郝福 寧毅 孫睿 鄭曉旭

1.山西醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院·口腔醫(yī)院 太原 030001；

2.山西省人民醫(yī)院口腔頜面外科 太原 030012；

3.馬里蘭大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腎內(nèi)科 巴爾的摩 21201

鱗狀細(xì)胞癌（squamous cell carcinoma，SCC）是頭頸部常見(jiàn)的惡性腫瘤，約占口腔和口咽部惡性腫瘤的90%，其中口腔鱗狀細(xì)胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）約占口腔頜面部惡性腫瘤的80%[1]。唇、口腔癌的發(fā)生率和死亡率分別為全球癌癥總數(shù)的2.0%和1.9%，它們?cè)谀蟻喓吞窖髰u嶼等地區(qū)具有較高的發(fā)生率，同時(shí)它們也是導(dǎo)致印度和斯里蘭卡男性癌癥患者死亡的主要原因[2]。不同國(guó)家OSCC的發(fā)病率不同，但在發(fā)展中國(guó)家更為常見(jiàn)[3]。近年來(lái)OSCC在診斷和治療方面均取得了很大的進(jìn)步，但患者的5年生存率仍未見(jiàn)明顯提高[4]。如何提高OSCC患者的預(yù)后是臨床治療的熱點(diǎn)和難點(diǎn)，因此，探索更多與OSCC相關(guān)的分子靶點(diǎn)對(duì)于OSCC的診治具有重要的臨床意義。

轉(zhuǎn)化因子2β（Transformer 2β，Tra2β）蛋白是一種富含絲氨酸/精氨酸的RNA結(jié)合蛋白，它不僅可參與前體信使RNA（messenger RNA，mRNA）的選擇性剪接，還可通過(guò)與微小RNA（micro-RNA，miRNA）相互作用來(lái)調(diào)控靶蛋白的表達(dá)水平[5-6]。Tra2β蛋白不僅是維持正常生理機(jī)能不可或缺的因素，而且與神經(jīng)前體細(xì)胞凋亡、中風(fēng)以及腫瘤形成等密切相關(guān)[7-8]。Tra2β基因敲除實(shí)驗(yàn)表明，Tra2β蛋白對(duì)于小鼠胚胎和大腦的正常發(fā)育至關(guān)重要[9]。Tra2β蛋白的編碼基因Tra2b在人體中的表達(dá)具有組織特異性，并且它在乳腺癌、肺癌、宮頸癌等多種癌癥中明顯擴(kuò)增，而Tra2β蛋白表達(dá)上調(diào)已在多種癌癥中被證實(shí)，并可能通過(guò)調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移和衰老等過(guò)程來(lái)參與腫瘤的形成[10-15]。一些RNA序列已被證實(shí)為Tra2β蛋白的作用靶點(diǎn)[16]，此外，基于剪接體的抗癌藥物已步入臨床研發(fā)階段，并且作用于Tra2β蛋白的小分子抑制劑也已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)，這可能為癌癥的治療提供了一個(gè)新的研究思路[17-18]。

1 材料和方法

1.1 一般資料

研究對(duì)象為山西省人民醫(yī)院口腔頜面外科接受根治性手術(shù)治療的原發(fā)性O(shè)SCC患者。

納入標(biāo)準(zhǔn)：首次治療的病例；組織病理學(xué)確診的病例；有完整醫(yī)療記錄的病例；患者知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)后復(fù)發(fā)和術(shù)前接受過(guò)放化療或其他抗癌治療的病例。標(biāo)本：2011—2013年64例原發(fā)性O(shè)SCC患者的石蠟標(biāo)本和2017—2019年22例原發(fā)性O(shè)SCC患者的組織標(biāo)本，其中22例OSCC組織標(biāo)本取材部位為：牙齦SCC（9例）；舌SCC（5例）；腭SCC（1例）；頰SCC（6例），口底SCC（1例）。

本研究經(jīng)山西省人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（2019省醫(yī)論倫審字5號(hào)）并獲得患者書面知情同意。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 免疫組化 染色方法：采用免疫組化Envision二步法。試劑采用兔超敏二步法檢測(cè)試劑盒（北京中杉金橋公司，中國(guó)）。制備約2 μm厚的石蠟切片，60 ℃干燥箱烤片2 h。二甲苯浸泡30 min、3次，乙醇梯度水化，每次5 min。3%過(guò)氧化氫溶液孵育20 min，磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）洗5 min、3次。高壓加熱法修復(fù)抗原，PBS洗5 min、3次。孵育一抗：ab66901+Tra2β（Abcam公司，美國(guó)）1：300稀釋，4 ℃過(guò)夜。PBS洗5 min、3次，加二抗：滴加試劑盒中試劑1（Ploymer Helper），37 ℃水浴箱孵育30 min，PBS洗5 min、3次。滴加試劑2（ploy-HRP anti-Rabbit IgG），37 ℃水浴箱孵育20 min，PBS洗5 min、3次。3’3-二氨基聯(lián)苯胺（diaminobezidin，DAB）顯色約1 min。蘇木素復(fù)染約30 s。無(wú)水乙醇梯度脫水，封片觀察。陰性對(duì)照：用PBS替代Tra2β。

