徐主恩 章 波 黎 榮 洪家旺 陳 亮 吳永剛

（上海市浦東醫(yī)院急診科，上海 201300）

隨著科技發(fā)展和社會(huì)進(jìn)步，心血管藥物及器械取得突破性的進(jìn)展，但心肌梗死死亡率仍然居高不下。近年來(lái)，干細(xì)胞為基礎(chǔ)的細(xì)胞治療成為心肌梗死研究的熱點(diǎn)，其機(jī)制主要為旁分泌效應(yīng)[1]。雖然干細(xì)胞治療心肌梗死安全可行，但是細(xì)胞移植后在損傷區(qū)域分布的數(shù)量較少，且細(xì)胞在移植后凋亡較快，是否致瘤也不明確[2-4]。因此，尋找新的靶點(diǎn)和方法實(shí)施干細(xì)胞對(duì)心梗的治療具有重要意義。外泌體是一種直徑在30～120 nm 有膜結(jié)構(gòu)的納米囊泡，形成于細(xì)胞小體，并被釋放到細(xì)胞外周，能夠通過(guò)傳遞蛋白、microRNA 等介導(dǎo)細(xì)胞間的信號(hào)。研究報(bào)道，干細(xì)胞來(lái)源的外泌體在心保護(hù)方面作用顯著，其能夠抑制心肌細(xì)胞凋亡、促進(jìn)新生血管生成、改善心肌梗死后功能[5-9]。但是脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（adipose tissue-derived stromal cell，ADSCs）來(lái)源的外泌體及其對(duì)心肌梗死的治療，卻鮮有報(bào)道。本研究擬將ADSCs 來(lái)源的外泌體，通過(guò)免疫印跡和透射電鏡的方法進(jìn)行鑒定，并用純化后的外泌體處理缺血缺氧24 h 后H9C2 細(xì)胞，觀察其凋亡和增殖的變化，從而確定ADSCs 來(lái)源的外泌體對(duì)心肌梗死后心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和材料

3～4 周雄性SD 大鼠（50～60 g），由第二軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物中心提供。培養(yǎng)基DMEM/F12、培養(yǎng)基1640 和胎牛血清（FBS）購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司；TUNEL 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海漢恒生物公司；CCK8 試劑盒購(gòu)自浙江碧云天生物公司；外泌體提取試劑盒購(gòu)自上海領(lǐng)科生物；CD9、CD63、CD81 抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam 公司；山羊抗小鼠IgG二抗購(gòu)自英國(guó)Invitrogen 公司。

1.2 ADSCs 的分離、培養(yǎng)

大鼠經(jīng)頸椎脫臼處死后，取大鼠腹股溝處脂肪并用無(wú)菌刀片切碎成糊狀，用0.15%的Ⅳ型膠原酶在37℃消化45 min，1 500 r/min 離心5 min，去除懸浮的上清液和脂肪，加入培養(yǎng)液：DMEM/F12+15% FBS+1% penicillin/streptomycin，將 細(xì)胞重懸，接種于75 cm2培養(yǎng)瓶，置入37℃含5%的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。24 h 后換液，去除未貼壁細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞融合達(dá)80%～90%時(shí)，進(jìn)行細(xì)胞1：2 傳代，傳至第4 代待用。

1.3 ADSCs 外泌體的提取

第4 代ADSCs 無(wú)血清無(wú)氧培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞上清液，在4℃條件下，2 000 r/min 離心20 min，除去殘?jiān)?；轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入1/3 體積的外泌體分離液；顛倒直至完全混勻，放4℃過(guò)夜。4℃過(guò)夜后可見(jiàn)白色渾濁形成；4℃，5 000 r/min，離心30 min 棄上清，再次重復(fù)以上離心。剩余的沉淀即為外泌體。

1.4 外泌體電鏡觀察

取分離純化外泌體 8 μL，加入等體積平衡鹽PBS 溶液稀釋后滴加于2 mm 的載樣銅網(wǎng)上，于室溫靜置1 min，用濾紙吸去多余液體，用3%（w/v）磷鎢酸鈉溶液（pH6.8）室溫負(fù)染5 min，用雙蒸水洗后室溫晾干，于透射電鏡下觀察并拍照。

1.5 免疫印跡檢測(cè)

將提取的外泌體用0.1 mol/L PBS 清洗后加Radio-Immunoprecipitation Assay（RIPA）buffer進(jìn)行細(xì)胞裂解。取上清液，用Bradford 法測(cè)蛋白濃度，于100℃水中煮5 min，離心備用。制備分離膠，加樣，SDS-PAGE 電泳，取出膠板進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，染膜，然后用一抗CD9（1∶1 000）、CD63（1∶1 000），CD81（1∶2 000），4℃孵育過(guò)夜。二抗（1∶2 000）室溫孵育2 h。取膜后TBST 漂洗，用保鮮膜包好PVDF 膜，暗室中用X 膠片感光、顯影、定影。

1.6 H9C2 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

分別取24 孔板中單獨(dú)培養(yǎng)和10 μg 外泌體處理48 h 的H9C2 細(xì)胞。用4%多聚甲醛固定10 min，用0.3% Triton X-100 通透10 min，每孔加100 μL TUNEL 檢測(cè)試劑，37℃避光孵育60 min，PBS 洗滌 3 次，用DAPI 染色5 min，用PBS 洗滌3 次后置于熒光顯微鏡下觀察。

