潘曉明 吳玲玲 陳浩浩 傅曉艷 王文倩 江文嬌 張 輝 丁明星△

（1 金華職業(yè)技術學院醫(yī)學院解剖學教研室，金華 321007；2 金華市思丹姆干細胞生物科技有限公司，金華 321007；3 金華市食品藥品檢驗檢測研究院，金華市實驗動物中心，金華 321000）

在脊髓損傷后，53%～80%患者長期遭受中度至重度疼痛[1-2]，這種神經病理性痛多發(fā)生于脊髓損傷平面以下、痛覺已經消失區(qū)域[3]。因其發(fā)生機制目前仍不明確，致使傳統(tǒng)的藥物和手術治療往往無明顯效果[4]，臨床治療非常棘手。近年來的研究結果顯示干細胞能夠在特殊情況下增殖和分化為神經細胞，如成熟神經元或神經膠質細胞[5-6]，從而有助于功能恢復，但較少關注是否對緩解疼痛有效。在脊髓損傷的治療中，干細胞具有良好的治療潛力。骨髓、脂肪組織、胎盤、羊水和臍帶是間充質干細胞的良好來源。而人臍帶間充質干細胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUC-MSCs）具有更高的擴增能力、更強的增殖能力和更低的細菌或病毒感染風險，因而更具推廣應用價值[7-9]。本研究采用脊髓損傷壓縮方法制作小鼠脊髓損傷模型，并行hUC-MSCs 局部注射移植，確定hUC-MSCs 對脊髓損傷誘導的神經性疼痛的影響，為干細胞在脊髓損傷的神經病理性痛治療提供依據。

1 材料和方法

1.1 材料

臍帶組織為健康產婦自愿捐贈，由金華市思丹姆干細胞生物科技有限公司提供。ICR 小鼠購自上海斯萊克實驗動物有限公司，實驗動物生產許可證號SCXK（滬）2012-0002，實驗動物使用許可證號SYXK（浙）2015-0008。DMEM、胎牛血清（FBS）、胰酶及青霉素、鏈霉素均購自購自美國Gibco 公司（Waltham，MA，USA）；CD34、CD45、CD19、CD14、CD105、CD90、CD73熒光素偶聯(lián)抗體購自BD公司（BD Bioences，F(xiàn)ranklin Lakes，NJ，USA）；巨噬細胞激活抗原1（ED1/CD68）購自OmnimAbs（New Jersey）；白細胞介素-6（interleukin 6，IL-6）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、膠質細胞源性神經營養(yǎng)因子（glial cell-derived neurotrophic factor，GDNF）ELISA檢測試劑盒購自杭州聯(lián)科生物技術公司。

1.2 hUC-MSCs 分離培養(yǎng)及鑒定

取臍帶組織，用PBS 液清洗組織3 遍，用眼科剪刀將組織標本剪碎；將臍帶轉移至細胞分離管中，加入2 mL 基礎培養(yǎng)基（DMEM-F12+10%胎牛血清+1%青、鏈霉素）后，組織分離器攪拌3 次（每次45 s）。然后將組織轉移至50 mL 離心管中加入適量PBS，300 r/min 離心15 min，棄上清，再加入PBS 重復洗滌3 次，加培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待細胞匯合度達到80%以上，收集細胞并傳代，傳至第3 代時，收集細胞用于流式細胞儀檢測，觀察細胞表面分子CD19、CD14、CD34、CD45、CD73、CD90、CD105 的表達情況。

1.3 綠色熒光蛋白（GFP）標記慢病毒轉染hUC-MSCs

對鑒定后的hUC-MSCs 傳代擴增，收集細胞，配成5×105/mL 細胞懸液，接種于6 孔板中，4 h 后換液，棄去部分培養(yǎng)基，加MOI 值為10 的病毒及8 ng/mL Polybrene，培養(yǎng)6 h 后，換液，繼續(xù)培養(yǎng)72 h，收集細胞用于后續(xù)實驗。

將2×106個hUC-MSCs接種于10 cm細胞培養(yǎng)皿，加入DMEM/F12完全培養(yǎng)基培養(yǎng)至80%～90%匯合后。用GFP慢病毒感染hUC-MSCs，分別感染48、72 h和96 h時，于熒光顯微鏡下進行觀察 GFP表達情況。確定最佳GFP 慢病毒最佳感染時間。GFP標記慢病毒載體委托杭州赫貝生物技術公司構建合成，最終得到滴度為1×108TU/mL的病毒顆粒。