結(jié)果分析：2名病理科醫(yī)生在雙盲下對(duì)每張染色切片打分及評(píng)價(jià)。DAB顯色結(jié)果呈棕黃色即可判為陽(yáng)性。每例至少評(píng)價(jià)1 000個(gè)細(xì)胞，計(jì)數(shù)5個(gè)高倍視野。按細(xì)胞著色強(qiáng)度和著色密度分別進(jìn)行評(píng)分。著色強(qiáng)度評(píng)分：無(wú)著色計(jì)0分，輕度著色（淺黃色）計(jì)1分，中度著色（棕黃色）計(jì)2分，強(qiáng)著色（棕褐色）計(jì)3分。著色密度評(píng)分：陽(yáng)性細(xì)胞百分率≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，≥51%為3分。將2項(xiàng)結(jié)果相乘得總評(píng)分，總評(píng)分范圍：0～1分為陰性（-），2～3分為弱陽(yáng)性（+），4～6分為中陽(yáng)性（++），6分以上為強(qiáng)陽(yáng)性（+++）。

1.2.2 Western blot實(shí)驗(yàn) 充分研磨組織標(biāo)本并在蛋白裂解液（武漢博士德公司，中國(guó)）和苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）（北京索萊寶公司，中國(guó)）中充分裂解，冰上靜置20 min。4℃，12 000g離心20 min，收集上清液。聚氰基丙烯酸正丁酯（butyleyanoacrylate，BCA）試劑盒（武漢博士德公司，中國(guó)）測(cè)定蛋白濃度。分離膠濃度選擇10%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）（武漢博士德公司，中國(guó)）。一抗Tra2β蛋白：ab171092+Tra2β（Abcam公司，美國(guó)），濃度為1：2 500；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）：Ab181602+GAPDH（Abcam公司，美國(guó)），濃度為1：8 000，4 ℃冰箱中過(guò)夜，它們的二抗為：Goat anti-Rabbit IgG（武漢博士德公司，中國(guó)）且濃度均為1：8 000。伯樂(lè)成像儀成像，image J軟件行灰度分析。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈反應(yīng)（real-time polymerase chain reaction，RT-PCR） RNA提取試劑盒（北京Takara公司，中國(guó)）提取總RNA，紫外線分光光度計(jì)測(cè)定總RNA濃度。反轉(zhuǎn)錄試劑盒（北京Takara公司，中國(guó)）按總RNA為1 μg反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系20 μL。SYBR Green擴(kuò)增試劑盒（北京Takara公司，中國(guó)）進(jìn)行擴(kuò)增，GAPDH為內(nèi)參基因，反應(yīng)體系25 μL：TB Green Premix Taq Ⅱ12.5 μL，上下游引物各1 μL，DNA模板1.5 μL，滅菌水9 μL，引物序列和產(chǎn)物長(zhǎng)度見(jiàn)表1。Tra2β mRNA的相對(duì)表達(dá)量用2-ΔΔCT計(jì)算，癌旁組織中的相對(duì)表達(dá)量認(rèn)為是1倍。

表1 RT-PCR引物序列及產(chǎn)物長(zhǎng)度Tab 1 Sequence of RT-PCR primers and length of products

1.2.4 細(xì)胞培養(yǎng) 將37 ℃恒溫水浴鍋中快速解凍的Hela細(xì)胞懸液加入15 mL離心管，加入10倍體積的培養(yǎng)液，混勻。1 000 r·min-1離心5 min，棄上清液，加入新的培養(yǎng)液重懸細(xì)胞。細(xì)胞計(jì)數(shù)，將重懸的細(xì)胞加入培養(yǎng)瓶中，37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2 d更換1次培養(yǎng)液，待細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)80%左右即可進(jìn)行細(xì)胞傳代和蛋白提取。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

SPSS 16.0軟件分析數(shù)據(jù)：計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。Tra2β蛋白的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系采用Spearman秩相關(guān)檢驗(yàn)或者χ2檢驗(yàn)。Western blot和RT-PCR分析采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。預(yù)后采用Log-rank檢驗(yàn)并做出Kaplan-Meier生存曲線。多因素生存分析用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型統(tǒng)計(jì)。P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 OSCC中Tra2β蛋白的表達(dá)及其與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

