葉子明， 劉瑩， 秦超△

廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 1神經(jīng)內(nèi)科， 2康復(fù)醫(yī)學(xué)科(廣西南寧 530021)

最新研究表明，腦卒中是我國(guó)居民致死、致殘的首位原因，具有高發(fā)病率、高致殘率、高病死率、高復(fù)發(fā)率、高經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)五大特點(diǎn)[1-2]。全球≥25歲人群的卒中終生發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)約為25%，而我國(guó)的腦卒中終生發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)居世界第1位(39.3%)，其中以動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)為基礎(chǔ)的超過(guò)70%，我國(guó)腦血管病防治面臨巨大挑戰(zhàn)[3-4]。不穩(wěn)定AS易損性斑塊的破裂及其所致的動(dòng)脈-動(dòng)脈栓塞是急性缺血性卒中事件發(fā)生的最主要機(jī)制[5]。壞死核心不斷擴(kuò)大是斑塊不穩(wěn)定性的重要原因，研究發(fā)現(xiàn)，有缺陷的胞葬作用，是斑塊進(jìn)展的關(guān)鍵因素，即斑塊內(nèi)壞死核心擴(kuò)大不是因?yàn)樗劳黾?xì)胞過(guò)多，而是死亡細(xì)胞清除太少[6]。AS斑塊中的胞葬效率只相當(dāng)于身體其他部位的1/20[6]。本研究就胞葬、胞葬逃逸在AS斑塊的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程的作用進(jìn)行綜述。

1 何為胞葬、胞葬逃逸？

衰老、凋亡細(xì)胞的識(shí)別和清除是人體重要的生理功能之一。健康的人體每天可清除數(shù)十億個(gè)衰老、凋亡細(xì)胞，機(jī)體在清除過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生新的細(xì)胞以替代衰老、凋亡的細(xì)胞，以維持機(jī)體組織器官的穩(wěn)態(tài)[7]。該過(guò)程是進(jìn)化保守的細(xì)胞清除機(jī)制，被稱(chēng)為程序性細(xì)胞清除(programmed cell removal，PrCR)或胞葬作用(efferocytosis)。在生物學(xué)上指吞噬細(xì)胞將衰老、受損或死亡的細(xì)胞吞噬、降解，防止繼發(fā)壞死、炎癥[8]。在AS斑塊中，細(xì)胞死亡一直存在于AS的整個(gè)過(guò)程，引起死亡細(xì)胞、壞死碎片的積聚，從而形成促進(jìn)AS斑塊進(jìn)展、不穩(wěn)定[9]。當(dāng)斑塊內(nèi)被清除的凋亡細(xì)胞少于死亡細(xì)胞時(shí)，斑塊進(jìn)展、脂質(zhì)核心擴(kuò)大、不穩(wěn)定。因此，促進(jìn)斑塊內(nèi)凋亡細(xì)胞的清除，是抗AS的一個(gè)重要思路。

胞葬作用可分為幾個(gè)不同的階段[10]：(1)通過(guò)“找到我”(find-me)信號(hào)感知凋亡細(xì)胞。(2)識(shí)別階段。通過(guò)“吃我”(eat-me)信號(hào)[如磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine，PtdSer)]及其橋接受體或調(diào)理素受體(如Mer酪氨酸蛋白激酶受體)以識(shí)別凋亡細(xì)胞。另外，它們之間可通過(guò)“別吃我”(don′t eat-me)信號(hào)相互作用，這些是活細(xì)胞抵抗被吞噬的信號(hào)，如整合素相關(guān)蛋白(integrin-associated protein，IAP)或CD47(cluster of differentiation 47)等。(3)吞噬階段。包括調(diào)節(jié)吞噬的細(xì)胞骨架重排的分子和信號(hào)途徑，如toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)、脂多糖受體(CD14)及鈣(Ca2+)信號(hào)等。(4)消化和降解。包括分泌抗炎細(xì)胞因子(如白細(xì)胞介素-10)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growth factor-beta，TGF-β)等進(jìn)行清理凋亡細(xì)胞。

