張亞波 張 威 張守科 彭 瀚 孟 珂 舒金平 王浩杰

(1. 中國林業(yè)科學研究院亞熱帶林業(yè)研究所 富陽 311400； 2. 河南科技學院 新鄉(xiāng) 453003)

松褐天牛(Monochamusalternatus)屬鞘翅目(Coleoptera)天?？?Cerambycidae)墨天牛屬(Monochamus)，是馬尾松(Pinusmassoniana)、濕地松(P.elliottii)等松屬植物主要的蛀干害蟲，其成蟲也是松材線蟲(Bursaphelenchusxylophilus)的主要傳播媒介，在松材線蟲病的發(fā)生和擴散過程中發(fā)揮著關鍵作用(Stampsetal.， 2001； 展茂魁等， 2014)。

防治松褐天牛、切斷松材線蟲的侵染循環(huán)是松材線蟲病綜合治理的關鍵。松褐天牛幼蟲鉆蛀為害，隱蔽性較強，幼蟲期防控難度較大，防治幼蟲不僅耗費較高的成本，而且防控效率較低(史先慧等， 2017)。松褐天牛成蟲羽化后會鉆出樹干自由活動，進行補充營養(yǎng)和交尾產(chǎn)卵，同時傳播松材線蟲，成蟲期防控可以降低松褐天牛數(shù)量、減少松材線蟲對松樹的感染(趙錦年等，1989； 林長春等， 2002)。

綠僵菌(Metarhiziumspp.)和白僵菌(Beauveriaspp.)是應用最為廣泛的2類昆蟲病原真菌，在農(nóng)、林以及衛(wèi)生害蟲的防治中越來越受到人們的重視(Donaldetal.， 2004； 張亞波等， 2014)。關于白僵菌防治松褐天牛方面已取得較多進展(張立欽等， 2000； Shimazu， 2004； 劉洪劍， 2007)，釋放的生防菌株能夠定殖于生態(tài)系統(tǒng)中，且有取代土著菌株優(yōu)勢地位的趨向(趙學球等， 2007)。但利用綠僵菌防治松褐天牛的研究報道相對較少，何學友等(2007； 2008)分離篩選到了感染松褐天牛的9個金龜子綠僵菌菌株，潘永勝等(2010)篩選到了3個綠僵菌菌株。綠僵菌與白僵菌相比，綠僵菌具有較強的耐高溫和耐旱特性(江英成， 2000； 宋漳等， 2003)。所以，挖掘?qū)λ珊痔炫８叨玖Φ木G僵菌菌株具有重要的應用前景。

由于不同學者所采用的菌株標本并非同一模式，綠僵菌有關屬種的形態(tài)描述存在不一致的情況，致使在綠僵菌分類地位的研究中出現(xiàn)了許多爭議(Rezendeetal., 2015)。單純依靠形態(tài)特征來對綠僵菌屬種進行分類，很難將綠僵菌相近的種區(qū)分開來，利用分子生物學的研究技術有助于解決綠僵菌屬近緣種的分類難題。延伸因子EF-1α是真菌普遍存在和參與蛋白質(zhì)翻譯的蛋白，由于EF-1α編碼基因序列在種內(nèi)具有較高的保守性，而在不同種間具有規(guī)律性的進化差異，因此，EF-1α基因序列被廣泛地應用于真菌近緣種的鑒定以及真菌遺傳多樣性分析(Bischoffetal., 2009； Kepleretal., 2014； 郭慶港等， 2018)。本文選用幾株產(chǎn)孢好的綠僵菌菌株對松褐天牛成蟲進行生物測定，同時進行形態(tài)學和EF-1α編碼基因序列分析，重新明確4株綠僵菌的分類地位，旨在篩選出對松褐天牛成蟲具有高毒力的菌株，同時探討了施菌方式對致病性的影響，為生物防治松褐天牛奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試蟲來源及飼養(yǎng)

松褐天牛成蟲為馬尾松蟲害木置于室外不銹鋼紗網(wǎng)的養(yǎng)蟲籠飼養(yǎng)羽化所得，蟲害木主要來自浙江省杭州市富陽區(qū)。供試松褐天牛成蟲為3～5日齡、個體大小基本一致，并按日齡大小平均分配到各處理中。試蟲用新鮮的1年生馬尾松嫩枝在開有通氣孔的透明塑料杯 (上口12 cm、下口8 cm、高15 cm) 中單頭飼養(yǎng)，每天換1次嫩枝。

1.2 供試菌株

1)綠僵菌WP08菌株，由中國林業(yè)科學研究院亞熱帶林業(yè)研究所森林健康與保護研究室分離，提交中國科學院微生物菌種保藏中心(CGMCC No.4226)專利保存，該菌株分離自篩胸梳爪叩甲(Melanotuscribricollis)幼蟲僵蟲體上。

