朱 慧 吳菲菲 王正梅 張昆龍 楊 依 王亞云△

（1 延安大學醫(yī)學院解剖學教研室，延安 716000；2 空軍軍醫(yī)大學基礎醫(yī)學院基礎醫(yī)學教學實驗中心，西安 710032）

杜氏肌營養(yǎng)不良癥（Duchenne muscular dystrophy，DMD）是一種致死性X連鎖隱性遺傳病，患者缺少編碼肌營養(yǎng)不良蛋白dystrophin的基因，活產(chǎn)男嬰的發(fā)病率為1/3 500，目前我國受該疾病困擾的患者有7～8萬人[1]。最終平均22歲時因循環(huán)或呼吸衰竭死亡[2]。該病的治療方法一直是醫(yī)學界的難題。近期研究表明，干細胞具有歸巢、促進損傷修復、旁分泌等生物學特性[3]，為治療DMD帶來希望。Friedenstein等[4]首次分離到間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cell，MSC），確立了MSC的鑒定標準[5]為貼壁生長、成纖維細胞樣形態(tài)特征，表達CD29、CD44、CD90、CD105而不表達CD34、CD45、MHC-Ⅱ等分子標志物。采用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液可以分離到胎兒間充質(zhì)干細胞（fetal mesenchymal stem cell，hfMSC），其特性與成體間充質(zhì)干細胞（adult mesenchymal stem cell，aMSC）明顯不同[6]。

X 染色體-連鎖肌萎縮小鼠（X chromosomelinked muscular dystrophy deficient mouse，mdx小鼠）是國際公認的DMD 動物模型[7]。有研究證實MSC 可在mdx 小鼠體內(nèi)產(chǎn)生dystrophin。為了進一步研究hfMSC 的特性，本研究從人胎兒骨髓組織中分離鑒定hfMSC，并以mdx 小鼠為動物模型，觀察hfMSC 在mdx 小鼠體內(nèi)產(chǎn)生dystrophin的可能性。

1 材料和方法

1.1 實驗材料及動物

人胎兒骨髓組織的獲得及細胞制備都經(jīng)過相關(guān)倫理委員會批準，并獲得產(chǎn)婦知情同意。DMD 模型種鼠由英國牛津大學Davies 教授惠贈（動物入境檢疫許可證號為AD44010011），小鼠飼養(yǎng)于屏障系統(tǒng)環(huán)境動物實驗室。

DMEM/f12 培養(yǎng)基、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）和trypsin-EDTA（Invitrogen，USA），流式細胞術(shù)抗體（Ebioscience，USA）；一抗mouse-anti-human Oct-4、Nanog-3、dystrophin和 二 抗FITC-goat-anti-mouse IgG（Santa Cruz，USA）；HRP-conjugated rabbit /mouse antibody（Gene，上海）。

1.2 hfMSC 的分離培養(yǎng)

無菌條件下，以5 mL 無菌注射器經(jīng)流產(chǎn)胎兒（3～4月齡）兩側(cè)脛骨粗隆下方進針穿刺，采集骨髓，PBS 稀釋后以1 200 r/min 進行離心，棄去上清液，重復2 次，將下層細胞貼壁培養(yǎng)，擴增分離hfMSC。用含10%新生牛血清的DMEM/F12 培養(yǎng)液重懸骨髓細胞并轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶中靜置培養(yǎng)。每2～4 d 換液，待細胞生長至80%融合狀態(tài)時，用trypsin/EDTA 消化傳代細胞。將第3 代細胞用于實驗研究。

1.3 hfMSC 免疫組織化學染色鑒定

將無菌蓋玻片分別置于6 孔板的6 個孔內(nèi)，再將含10%FBS 的培養(yǎng)液懸浮細胞后滴入無菌蓋玻片上，勿使細胞流出蓋玻片外，待細胞貼壁后形成爬片，用移液槍從蓋玻片邊緣吸走培養(yǎng)液，加入4%甲醛固定，10 min 后吸走液體，加入0.5% Triton X-100，孵育10 min。PBS 搖床漂洗，封閉液孵育10 min 后再用PBS 漂洗，其中4 張蓋玻片分別加一抗（Oct-4 和Nanog-3），保鮮膜包裹，置于4℃，第2 天PBS 漂洗，用HRP 標記的二抗孵育液30 min。不加一抗染色的細胞爬片為陰性對照，置于顯微鏡下觀察。