根據(jù)上述參與胞葬作用的過(guò)程，很顯然，該過(guò)程必須完全協(xié)調(diào)，才能成功鑒別凋亡細(xì)胞和正常功能的健康細(xì)胞，并對(duì)凋亡細(xì)胞進(jìn)行清除。上述步驟中只要一個(gè)步驟有缺陷就會(huì)導(dǎo)致斑塊內(nèi)死亡細(xì)胞聚集，斑塊壞死核心不斷擴(kuò)大、進(jìn)展，我們形象地稱(chēng)之為“胞葬逃逸”(efferocytosis escape)。總之，特定的“吃我”和“別吃我”分子之間的平衡決定了細(xì)胞命運(yùn)。此外，我們不能忽視影響凋亡細(xì)胞配體識(shí)別和連接作用的分子，如MerTK的可溶性形式等。

2 AS中的“找到我”信號(hào)與胞葬逃逸

在AS斑塊中，凋亡細(xì)胞的有效清除需要各種“找到我”信號(hào)的釋放，從而導(dǎo)致吞噬細(xì)胞對(duì)斑塊內(nèi)凋亡細(xì)胞具有趨化作用?；瘜W(xué)介質(zhì)與“找到我”配體一起將吞噬細(xì)胞吸引到細(xì)胞死亡的區(qū)域。這些配體的主要類(lèi)型包括血小板反應(yīng)蛋白-1(thrombospondin-1，TSP-1)、溶血磷脂酰膽堿(lysophosphatidylcholine，LPC)、核苷酸ATP和UTP、趨化因子CX3C配體-1(chemokine CX3 Cligand 1，CX3CL1)、裂解人酪氨酸-tRNA合成酶、溶血磷脂酰膽堿和鞘氨醇-1-磷(sphingosine-1-phosphate，S1P)等[11]。由于吞噬細(xì)胞可以通過(guò)這些信號(hào)識(shí)別凋亡細(xì)胞，對(duì)AS斑塊的發(fā)展具有重要作用。由caspase-3激活的LPC信號(hào)是凋亡細(xì)胞發(fā)出的第一個(gè)“找到我”信號(hào)，LPC信號(hào)的缺失導(dǎo)致凋亡細(xì)胞清除的障礙，即胞葬逃逸，會(huì)導(dǎo)致慢性炎癥和自身免疫性疾病的發(fā)生[12]。因此，“找到我”信號(hào)對(duì)凋亡細(xì)胞的胞葬作用和識(shí)別是必不可少的。

警報(bào)素(alarmins)，也被稱(chēng)為內(nèi)源性危險(xiǎn)信號(hào)或損傷相關(guān)分子(DAMPs)，是免疫系統(tǒng)對(duì)組織損傷反應(yīng)的關(guān)鍵參與者。在許多炎癥和自身免疫性疾病中，警報(bào)素被釋放到細(xì)胞外環(huán)境，并與特定受體結(jié)合，刺激和促進(jìn)先天免疫細(xì)胞的活化、細(xì)胞分化等[13]。警報(bào)素在穩(wěn)態(tài)條件下存在于不同的亞細(xì)胞部位，如細(xì)胞質(zhì)[如galectin-3(Gal-3)、熱休克蛋白(HSPs)、高遷移率族蛋白1(HMGB1)、膜聯(lián)蛋白、S100P]，細(xì)胞基質(zhì)(如Gal-3、透明質(zhì)酸、纖連蛋白)和細(xì)胞核(如核仁蛋白、HMGB1、Gal-3)[14-15]。內(nèi)源性或外源性警報(bào)素可以增加胞葬作用，減少胞葬逃逸，從而延緩AS的進(jìn)展[16]。因此，在AS斑塊的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中，如何促進(jìn)凋亡細(xì)胞“找到我”信號(hào)和警報(bào)素的表達(dá)，值得深入研究。