筆者利用免疫組化探索Tra2β蛋白在OSCC中的表達(dá)情況并研究Tra2β蛋白表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系。結(jié)果表明，OSCC中Tra2β蛋白有表達(dá)并且主要定位于細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)，DAB染色核呈棕黃色即為陽(yáng)性細(xì)胞（圖1A為陰性對(duì)照，圖1B～D依次為弱陽(yáng)性、中陽(yáng)性和強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)）。此外，Tra2β蛋白陽(yáng)性表達(dá)與腫瘤的分化程度（P＜0.001）和臨床分期（P=0.046）有關(guān)，而與患者的年齡、性別、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和病變部位無(wú)顯著的相關(guān)性（詳見(jiàn)表2）。

2.2 OSCC腫瘤和癌旁組織中Tra2β蛋白的表達(dá)情況

免疫組化結(jié)果表明，Tra2β蛋白在OSCC中有表達(dá)，為進(jìn)一步驗(yàn)證Tra2β蛋白與OSCC發(fā)生發(fā)展有關(guān)，筆者利用Western blot實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證Tra2β蛋白在OSCC腫瘤和癌旁組織中的差異性表達(dá)。如圖2A可見(jiàn)，Tra2β蛋白在腫瘤組織中的表達(dá)高于癌旁組織。已知Tra2β蛋白在Hela細(xì)胞中有表達(dá)，筆者通過(guò)檢測(cè)Hela細(xì)胞中Tra2β蛋白的表達(dá)來(lái)驗(yàn)證所用抗體的有效性[19]，如圖2B可見(jiàn)，Tra2β蛋白在Hela細(xì)胞中表達(dá)。

Tra2β蛋白在22例OSCC腫瘤中的相對(duì)表達(dá)量（0.613±0.080）高于在癌旁組織的相對(duì)表達(dá)量（0.072±0.011），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）（圖2C）。GAPDH為內(nèi)參蛋白。

2.3 OSCC腫瘤和癌旁組織中Tra2β mRNA的表達(dá)情況

RNA結(jié)合蛋白和miRNA是轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因表達(dá)的2類重要因子。Tra2β蛋白不僅可參與前體mRNA的選擇性剪接，還可以通過(guò)與miRNA相互作用來(lái)調(diào)控靶基因的表達(dá)[5-6]。Bcl2 mRNA中與Tra2β蛋白的結(jié)合位點(diǎn)和與miR-204的結(jié)合位點(diǎn)部分重疊，因此，它們可能通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)與Bcl2α mRNA 3’非編碼區(qū)的結(jié)合來(lái)調(diào)節(jié)Bcl2α mRNA的穩(wěn)定性，從而調(diào)控Bcl2的表達(dá)[20]。

圖1 Tra2β蛋白在OSCC中表達(dá)的免疫組化染色Fig 1 Immunohistochemical staining of Tra2β protein expression in OSCC

表2 Tra2β蛋白表達(dá)與64例OSCC臨床病理參數(shù)的關(guān)系Tab 2 Relationship between the expression of Tra2β protein and clinical pathological data of 64 OSCC

圖2 Tra2β蛋白在OSCC腫瘤和癌旁組織中的表達(dá)Fig 2 The expression of Tra2β protein in tumor and paracancerous tissues in OSCC

利用miRNA數(shù)據(jù)庫(kù)TargetScan Human Release 7.1和miRPathDB v1.1預(yù)測(cè)miR-204的靶基因時(shí)發(fā)現(xiàn)，Tra2b可能為miR-204-3p的靶基因[21]。有文獻(xiàn)[22]報(bào)道，miR-204在OSCC中表達(dá)下調(diào)。為進(jìn)一步預(yù)測(cè)miR-204和Tra2β mRNA之間是否具有相關(guān)性，筆者利用RT-PCR驗(yàn)證OSCC腫瘤和癌旁組織中Tra2β mRNA的差異性表達(dá)情況，以期初步證明miR-204和Tra2β mRNA間的負(fù)相關(guān)性。結(jié)果表明，22例OSCC腫瘤中Tra2β mRNA的相對(duì)表達(dá)量（1.586±0.298）高于癌旁組織的相對(duì)表達(dá)量（P＜0.001，圖3）。GAPDH為內(nèi)參基因，Tra2β mRNA在癌旁組織中的相對(duì)表達(dá)量為1倍。

圖3 Tra2β mRNA在22例OSCC腫瘤和癌旁組織中的相對(duì)表達(dá)量Fig 3 The relative expression of Tra2β mRNA in tumors and paracancerous tissues of 22 OSCC

2.4 Tra2β蛋白陽(yáng)性表達(dá)對(duì)OSCC患者生存率及預(yù)后的影響

Kaplan-Meier分析結(jié)果表明，Tra2β蛋白高表達(dá)組OSCC患者的生存率低于低表達(dá)組，經(jīng)Logrank檢驗(yàn)，χ2=9.472，P=0.002，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖4）。Cox多因素和單因素分析結(jié)果一致，均表明Tra2β蛋白可作為評(píng)估OSCC患者預(yù)后的評(píng)估指標(biāo)（P=0.006）。