1.4 hfMSC 流式細胞術(shù)鑒定

用生理鹽水懸浮收集的第3代hfMSC，1 500 r/min 離心3 min，重復2次，制成單細胞懸液，濃度為5×105/mL，至少5 mL，將其分裝至5個流式管，不加抗體的試管作為空白對照，另外4管分別加CD29-FITC、CD34-FITC、CD90-APC、CD105-PE單克隆抗體充分混勻，避光室溫孵育30 min，PBS離心（1 500 r/min，3 min）漂洗以棄除未結(jié)合抗體，用PBS重懸至所需體積（每管5 mL左右）進行流式細胞儀檢測。

1.5 mdx 小鼠的準備

將待鑒定子代鼠分組打耳號標記，將小鼠置于露尾固定器中，乙醇擦拭后剪斷尾尖組織2～5mm，取自然滴下的200～400 μL 血液，滴入對應編號的抗凝管（加入120 μL ACD 抗凝劑的 1.5 mL EP 管）中。按照血液基因組DNA 提取試劑盒說明書要求的步驟提取DNA。TE 液稀釋10 μL樣品DNA，紫外分光光度計比色測定核酸A260 與蛋白質(zhì)A280 值進行DNA 質(zhì)量控制。序列特異性引物聚合酶鏈式反應（sequence specific primerspolymerase chain reactio，PCR-SSP）方法鑒定出基因型，其中mdx 小鼠用于實驗研究。

1.6 動物分組及細胞注射

將mdx 小鼠隨機分為移植組和對照組2 組，每組8 只。將已經(jīng)制備的hfMSC 懸浮于生理鹽水中，濃度為1×106/mL（其中一半用DIR 溶液標記，詳述見1.2.3），以皮下注射方式，在移植組每只mdx小鼠腹股溝三角注射hfMSC，體積為0.2 mL，注意穿刺不宜過深，回抽無回血后輸注，以免傳入股動脈或股靜脈等附近血管中。對照組mdx 小鼠相應部位注射生理鹽水。

1.7 活體成像儀下觀察及dystrophin免疫熒光染色檢測

上述第3 代hfMSC，取其中1/2，加入0.1% 1,1-dioctadecyl-3,3,3,3-tetramethylindotricarbocyanine iodide（DIR）溶液（溶質(zhì)為含10% FBS 的DMEM/F12 培養(yǎng)液）培養(yǎng)4 h 后，消化收集，用生理鹽水重懸，調(diào)整濃度至1×106/mL，隨機選取移植組中3 只mdx 小鼠，于其腹股溝三角注射該細胞懸液每只0.2 mL。隨機選取對照組mdx 小鼠3 只注射等體積生理鹽水。因活體毛皮有自發(fā)熒光影響觀察，因此注射細胞后1 個月處死小鼠去除皮毛，取后肢于活體成像儀下觀察。每只再取一部分腓腸肌組織制作冰凍切片，血清封閉處理后，加入dystrophin 一抗于4℃孵育過夜，加入二抗-FITC 避光孵育1 h，漂洗后鏡下觀察。

1.8 病理觀察及安全性評估

取注射hfMSC 1月后的小鼠每組3 只處死取材，組織塊大小不超過0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm 為宜。先用0.9%的生理鹽水漂洗，包埋，做好標記，然后迅速浸泡于4%多聚甲醛中固定，常規(guī)切片后H-E 染色，并顯微鏡下觀察拍照記錄。將移植組、生理鹽水組的小鼠腓腸肌病理切片（每只小鼠隨機選取1 張）在10×20 倍鏡下隨機挑選6 個視野，分別計數(shù)每個視野內(nèi)的肌纖維總數(shù)和核中心位移纖維（centrally nucleated fiber，CNF）的數(shù)目，計算CNF 比例。CNF 比例=（核中心移位纖維數(shù)／總肌纖維數(shù)）×100%。

對注射hfMSC 組小鼠進行解剖，觀察小鼠各個器官的形態(tài)結(jié)構(gòu)以及是否出現(xiàn)腫瘤等腫塊增生或者畸形等發(fā)生。

1.9 統(tǒng)計學處理

應用SPSS 20.0 軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料以±s表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，組內(nèi)比較采用單因素方差分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 hfMSC 的形態(tài)特征和表型

用 含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液培養(yǎng)hfMSC，較易分離到貼壁生長的成纖維細胞樣細胞。傳代后呈對數(shù)增殖生長，排列緊密，呈旋渦狀（圖1A，見封三）。熒光免疫染色觀察到貼壁生長的細胞的細胞核表達Nanog-3（圖1B，見封三）和Oct-4（圖1C，見封三）。流式細胞儀檢測細胞表面免疫表型結(jié)果顯示：CD29、CD90、CD105 高表達（圖1E、F、G，見封三），而CD34 低表達（圖1H，見封三），即表達MSC 的常見抗原標志，低表達造血干細胞常見抗原標志。