1.4 脊髓損傷模型構建

挫傷型脊髓損傷小鼠模型的建立依據文獻[10]略有調整。取 ICR 小鼠（15周，雄性，37～45 g），戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，采用椎板切除術暴露 T9～T10處脊髓。采用脊髓打擊器于暴露脊髓處施加 90千達因的力造成挫傷型脊髓損傷，脊髓損傷后連續(xù) 10 d每天肌肉注射慶大霉素（8 mg/kg）防止術后感染，并每天2次人工膀胱按壓擠尿直至恢復自主膀胱活動為止（防止尿潴留）。處理1周后進行Basso Beattie Bresnahan（BBB）評分，評估小鼠后肢運動能力；BBB評分為0時，模型構建成功。

1.5 hUC-MSCs 移植及實驗分組

脊髓損傷造模成功后，小鼠分模型組與治療組，每組8只，模型組于受損脊髓的損傷中心處以1 μL/min注入無生長因子的3 μL 培養(yǎng)基（不含細胞）；hUC-MSCs 移植方法參照文獻[11]，治療組于受損脊髓的損傷中心處以1 μL/min 注入無生長因子的 3 μL 培養(yǎng)基（含hUC-MSCs 1.0×105/μL）。注射處理于挫傷型脊髓損傷1 周后，于受損脊髓損傷中心處進行，且注射后針頭滯留5 min 以減少細胞泄露。細胞移植后每天注射環(huán)孢霉素免疫抑制劑（10 mg/kg）。脊髓損傷后，16 只小鼠飼養(yǎng) 3 周時，根據脊髓損傷后3 周的BBB 檢測結果，每組取3 只小鼠進行免疫熒光及 ELISA 檢測，剩余10 只小鼠繼續(xù)飼養(yǎng)進行行為學檢測。脊髓損傷后 9 周時所有受損脊髓中心進行包埋。

1.6 小鼠雙后肢運動功能的BBB 評分[12]

hUC-MSCs 注射后2 周（即脊髓損傷后3周）共16 只小鼠進行行為學檢測，每組選擇變化顯著的 3 只小鼠的脊髓組織進行病理學檢測。剩余 5 只小鼠依舊隔1 周（即 脊髓損傷后5、7、9 周）進行 BBB 檢測。分值范圍為 0～21 分，其中 0 分代表后肢完全失去運動功能，21 分代表后肢運動功能基本正常。

1.7 機械觸誘發(fā)痛檢測

參照文獻[13]，將小鼠置于金屬網格的架子上使之適應環(huán)境，采用 Von Frey 絲自足底下方垂直剌激后爪底皮膚表面，記錄縮足的壓力（g），2 min 時間間隔內測量 4 次，剔除最大值和最小值后獲取的中間值作為痛閾（g）。

1.8 GFP 免疫熒光檢測

取出組織塊立即置入-80℃儲存?zhèn)溆?，或置于恒冷切片機冰凍切片，冷凍溫度設定為-20℃。冰凍切片4～8 μm。4℃丙酮固定10 min。常溫下1%Triton X-100 透膜15 min，水洗5 min，3%雙氧水10 min，5%BSA 封閉1.5 h，然后將封閉液甩干。DAPI 染核，熒光顯微鏡拍照。

1.9 激光共聚焦檢測ED1/CD68 表達

脊髓組織冰凍切片孵育一抗兔源 ED1，稀釋倍數(shù) 1：200，4 ℃過夜。孵育二抗 Cy3 標記山羊抗兔 IgG（H+L），稀釋倍數(shù) 1：500，室溫 2 h，全程避光。DAPI 染核，激光共聚焦拍照。

1.10 ELISA 法檢測IL-6、TNF-α、GDNF 水平

取適量組織塊，于預冷PBS 中清洗去除血液后移入玻璃勻漿器，加入5～10 mL 預冷PBS 進行充分研磨，該過程在冰上進行。將制備好的組織勻漿液于 5 000 r/min 離心5 min，取上清備用檢測。分別采用IL-6、TNF-α、GDNF 的ELISA 試劑盒，嚴格按照試劑盒說明操作，檢測各組小鼠脊髓組織中IL-6、TNF-α、GDNF 水平。

1.11 統(tǒng)計學處理

使用SPSS 22.0 軟件進行統(tǒng)計學分析。符合正態(tài)分布的數(shù)據以±s表示；連續(xù)變量組間比較使用非配對t檢驗，或重復測量方差分析（ANOVA）結合Tukey 多重比較檢驗。

2 結果

2.1 流式細胞術鑒定hUC-MSCs

流式細胞術結果顯示細胞表面標記CD14（APC）為陰性而CD73（PE）為陽性（圖1A），CD19（APC）為陰性而CD105（PE）為陽性（圖1B），CD90（FITC）為陽性（圖1C），CD34（PE）和CD45（FITC）都為陰性（圖1D），據此認定為hUC-MSCs。

