使神經(jīng)細胞生存率分別上升為（61.2±2.4）%和（58.7±0.5）%，與單純?nèi)毖鯇φ战M比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；而 DADLE 1、10 nmol/L 和100 nmol/L 3 個劑量組的細胞生存率與單純?nèi)毖踅M比較，未見明顯上升（P＞0.05）。DADLE 對SH-SY5Y 缺氧復(fù)氧保護作用的量效關(guān)系如圖4 所示?？梢奃ADLE 藥物的保護作用與DADLE 劑量密切相關(guān)，并呈現(xiàn)出小劑量的效果優(yōu)于大劑量的效果。隨著劑量的增加，其保護作用反而減弱。

3 討論

建立穩(wěn)定性高、可重復(fù)性強的神經(jīng)損傷模型是研究藥物神經(jīng)保護效果的關(guān)鍵。本實驗所采用的神經(jīng)母細胞瘤細胞SH-SY5Y細胞是實驗室中常用的研究神經(jīng)功能的工具細胞，可較好反映神經(jīng)細胞的一般特征。建立缺血再灌注損傷的缺氧復(fù)氧細胞模型有多種方法，目前應(yīng)用廣泛的方法是物理缺氧復(fù)氧法和化學缺氧復(fù)氧法。本研究使用的混合氣體培養(yǎng)法是目前建立體外細胞缺氧復(fù)氧模型最常用的方法[13]，其具體方案是將95%N2和5%CO2組成的混合氣體通入一個自制密閉盒子，制造無氧環(huán)境，將細胞在無氧環(huán)境培養(yǎng)相應(yīng)時間后再置于正常環(huán)境中培養(yǎng)，造成缺氧復(fù)氧損傷，從而模擬在體模型中的缺血再灌注損傷。

圖4 DADLE 對SH-SY5Y 缺氧復(fù)氧保護作用的量效關(guān)系Fig 4 The dose-effect relationship of DADLE on SH-SY5Y hypoxia-reoxygenation

本研究成功采用混合氣體培養(yǎng)法建立了SHSY5Y細胞體外缺氧復(fù)氧損傷模型。研究結(jié)果表明，缺氧12 h 后，SH-SY5Y細胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，表現(xiàn)為細胞失去正常形態(tài)，變圓、腫脹，聚集成團，全部細胞均脫離底壁，證明缺氧12 h 已經(jīng)對細胞狀態(tài)產(chǎn)生一定損害；而再復(fù)氧4 h 后，細胞仍不能貼壁，保持懸浮于培養(yǎng)液中，進一步說明缺氧12 h后復(fù)氧4 h 對細胞造成了明確損傷。同時MTT 檢測結(jié)果提示，缺氧12 h 后復(fù)氧4 h 可使細胞生存率降低至（52.6±2.8）%。據(jù)文獻報道，細胞生存率在30%～60%范圍內(nèi)，更有利于神經(jīng)保護藥物是否有效的評估[14]。而在預(yù)實驗中我們還發(fā)現(xiàn)，因SH-SY5Y細胞生長快、倍增時間短，缺氧后如復(fù)氧時間過長，細胞可能恢復(fù)生長，將影響最終生存率的正確判斷。因此，本研究確定缺氧12 h 后復(fù)氧4 h 可使細胞生存率維持在50%左右，可滿足藥物作用效果的實驗要求，可作為建立穩(wěn)定的體外SHSY5Y細胞缺氧復(fù)氧模型的條件。

阿片系統(tǒng)主要由多種阿片肽及其相應(yīng)受體組成，其中阿片受體主要包括κ 阿片受體（KOR），μ 阿片受體（MOR）和δ 阿片受體（DOR），其中DOR 廣泛分布于心、肝、肺、腎等組織器官中，在神經(jīng)系統(tǒng)中的腦和脊髓均有一定分布[15-16]。在大鼠大腦中動脈閉塞模型中的研究發(fā)現(xiàn)，DOR 的激活可對缺血后的腦細胞產(chǎn)生一定的神經(jīng)保護作用[17-18]。DADLE 是一種人工合成的δ 阿片受體激動劑，近年來，因其能誘導(dǎo)冬眠，延長外周和中樞組織細胞存活時間而受到關(guān)注[15]。據(jù)報道，DADLE可通過MEK-ERK 途徑促進細胞存活。同時DADLE 還可促進大鼠空間認知功能的恢復(fù)，并調(diào)節(jié)缺血后的神經(jīng)發(fā)生[19]。本研究首先選擇DADLE 100 pmol/L 探討DADLE 對神經(jīng)細胞缺氧復(fù)氧損傷有無保護作用，結(jié)果與單純?nèi)毖踅M比較，缺氧期間給予DADLE 100 pmmol/L 處理可使細胞生存率上升到（58.7±0.5）%；而其溶媒對照PBS 并無保護作用。上述結(jié)果提示DADLE 可減輕神經(jīng)細胞的缺氧復(fù)氧損傷，這與其他學者的研究結(jié)果相一致。

有研究表明，DADLE能降低大鼠海馬神經(jīng)元的死亡，改善其學習記憶能力和運動功能，作用與劑量有相關(guān)性[20]。因此，本研究在確認DADLE 100 pmol/L有明確保護作用的基礎(chǔ)上，進一步研究了缺氧期間給予其他不同劑量DADLE，使細胞孵育液的DADLE濃度變?yōu)楦〉?0 pmol/L和更大的1 nmol/L、10 nmol/L和100 nmol/L，對細胞進行處理后發(fā)現(xiàn)10 pmol/L和100 pmol/L 2個劑量對細胞有明顯保護作用，而1、10 nmol/L和 100 nmol/L對細胞的保護作用反而減弱甚至消失，該結(jié)果說明DADLE的神經(jīng)保護作用存在劑量依賴效應(yīng)，呈現(xiàn)出較小劑量的保護作用優(yōu)于較大劑量。推測DADLE的該種量效關(guān)系可能與DADLE在較大劑量和較小劑量時激活的機制不同有關(guān)，如分別激活依賴于阿片受體或不依賴于阿片受體兩種完全不同的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑從而產(chǎn)生不同的作用。其次，本研究發(fā)現(xiàn)，隨著藥物劑量增大，DADLE的神經(jīng)保護作用反而消失，這也可能是由于較大劑量的DADLE產(chǎn)生了毒副作用，反而對神經(jīng)細胞造成損傷所致。關(guān)于DADLE 減輕SH-SY5Y細胞缺氧復(fù)氧損傷的具體作用機制尚有待下一步設(shè)計實驗進行進一步研究。

綜上，本研究表明SH-SY5Y細胞體外缺氧6、12、24 h 或48 h，復(fù)氧4 h 后可導(dǎo)致不同程度的神經(jīng)細胞損傷，而缺氧期間給予DADLE 可對神經(jīng)細胞產(chǎn)生明確的保護作用，且該保護作用與DADLE 劑量存在效應(yīng)關(guān)系，呈現(xiàn)出10 pmol/L 和100 pmol/L 兩個較小劑量的保護效果優(yōu)于1、10 nmol/L 和 100 nmol/L 3 個較大劑量。本研究為采用阿片受體激動劑作為神經(jīng)缺氧復(fù)氧損傷的保護作用提供了一定的實驗室依據(jù)。