3 AS中的“吃我”信號(hào)與胞葬逃逸

凋亡細(xì)胞表面的“吃我”信號(hào)配體與吞噬細(xì)胞的吞噬受體相互作用并活化它們，導(dǎo)致胞葬作用的啟動(dòng)[17]。盡管“找到我”信號(hào)可以使吞噬細(xì)胞接近凋亡細(xì)胞，但相鄰細(xì)胞中凋亡細(xì)胞的特異性識(shí)別取決于ACs暴露的“吃我”信號(hào)，通過(guò)吞噬作用選擇性清除凋亡、受損細(xì)胞?！俺晕摇毙盘?hào)是識(shí)別凋亡細(xì)胞，并通過(guò)吞噬細(xì)胞啟動(dòng)吞噬作用的關(guān)鍵因素?！俺晕摇毙盘?hào)表達(dá)的任何缺陷都導(dǎo)致胞葬逃逸，并與AS進(jìn)展密切相關(guān)[18]?！俺晕摇毙盘?hào)是胞葬作用中最關(guān)鍵的分子，這些信號(hào)的損傷對(duì)細(xì)胞吞噬作用有重要影響，可以導(dǎo)致AS進(jìn)展。因此，針對(duì)“吃我”信號(hào)的靶向治療，比靶向胞葬其他相關(guān)分子的治療更有效。

與“吃我”信號(hào)有關(guān)的一個(gè)關(guān)鍵分子是TAM受體(Tyro3、Axl和Mer),屬于受體酪氨酸激酶家族，并且在細(xì)胞增殖、存活、黏附、遷移、凝血和炎癥中具有重要作用。TAM受體在橋接分子生長(zhǎng)停滯特異性基因6(growth arrest-specific gene 6 product，Gas6)、蛋白S等在作用下，可被維生素K依賴(lài)性蛋白激活[19]。Gas6和蛋白S通過(guò)重組凋亡細(xì)胞上的PtdSer和吞噬細(xì)胞上的MerTK促進(jìn)凋亡細(xì)胞的清除[20]。此外，與“吃我”信號(hào)相關(guān)，影響巨噬細(xì)胞吞噬能力的關(guān)鍵因素是橋接分子，如C1q補(bǔ)體(作為調(diào)理分子)、吞噬細(xì)胞受體、TG2和其他“吃我”配體等[21]。C1q增加巨噬細(xì)胞的吞噬和泡沫細(xì)胞的胞葬作用。C1q促進(jìn)巨噬細(xì)胞在過(guò)量攝取膽固醇期間的存活并改善巨噬泡沫細(xì)胞的功能。因此，C1q可能是延緩疾病進(jìn)展的重要因素，并且可能在早期AS期間具有保護(hù)作用[22]。作為絲裂原活化蛋白激酶家族及G蛋白偶聯(lián)受體成員的細(xì)胞周期信號(hào)調(diào)節(jié)激酶5(extracellular-signal-regulated kinase 5，ERK5)可以調(diào)節(jié)與胞葬作用相關(guān)的分子，并且是參與胞葬作用分子的主要調(diào)節(jié)分子。巨噬細(xì)胞特異性ERK5缺失的小鼠，表現(xiàn)為參與胞葬作用的橋接分子和巨噬細(xì)胞受體的表達(dá)減少，結(jié)果增加了AS病變的斑塊、壞死核心的大小及不穩(wěn)定[23]。因此，與“吃我”信號(hào)相關(guān)的橋接分子表達(dá)異常，同樣導(dǎo)致胞葬逃逸，在AS斑塊的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起重要作用。