2.2 成功構建 GFP 高表達的 hUC-MSCs

結果顯示，感染時間在 48 、72、96 h，3 組細胞均有 GFP 綠色熒光表達（圖1）。說明 GFP 成功感染hUC-MSCs。而對比3 個時間點的細胞熒光強度，可明顯看出，感染 72 h 的細胞綠色 GFP 熒光表達量最高。因此，GFP 慢病毒感染hUC-MSCs細胞的最佳感染時間為 72 h。后續(xù)擴增細胞選用該感染時間。

2.3 小鼠雙后肢運動功能的BBB 評分

各個時間點2 組小鼠的 BBB 評分統(tǒng)計結果顯示，模型組和治療組小鼠隨時間延長，運動功能均逐漸恢復（P＜0.05），其中治療組運動功能恢復速度要顯著快于模型組。治療組在 3、5、7、9 周的 BBB 評分均顯著高于模型組（P＜0.05 或P＜0.01）（圖2）。

2.4 機械觸誘發(fā)痛檢測

各個時間點2 組小鼠的痛閾測定結果統(tǒng)計顯示，小鼠脊髓損傷后痛閾值降低，隨著時間點延長，由于動物機體的自身修復功能，痛閾值逐漸升高（P＜0.05）。對于同一個時間點，hUC-MSCs 治療組的痛閾值都顯著高于模型組（P＜0.01）（圖3），說明hUC-MSCs 對于受損脊髓有一定治療及鎮(zhèn)痛作用。

2.5 GFP 免疫熒光檢測

模型組和治療組脊髓組織的 GFP 熒光表達結果顯示（圖5），模型組脊髓組織無 GFP 熒光表達，而治療組中有 GFP 熒光表達。治療組脊髓組織中 GFP 熒光表達，說明攜帶 GFP 熒光基團的 hUC-MSCs 成功在受損脊髓處成功注入并增殖，從而發(fā)揮促進受損脊髓的神經功能修復 效應。

圖1 流式細胞術鑒定hUC-MSCs 結果Fig 1 Identification of hUC-MSCs by flow cytometry

圖2 hUC-MSCs 48 h（A）、72 h（B）、96 h（C）GFP 表達情況，標尺=50 μm Fig 2 GFP expression in hUC-MSCs at 48 h（A），72 h（B），96 h（C），bar=50 μm

圖3 2 組小鼠各個時間點 BBB 評分Fig 3 BBB scores in two groups of mice at different time points

圖4 2 組小鼠各個時間點痛閾測定結果Fig 4 Results of pain threshold measurement in two groups of mice at each time point

2.6 激光共聚焦檢測ED1/CD68 表達

模型組和治療組脊髓組織的ED1/CD68 熒光共聚焦檢測結果顯示，模型組脊髓組織中ED1/CD68熒光高表達，而與模型組相比，治療組脊髓組織ED1/CD68 熒光表達下降（圖6）。

2.7 ELISA檢測小鼠脊髓組織的 IL-6、TNF-α、GDNF 表達情況

2 組小鼠脊髓組織的 IL-6、TNF-α、GDNF 表達結果顯示（圖 7）。與模型組對比，hUC-MSCs細胞治療組在治療 2 周后，IL-6 、TNF-α 的表達顯著降低，而GDNF 的表達顯著增加（P＜0.01）。

3 討論

hUC-MSCs 移植是否能緩解脊髓損傷神經病理性痛并促進功能恢復的效果尚不明確，推測其機制可能與脊髓損傷后膠質細胞活化及炎癥因子水平的調控有關，并通過治療性旁分泌作用而改善微循環(huán)和微環(huán)境，但仍需要更多的證據[14-15]。本研究在ICR 小鼠模型中使用脊髓半切損傷壓縮模型誘導脊髓損傷，并利用慢病毒載體介導GFP 標記移植到脊髓中，顯示hUC-MSCs 成功在受損脊髓處成功注入并增殖，對于受損脊髓有一定鎮(zhèn)痛與治療作用，并能降低脊髓引起 ED1/CD68 炎性巨噬細胞/小膠質細胞的活化，降低其活化水平，抑制炎癥因子 IL-6 和TNF-α 的分泌，提高 GDNF 的表達水平。

圖5 模型組（A1～C1）和治療組（A2～C2）脊髓組織 GFP 熒光表達情況，標尺=100 μm。A：DAPI 熒光；B：GFP 熒光；C：合并.Fig 5 GFP expression in the spinal cord tissue of model group（A1-C1）and treatment group（A2-C2），bars=100 μm.A：DAPI；B：EDI/CD68；C：Merge.

圖6 模型組（A1～C1）和治療組（A2～C2）脊髓組織ED1/CD68 表達情況，標尺=50 μm。A：DAPI 熒光；B：EDI/CD68 熒光；C：合并.Fig 6 ED1 fluorescence in the spinal cord tissue of model group（A1-C1）and treatment group（A2-C2），bars=50 μm.A：DAPI；B：EDI/CD68；C：Merge.