圖1 hfMSC 的形態(tài)特征和mdx 小鼠的鑒定。A：旋渦狀生長的hfMSC，bar=400 μm。B：Nanog-3 在 hfMSC 細胞核中表達，棕色，bar=100 μm。C：Oct-4 在hfMSC 細胞核中表達，棕色，bar=100 μm。D：3 種基因型小鼠的PCR-SSP 電泳圖，采集雜合子小鼠全血提取的DNA 進行PCR-SSP 分析。1：mdx 小鼠（340 bp）；2：dko 小鼠（285 bp）；3：雜合子小鼠（285 bp+340 bp）；4：純水為樣本作為空白對照。E-H：hfMSC 免疫表型分析，CD29 陽性表達（E），CD90 陽性表達（F），CD105 陽性表達（G），CD34 陰性表達（H）.Fig 1 Characteristics of hfMSC and identification of mdx mice.A：hfMSC growing like vortex，bar=400 μm；B：Nanog-3 was expressed in hfMSC nucleus，brown，bar=100 μm；C：Oct-4 was expressed in hfMSC nucleus，brown，bar=100 μm；D：The PCR-SSP electrophoresis maps of the three genotype mice were used to identify mdx mice.The bands were as follows：1.mdx mice（340 bp）；2.dko mice（285 bp）；3.Heterozygous mice（285 bp+340 bp）；4.Pure water was used as a blank control sample.E-H：Immunophenotypic analysis of hfMSC，CD29 positive expression（E），CD90 positive expression（F），CD105 positive expression（G），CD34 negative expression（H）.

圖2 hfMSC 可修復損傷肌組織，并重建dystrophin 的表達。A：離體mdx 小鼠后肢熒光成像，注射hfMSC-DIR 的mdx 小鼠后肢可見熒光（左）。對照mdx 鼠后肢未見熒光信號（右）；B：注射hfMSC 的移植組mdx 小鼠肌細胞膜表達dystrophin，綠色熒光，bar=100 μm；C：對照mdx 小鼠肌組織無表達，bar=100 μm；D：對照組mdx 小鼠肌細胞核中心位移較多，肌纖維變圓，結(jié)締組織在其間增生，bar=100 μm；E：移植hfMSC 組mdx 小鼠肌纖維較規(guī)整，核中心位移現(xiàn)象較少，bar=200 μm；F：對照組和實驗組mdx 小鼠核中心位移纖維占比具有統(tǒng)計學差異.Fig 2 hfMSC could repair damaged muscle tissue and reconstruct the expression of dystrophin.A：Limbs isolated from mdx mice were exposed to imaging system.Fluorescence imaging of hindlimbs of mdx mice injected with hfMSC-DIR showed fluorescence sigal（left），no fluorescence signal in hind limbs of control mdx mice（right）；B：The expression of dystrophin（green fluorescence）in the muscle cell membrane of mdx mice in the treatment group injected with hfMSC，bar=100 μm；C：No dystrophin（green fluorescence）expression in the muscle tissue of mdx mice in control group，bar=100 μm；D：In mdx mouse of the control group，most of the nucleus of the muscle cells were centrally moved，the muscle fibers became round，and the connective tissue proliferated，bar=100 μm；E：The muscle fibers of the mdx mice in the transplanted hfMSC group were more regular and the nuclear central displacement was less，bar=200 μm；F：CNF in mdx mouse of the two groups was statistically different；*P＜0.01 vs control mdx.

2.2 mdx 小鼠的鑒定

用PCR-SSP 方法鑒定子代鼠，1 個340 bp 條帶的是mdx 小鼠；1 個285 bp 條帶的是dko 小鼠；340 bp 和285 bp 2 個條帶的是雜合子mdx 小鼠（圖1D，見封三）。本次鑒定出mdx 小鼠17 只，用于后續(xù)實驗。

2.3 活體成像儀下觀察結(jié)果及免疫熒光染色分析

因小鼠皮毛有自發(fā)熒光，黑色素是主要的自發(fā)熒光來源，其發(fā)光光線波長峰值在500～520 nm左右，血液也有自發(fā)熒光，這些非特異性熒光會影響檢測的靈敏度，因此本實驗將小鼠處死并去除皮毛再進行觀察。mdx 小鼠腹股溝三角皮下注射hfMSC 1月后處死，進行一系列實驗觀察。注射hfMSC- DIR 組mdx 小鼠，小動物活體成像儀下可見后肢股直肌和腓腸肌等區(qū)域檢測到強烈的熒光（信號顏色的范圍是6.61×107～1.26×109，圖2A 左，見封三），而注射生理鹽水的對照組mdx 小鼠后肢肌則無熒光信號（圖2A 右，見封三）。用免疫熒光法在mdx 小鼠腓腸肌纖維細胞膜上觀察到人dystrophin 的表達（圖2B，見封三），而對照組mdx 小鼠腓腸肌上則沒有綠色熒光，即沒有人dystrophin 的表達（圖2C，見封三）。