圖4 Tra2β蛋白表達(dá)對(duì)OSCC患者生存率的影響Fig 4 Effect of Tra2β protein expression on survival rate of OSCC patients

3 討論

OSCC是一種受多因素影響的疾病，其與表觀遺傳修飾、非編碼RNA等多種因素有關(guān)[23-24]。與絕大多數(shù)實(shí)體腫瘤一樣，早期診斷和治療是提高OSCC患者預(yù)后的關(guān)鍵因素之一，因此，探索更多與OSCC發(fā)生發(fā)展相關(guān)的分子靶點(diǎn)就顯得尤為重要。Tra2β蛋白作為一種選擇性剪接因子，可以通過(guò)參與前體mRNA的選擇性剪接來(lái)調(diào)控靶基因的表達(dá)，此外，其異常表達(dá)已在多種癌癥中被證實(shí)并可能與細(xì)胞增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移和衰老等過(guò)程密切相關(guān)[10-15]。此外，蛋白質(zhì)作為一種潛在的生物標(biāo)志物較DNA和RNA更具有吸引力[25]。目前已知Tra2β蛋白的編碼基因Tra2b在多種腫瘤中明顯擴(kuò)增[10]，目前尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道Tra2β在OSCC中的表達(dá)及其潛在的臨床意義。本實(shí)驗(yàn)表明，Tra2β蛋白在OSCC中有表達(dá)，并且它在腫瘤中的表達(dá)高于癌旁組織，此外，Tra2β蛋白陽(yáng)性表達(dá)不僅與OSCC的分化程度和臨床分期有關(guān)，而且與患者的預(yù)后相關(guān)，這提示Tra2β蛋白可能在OSCC的發(fā)生發(fā)展及對(duì)預(yù)后的判斷方面有著重要的作用，但其具體的作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步探索和研究。

RNA結(jié)合蛋白和miRNA是調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)的重要因子，它們不僅可協(xié)同影響mRNA的穩(wěn)定性和翻譯，而且可以通過(guò)相互競(jìng)爭(zhēng)與miRNA的結(jié)合來(lái)調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)[26]。Tra2β蛋白可以通過(guò)與miR-204競(jìng)爭(zhēng)和Bcl2 mRNA 3’非編碼區(qū)（untranslated regions，UTR）的結(jié)合來(lái)調(diào)控細(xì)胞凋亡，還可以通過(guò)作用于miR-335來(lái)抑制細(xì)胞增殖[6,20]。Bcl2 mRNA與Tra2β蛋白的結(jié)合位點(diǎn)和與miR-204的結(jié)合位點(diǎn)部分重疊，Tra2β蛋白可通過(guò)與miR-204競(jìng)爭(zhēng)與Bcl2α mRNA 3’ UTR的結(jié)合來(lái)調(diào)節(jié)Bcl2α mRNA的穩(wěn)定性，進(jìn)而調(diào)控Bcl2蛋白的表達(dá)[20]。筆者利用miRNA數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)miR-204作用的靶基因時(shí)發(fā)現(xiàn)，Tra2b可能為miR-204-3P的一個(gè)靶基因[21]。因此，Tra2β對(duì)Bcl2介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡調(diào)控機(jī)制可能比Tra2β蛋白和miR-204之間的競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系更為復(fù)雜。實(shí)驗(yàn)表明，OSCC中Tra2β mRNA呈高表達(dá)，結(jié)合已發(fā)表的文獻(xiàn)[22]可知Tra2β mRNA和miR-204在OSCC中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)性。由此可見(jiàn)，Tra2β和miR-204對(duì)OSCC細(xì)胞凋亡的調(diào)控機(jī)制可能更為復(fù)雜。

局限性：1）實(shí)驗(yàn)研究的對(duì)象數(shù)量不足；2）石蠟標(biāo)本缺乏對(duì)應(yīng)的癌旁口腔黏膜組織，因此，未通過(guò)免疫組化驗(yàn)證Tra2β蛋白在腫瘤和癌旁組織中的差異性表達(dá)；3）未對(duì)OSCC中Tra2β mRNA和miR-204之間的相關(guān)性和可能的作用機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步的研究。未來(lái)筆者將著眼于研究miR-204和Tra2β對(duì)OSCC細(xì)胞凋亡的調(diào)控機(jī)制。

4 結(jié)論

Tra2β對(duì)OSCC的發(fā)生發(fā)展和預(yù)后具有重要的臨床意義，它可能為OSCC診斷和治療提供了一個(gè)新的分子靶點(diǎn)。