1.7 H9C2 細(xì)胞增殖能力檢測(cè)

分別取單獨(dú)培養(yǎng)（外泌體處理0 h）和外泌體處理（20 μg/mL）24 h、48 h 和72 h 的H9C2細(xì)胞。分別經(jīng)胰酶消化制成單細(xì)胞懸液，接種于 96 孔培養(yǎng)板中，濃度為3×103細(xì)胞/孔，待細(xì)胞貼壁后，分別用10 μg ADSC-exosome 處理，每孔加 5 μL CCK8，反應(yīng)3 h 后，用酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測(cè)，450 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定96 孔板上每個(gè)孔的吸光度值（OD）。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

以上實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次，結(jié)果取平均值。應(yīng)用SPSS18.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以±s表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組之間的差異采用單因素方差分析（one-way，ANONA）。

2 結(jié)果

2.1 ADSCs 形態(tài)特征

細(xì)胞接種24 h 后，將培養(yǎng)基棄掉，并反復(fù)用PBS 清洗后，可見(jiàn)瓶底有零星的貼壁細(xì)胞，形態(tài)呈多角形或梭形即為ADSCs。培養(yǎng)3 d 后，ADSCs 呈團(tuán)簇狀聚集生長(zhǎng)。傳代后，細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，兩端有較長(zhǎng)突起，均勻分布生長(zhǎng)。傳至第4 代時(shí)，細(xì)胞純度可達(dá)99%以上。第1 代至第4 代細(xì)胞形態(tài)變化不明顯（圖1）。

圖1 ADSCs 形態(tài)特征，標(biāo)尺=50 μmFig 1 Morphology of ADSCs，bar=50 μm

2.2 外泌體的形態(tài)和表形特征

透射電鏡下ADSC 外泌體呈圓形或橢圓形，直徑30～120 nm，有完整胞膜結(jié)構(gòu)，內(nèi)含低密度物質(zhì)（圖2）。免疫印跡結(jié)果證實(shí)其表達(dá)外泌體表面標(biāo)志CD9、CD63 和CD81（圖3）。

2.3 H9C2 細(xì)胞的凋亡檢測(cè)

在缺血缺氧24 h 又經(jīng)ADSCs 外泌體處理48 h之后，TUNEL 檢測(cè)結(jié)果顯示H9C2 細(xì)胞凋亡的數(shù)量相比于未處理組有明顯的下降（圖4）。在光鏡下可見(jiàn)經(jīng)過(guò)外泌體處理后的H9C2 細(xì)胞，其細(xì)胞狀態(tài)相對(duì)更好。以上結(jié)果提示ADSCs 外泌體抑制缺血缺氧H9C2 細(xì)胞的凋亡。

圖2 ADSCs 外泌體的透射電鏡觀察Fig 2 Electron micrographs of ADSCs-derived exosomes

圖3 ADSCs 外泌體表達(dá)CD9、CD63、CD81 標(biāo)記蛋白Fig 3 Exosomes secreted from ADSCs were identified by protein marker CD9，CD63，and CD81

2.4 H9C2 細(xì)胞的增殖檢測(cè)

CCK8 檢測(cè)結(jié)果提示H9C2 細(xì)胞在經(jīng)過(guò)ADSCs處理24 、48 h 和72 h 后，其增殖能力相較于對(duì)照組有明顯的增強(qiáng)（圖5）。說(shuō)明ADSCs 外泌體促進(jìn)缺血缺氧H9C2 細(xì)胞的增殖。

3 討論

多種干細(xì)胞可用于治療心肌梗死、心力衰竭等心臟疾病。ADSCs 可從皮下脂肪獲得，取材方法更為簡(jiǎn)單，容易被患者所接受[10]，而且受年齡影響比較小，年長(zhǎng)患者依然可以獲得活力較好的ADSCs[11-12]。脂肪干細(xì)胞的增殖能力很強(qiáng)，可在短時(shí)間內(nèi)獲得大量活力較好的細(xì)胞。ADSCs 在基礎(chǔ)研究和臨床移植中取得了較好治療效果[13]。但是仍面臨一些障礙：細(xì)胞在損傷區(qū)滯留率比較低，細(xì)胞植入體內(nèi)后存活率也比較低，雖早期有一定作用，但長(zhǎng)期保護(hù)作用卻未知[14-15]。

圖4 H9C2 細(xì)胞經(jīng)ADSCs 外泌體處理48 h 后（圖B），相比于未處理組（圖A），細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯減少，bar=25 μmFig 4 The apoptosis of H9C2 cells was significantly reduced after 48 h exosomes treatment（B）with comparison to no treatment（A），bar=25 μm

圖5 H9C2 細(xì)胞的增殖能力Fig 5 Proliferation of H9C2 cells

而ADSCs 外泌體既可以起到對(duì)心的保護(hù)作用，又可避免以上問(wèn)題，所以成為新的研究熱點(diǎn)。實(shí)際上，外泌體確實(shí)可以通過(guò)生長(zhǎng)因子、趨化因子、細(xì)胞因子、轉(zhuǎn)錄因子、基因和RNA 起到一定作用。作為一種膜囊泡，外泌體不僅有裝載大量貨物的能力，但也能保護(hù)蛋白質(zhì)和RNA 等物質(zhì)的降解酶或化學(xué)物質(zhì)[16]。而且，外泌體可以減少心肌細(xì)胞的凋亡，影響心重構(gòu)，改善心肌功能。

本實(shí)驗(yàn)用對(duì)H9C2 細(xì)胞進(jìn)行缺血缺氧的培養(yǎng)方式在體外建立心梗模型。ADSCs 外泌體對(duì)H9C2 細(xì)胞處理后，顯示其凋亡減少，增殖能力變強(qiáng)。所以，ADSCs 外泌體對(duì)心肌梗死有保護(hù)作用，是治療心肌梗死的新方法。