4 AS中的“別吃我”信號(hào)與胞葬逃逸

胞葬過(guò)程如何鑒別凋亡細(xì)胞與正?；罴?xì)胞？凋亡細(xì)胞表面表達(dá)一組配體，有時(shí)稱(chēng)為凋亡細(xì)胞相關(guān)分子(apoptotic-cell-associated molecular patterns，ACAMP)，以確保其快速被攝取和清除。凋亡細(xì)胞表面上的“找到我”信號(hào)如ACAMP、鈣網(wǎng)蛋白(calreticulin，Calr)、PtdSer等，其通常局限于細(xì)胞內(nèi)膜并在細(xì)胞凋亡期間外化。與“吃我”信號(hào)相對(duì)應(yīng)，活細(xì)胞通過(guò)表面“別吃我”信號(hào)抑制吞噬細(xì)胞的吞噬作用[24]。CD61、CD31、CD46和CD47的高表達(dá)保護(hù)健康細(xì)胞免于被吞噬[25]。CD47作為“自身”的標(biāo)記，即作為“別吃我”的信號(hào)，與另一種細(xì)胞表面糖蛋白α(regulatory protein α，SIRPα)結(jié)合，使其胞葬逃逸得以實(shí)現(xiàn)，SIRPα是吞噬細(xì)胞表面上的吞噬作用抑制性的受體。正常生理情況下，CD47在細(xì)胞凋亡過(guò)程中通過(guò)細(xì)胞應(yīng)激迅速降低，導(dǎo)致正常組織中凋亡細(xì)胞的胞葬作用增強(qiáng)增多。然而在AS斑塊中，凋亡細(xì)胞的CD47表達(dá)沒(méi)有降低，因此導(dǎo)致凋亡細(xì)胞胞葬逃逸[24]。在AS的小鼠模型中，抗CD47分子抗體的使用可有抗AS作用，可阻止斑塊發(fā)展，防止斑塊破裂和減小斑塊壞死核心的面積[24]。但抗CD47抗體治療AS導(dǎo)致脾臟腫大、紅細(xì)胞被異常吞噬和代償性網(wǎng)狀紅細(xì)胞增多等不良反應(yīng)，目前還不能在臨床應(yīng)用。我們課題組研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)鏈非編碼RNA MIAT通過(guò)miR-149-5p上調(diào)CD47導(dǎo)致凋亡細(xì)胞胞葬逃逸，從而導(dǎo)致AS斑塊不穩(wěn)定[26]。為靶向下調(diào)斑塊內(nèi)凋亡細(xì)胞CD47的表達(dá)，從而穩(wěn)定斑塊、延緩斑塊進(jìn)展提供了新的思路和靶點(diǎn)。

導(dǎo)致胞葬逃逸的最重要的基因是9p21基因，而且已發(fā)現(xiàn)該基因的突變與AS有關(guān)[27]。這種遺傳風(fēng)險(xiǎn)與傳統(tǒng)的ACVD風(fēng)險(xiǎn)因素如高血壓、高脂血癥、糖尿病和吸煙等不同，這些傳統(tǒng)因素也與胞葬逃逸有關(guān)[27]。缺乏Cdkn2b基因也被證實(shí)促進(jìn)AS斑塊的發(fā)展，并使斑塊更大，更加不穩(wěn)定[20]。通過(guò)易感基因研究，使臨床醫(yī)師可以從遺傳學(xué)角度篩查AS高危人群，早期預(yù)防疾病發(fā)生，針對(duì)不同患者的個(gè)體化治療。

5 AS中Mer酪氨酸激酶(MerTK)與胞葬逃逸

MerTK表達(dá)在吞噬細(xì)胞的表面，并在Gas-6作為橋連分子的幫助下介導(dǎo)凋亡細(xì)胞的吞噬。在人類(lèi)AS斑塊中，MerTK位于巨噬細(xì)胞表面，但不存平滑肌細(xì)胞表面。MerTK缺乏導(dǎo)致AS斑塊中的胞葬逃逸，壞死核心增大[28]。在MerTK-/-/LDLR-/-動(dòng)物中抑制MerTK引起壞死核心的進(jìn)展，凋亡細(xì)胞的累積和更多的炎性細(xì)胞因子[29]。研究表明在MerTK-/-ApoE-/-小鼠中凋亡細(xì)胞的數(shù)目和壞死斑塊的面積增加，而Ldlr-/-/MerTk-/-小鼠斑塊中胞葬作用減少[30-31]。因此，在AS斑塊的進(jìn)展過(guò)程中，促進(jìn)巨噬細(xì)胞MerTK的表達(dá)，有助于穩(wěn)定斑塊。

6 AS中可溶性受體與胞葬逃逸

可溶性“吃我”配體，例如Mer和CD36，在胞葬作用和斑塊形成中起重要作用。金屬蛋白酶17(metalloproteinase 17，ADAM17)引起MerTK可溶性形式的釋放[32]。在ADAM17敲除的小鼠中，ADAM17產(chǎn)生的可溶性形式的CD36，導(dǎo)致胞葬逃逸。吞噬受體的脫落不僅與凋亡細(xì)胞的吞噬作用減少有關(guān)，而且還作為競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑起作用，其可阻礙相鄰細(xì)胞中潛在的胞葬作用，導(dǎo)致胞葬逃逸。Thbs-1充當(dāng)橋接分子(調(diào)理素)以連接凋亡細(xì)胞表面上的PtdSer和吞噬細(xì)胞上的CD36，導(dǎo)致胞葬作用的增加。此外，AnxA5以高親和力與PtdSer結(jié)合，并通過(guò)PtdSer的解離來(lái)抑制凋亡細(xì)胞的胞葬作用。因此，ADAM17的拮抗劑可以減少M(fèi)er和CD36的抑制性影響，導(dǎo)致ACVD中胞葬作用增加。此外，研究表明，缺氧抑制胞葬作用的CD36受體和MerTK的表達(dá)，導(dǎo)致胞葬逃逸，促進(jìn)AS的進(jìn)展[33]。因此，改善斑塊的缺氧狀況可以促進(jìn)胞葬作用并減緩AS的進(jìn)展。