2.4 腓腸肌病理變化分析

肌細胞核中心移位是評價肌組織壞死和再生的重要病理指標，通過觀察病理切片并計算出CNF占所有肌纖維的比例，可以評價肌肉病理狀況。正常肌纖維大小均勻，呈多角形近似六邊形，排列整齊，無變性壞死的肌纖維，細胞核位于肌纖維的周邊，肌間隙正常。對照組mdx 小鼠肌纖維失去正常的細胞形態(tài)，輪廓大都變圓，間隙增寬，脂肪、纖維結(jié)締組織增生，肌纖維大小不等，部分裂開，部分呈均質(zhì)性改變，肌細胞間存在大量纖維結(jié)締組織增生和炎性細胞浸潤（圖2D，見封三），CNF 占比例較多；移植組肌纖維間隙變窄，排列較規(guī)整，CNF 占比減?。▓D2E，見封三），2 組之間CNF 存在顯著差異（圖2F，見封三）。

2.5 移植安全性評估

解剖觀察分析每只注射hfMSC 的mdx 小鼠肌、腦、肺、心、胃、肝、脾、膽囊、腸、腎、骨髓等各器官及胸膜、腹膜等部位，形態(tài)結(jié)構(gòu)均無異常，未發(fā)現(xiàn)腫瘤、畸形等情況。

3 討論

本研究采用含血清的培養(yǎng)液容易從胎兒骨髓中分離獲得貼壁密集排列、呈典型旋渦狀生長的成纖維細胞樣干細胞，從分離方法和細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)特征判斷，完全符合MSC 的特點[8]，且免疫染色分析顯示這些細胞還表達胚胎干細胞標志性蛋白Oct-4 和Nanog-3。本團隊早前研究無血清培養(yǎng)液從成體骨髓中獲得的干細胞表達多潛能抗原標志[9]，而且比傳統(tǒng)意義上的MSC 具有更強的成肌分化能力。人體發(fā)育早期（胎兒期）骨髓中存在尚未分化的多潛能干細胞，在含血清的培養(yǎng)液中短期擴增可以維持干細胞的全能性，是獲取分化能力強、分化方向多的“種子細胞”的良好來源。傳統(tǒng)意義上的MSC 移植是安全的[10-12]，與此同時，Oct-4 和Nanog-3 等通常是胚胎干細胞的抗原標志[7]，hfMSC 表達這些多潛能抗原標志，與胚胎干細胞有一定相似性，也就是說hfMSC 兼具MSC 和胚胎干細胞2 種細胞的特性。理想的狀態(tài)是hfMSC 作為種子細胞既具有MSC 的安全性，又具有胚胎干細胞的強分化、多分化能力。

本研究將DIR標記的hfMSC注射到mdx小鼠腹股溝三角皮下，移植后1月時在mdx小鼠后肢肌纖維豐富的部位檢測到了明顯的熒光信號，若細胞死亡且經(jīng)過1個月的時間，則熒光信號將隨代謝減弱，但本研究觀察到熒光信號較強，表明注入皮下的細胞歸巢到損傷肌細胞較多的區(qū)域定植。mdx小鼠不表達dystrophin。正常情況下dystrophin分布于骨骼肌和心肌細胞膜的質(zhì)膜面，因此最初的hfMSC細胞上也沒有表達dystrophin。本研究熒光免疫組織化學法檢測到mdx小鼠肌組織中有人dystrophin的表達，且由熒光形態(tài)可見dystrophin分布于mdx小鼠肌細胞表面，并沒有呈現(xiàn)hfMSC壞死破裂導致的彌散性分布，這更加證明了hfMSC在mdx小鼠體內(nèi)可以存活，并且具有向肌細胞再生分化的功能，可以通過dystrophin修復損傷肌細胞。解剖觀察肌組織及周圍結(jié)構(gòu)，沒有發(fā)現(xiàn)異常結(jié)構(gòu)或畸形、腫瘤，表明hfMSC雖然表達胚胎干細胞部分抗原標志，但hfMSC不像胚胎干細胞那樣移植到體內(nèi)會發(fā)育為畸胎瘤，反而具有MSC的安全性。這表明采用不同培養(yǎng)體系從不同組織來源分離獲得的干細胞有可能呈現(xiàn)出不同的生物學特性[13]。若要更加廣泛地用于再生醫(yī)學研究，hfMSC的可行性及安全性仍然需要具體情況具體分析和更加深入細致地研究。