圖7 2 組小鼠脊髓組織IL-6、TNF-α、GDNF 表達比較Fig 7 Expression of IL-6，TNF-α and GDNF in the spinal cord tissue of two groups

移植后干細胞在體內的命運隨細胞的內在特性和移植位點而變化[16]，故干細胞的最佳來源及其移植途徑是治療脊髓損傷的一個有爭議的問題。本研究應用GFP 成功感染 hUC-MSCs 并采用局部注射移植入小鼠脊髓，顯示攜帶 GFP 熒光基團的 hUCMSCs 成功在受損脊髓處成功注入并增殖，從而發(fā)揮促進受損脊髓的修復與鎮(zhèn)痛功能，其結論提供了干細胞移植可以在損傷部位建立新的神經接觸以減少神經性疼痛的證據。近期，Yousefifard 等[17]利用小鼠脊髓損傷模型證實BM-MSCs 和UC-MSCs移植均減輕了神經性疼痛的癥狀，并導致脊髓損傷后的運動恢復，且UC-MSCs 在存活率和電生理學方面結果更確切，較BM-MSCs 更具優(yōu)勢，而Liu等[18]應用連續(xù)鞘內注入UC-MSCs 外泌體對神經結扎引起的疼痛實現(xiàn)了預防和逆轉作用，可作為神經損傷引起的疼痛的新型治療方法。臨床研究亦顯示使用MSCs 后神經病理性痛強度逐漸改善，支持脊髓鞘內注射自體MSCs 有利于脊髓損傷患者的治療效果的證據[7]。與BM-MSCs 相比，hUC-MSCs 具有更高的擴增能力，更強的增殖能力和更低的細菌/病毒感染風險，且hUC-MSCs 在注射入損傷組織時誘發(fā)免疫反應，當MSCs 用于與其他細胞共培養(yǎng)或用于支架時，可以改善脊髓損傷手術治療效果，更安全有效，并降低當前手術治療引起的發(fā)病 率[8-9]，因而更具臨床推廣應用價值。

本研究結果還證明，損傷脊髓引起 ED1/CD68 炎性巨噬細胞/小膠質細胞的活化，hUCMSCs 移植后降低其活化水平，并下調脊髓組織的 IL-6、TNF-α，但上調GDNF 表達水平，推測其可能通過降低炎癥因子 IL-6 和TNF-α 的分泌，提高 GDNF 的表達水平促進受損脊髓組織的修復，并發(fā)揮鎮(zhèn)痛效應。脊髓損傷后的神經病理性痛推測與神經元保護、炎癥與信號通路及局部微環(huán)境改變有關，盡管依然需更多的證據。在脊髓損傷急性期間，由于血-脊髓屏障破壞，有嚴重的免疫炎性反應，微環(huán)境不適合MSCs 的存活和分化。而脊髓損傷的時間過長，有瘢痕組織形成而不利于軸突的生長。最佳的移植時間是在脊髓損傷后1～2周[19]。在此期間，既可解除炎癥因子對移植細胞的毒性損害，又可避免瘢痕組織對軸突生長的影響。目前細胞移植的途徑主要有經靜脈輸注移植、損傷局部移植。盡管靜脈輸注移植干細胞懸液的方法簡單、易行，風險較小，但是到達損傷局部的細胞數(shù)量不確切。而本研究采用的損傷局部移植可以使干細胞直接地嵌合到脊髓中去，效果確切。實際上，通過腰椎穿刺鞘內使用MSC 對于MSC 治療腦損傷（例如中風或神經退行性疾?。┦怯杏玫暮涂尚械腫15]。Chen 等[20]報道鞘內移植可明顯改善了脊髓神經結扎誘導的機械性異常性疼痛和熱痛覺過敏，其機制與神經炎癥的抑制過程有關，包括抑制活化的星形膠質細胞和小膠質細胞，以及顯著減少炎性細胞因子IL-1β 和白細胞介素-17A 以及抗炎細胞因子白細胞介素-10 的上調。而GDNF 是一種已鑒定的神經生長和存活因子，抑制miR-383 可增加人骨髓來源的MSCs 通過增加GDNF 蛋白水平，強化脊髓損傷中的治療潛 力[21]。同時，脊髓損傷小鼠與小鼠中hUC-MSCs的移植可通過促進M2 巨噬細胞的極化而增強抗炎、抗星形膠質細胞增生、抗細胞凋亡和軸突保留作用，在脊髓損傷后的功能恢復方面產生有益效果，促進受損部位的修復并改善運動功能[22-23]。因此，盡管hUC-MSCs 在減少神經性疼痛的有效性尚未完全了解，但通過對神經膠質細胞、促炎和抗炎細胞因子的作用，靶向鞘內hUC-MSCs 注射可以為神經病理性痛提供新的治療策略。