7 AS中乳脂肪球-表皮生長(zhǎng)因子8與胞葬逃逸

乳脂肪球-表皮生長(zhǎng)因子8(milk fat globule-epidermal growth factor 8，MFG-E8)是一種抗炎因子，它的血清濃度與2型糖尿病、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病患者的并發(fā)癥呈負(fù)相關(guān)[34]。在富集凋亡細(xì)胞的早期AS斑塊中，人血管組織中的MFG-E8表達(dá)水平降低。MFG-E8是一種重要的橋接分子，它與吞噬細(xì)胞表面的整聯(lián)蛋白分子如整合素β3結(jié)合，充當(dāng)黏附和轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，并參與一些重要的功能，如錨定、遷移、存活、增殖、細(xì)胞生長(zhǎng)和分化，以及巨噬細(xì)胞重編程。研究指出，MFG-E8的血清水平與冠狀動(dòng)脈狹窄的嚴(yán)重程度和臨床事件的風(fēng)險(xiǎn)呈負(fù)相關(guān)[35]。因此，巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的MFG-E8對(duì)于改善胞葬作用和預(yù)防炎癥是必要的。MFG-E8促進(jìn)胞葬作用可能與參與膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶2(transglutaminase 2，TG2)直接相關(guān)。這種機(jī)制可能歸因于ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白A1(ATP-binding cassette transporter A1，ABCA1)表達(dá)的增加和TG2引起的ABCA1介導(dǎo)的膽固醇的逆向轉(zhuǎn)運(yùn)，其增強(qiáng)ABCA1介導(dǎo)的凋亡細(xì)胞的攝取和隨后體外胞葬作用的增加[17]。因此，在AS斑塊的進(jìn)展過(guò)程中，促進(jìn)巨噬細(xì)胞MFG-E8的表達(dá)，可促進(jìn)斑塊內(nèi)凋亡細(xì)胞的清除，減小壞死核心。

8 展望

胞葬作用在動(dòng)脈粥樣硬化性疾病中具有巨大的應(yīng)用前景。眾多的信號(hào)分子參與了胞葬作用，包括“發(fā)現(xiàn)我”、“吃我”和“不吃我”信號(hào)、橋接分子、可溶性受體、調(diào)節(jié)因子等。“不吃我”和“吃我”信號(hào)之間的平衡，決定了發(fā)出這些信號(hào)的細(xì)胞的命運(yùn)，也決定了胞葬作用的效率。人體利用這些信號(hào)來(lái)確定哪些細(xì)胞需要清除，哪些細(xì)胞不需要清除。除了“吃我”、“不吃我”信號(hào)分子外，橋接分子在調(diào)節(jié)胞葬過(guò)程中也起著重要作用。不同的機(jī)制可以降低細(xì)胞的胞葬能力，導(dǎo)致胞葬逃逸，包括直接損失(比如吞噬細(xì)胞自身的凋亡)、吞噬能力較低的吞噬細(xì)胞增多(包括M1巨噬細(xì)胞、SMCs和泡沫細(xì)胞)、AS斑塊內(nèi)的壞死核心周?chē)墒霥C增加。胞葬逃逸導(dǎo)致AS進(jìn)展，特別是在基因易感人群中，如攜帶9p21基因變異的人群。

總之，本綜述討論了在AS斑塊形成過(guò)程中清除凋亡細(xì)胞的重要性。胞葬作用的過(guò)程非常復(fù)雜，涉及的各種因素、信號(hào)途徑，在設(shè)計(jì)新的治療方法以降低AS、避免其臨床并發(fā)癥時(shí)，這些都是需要考慮的靶點(diǎn)和因素。