2)綠僵菌LV2菌株，由海南熱帶植物研究所提供，該菌株分離自椰心葉甲(Brontispalongissima)僵蟲體上。

3)綠僵菌WTKH菌株，由河北農(nóng)業(yè)大學提供，分離寄主不詳。

4)綠僵菌qc1401菌株，該菌株由作者分離自蠐螬(Popilliasp.)幼蟲僵蟲體上，保存在中國林業(yè)科學研究院亞熱帶林業(yè)研究所森林健康與保護研究室內(nèi)。

1.3 培養(yǎng)基和試劑

培養(yǎng)基為PPDA(去皮馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂18 g、蛋白胨10 g、水1 000 mL)。Taq DNA聚合酶購自TaKaRa公司； PCR引物合成及序列測定由上海生工生物工程有限公司完成。

1.4 綠僵菌形態(tài)特征觀察

在無菌條件下，挑取少量分生孢子粉，加10 mL的0.05%Tween 80溶液配制成孢子懸浮液，振蕩混勻后用血球計數(shù)板測定懸浮液中分生孢子濃度，并適當調(diào)整使之達到1.0×108個·mL-1。各取2 μL孢子懸浮液分別點接于PPDA培養(yǎng)基平板上，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)14天(QHX-300BS-III，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司)，觀察記錄菌落特征，在顯微鏡(蔡司生物顯微鏡Primo Star)下觀察菌絲和孢子形態(tài)，測量100個分生孢子大小。

1.5 分子生物學鑒定

1.5.1 EF1α-5’序列的PCR擴增及測序 將供試菌株接種PPDA平板，25 ℃下培養(yǎng)14天，刮取孢子，液氮研磨后，利用CTAB法提取總DNA。以之為模板，采用引物EF1T(5′-ATGGGTAAGGARGAC AAGAC-3′)與EF2T(5′-GGAAGTACCAGTGATC ATGTT-3′)進行PCR擴增(Rehner and Buckley， 2005)。PCR反應體系： 共25.0 μL，其中DNA模板1.0 μL(<1 μg)、EF1T(10 pmol·μL-1)0.3 μL、EF1T(10 pmol·μL-1)0.3 μL、10×Buffer緩沖液(無Mg2+)2.5 μL、Mg2+(25 mmol·L-1)1.5 μL、dNTP(2.5 mmol·L-1)1.5 μL、Taq聚合酶(2.5 U·μL-1)0.15 μL、ddH2O 17.75 μL。PCR擴增條件為： 94 ℃ 5 min，94 ℃ 40 s、54 ℃ 40 s、72 ℃ 0 s、30個循環(huán)，72 ℃10 min。PCR產(chǎn)物用1.0%的瓊脂糖電泳檢測。由上海生工生物工程技術有限公司測序。

1.5.2 序列分析 將獲得的EF-1α基因5’序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫，同時在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行Blast分析，找出與之有最大相似性的幾個序列，并下載其他幾種綠僵菌的相關序列。將下載的序列分別和本研究中的4條序列利用MEGA 6.0中ClustalW進行序列比對，采用Neighbor-joining(NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，其中選用的模型是Maximum Composite，運用Bootstrap檢驗重復，抽樣1 000次，其余參數(shù)為默認選項。

1.6 4株綠僵菌對天牛的毒力測定

1.6.1 孢子懸浮液配制 將供試綠僵菌置于PPDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)14天，將真菌的分生孢子粉刮到一個干凈無菌的盛有10 mL 0.05% Tween 80的三角瓶中，充分振蕩，然后加入無菌水，用血球計數(shù)板法計算孢子溶液濃度。供試孢子的萌發(fā)率均在97%以上。

1.6.2 無紡布菌條制作 液體母種參考徐金柱等(2006)方法制作。培養(yǎng)基制作方法參照徐金柱等(2007)，黃豆粉40 g·L-1、白砂糖20 g·L-1、蛋白胨6 g·L-1，接種量為種子∶輔料=1∶2，25 ℃下，RH 95%培養(yǎng)至產(chǎn)孢。無紡布孢子含量為3.5×108個·cm-2。

1.6.3 試驗條件 試驗均在室內(nèi)自然變溫24～33 ℃，相對濕度40%～60%條件下測定綠僵菌對松褐天牛成蟲的致病力。試蟲死后保濕培養(yǎng)，觀察菌絲生長及產(chǎn)孢情況。

1.6.4 致病力測定 1)浸枝法： 取健康新鮮的馬尾松1年生嫩枝，洗凈晾干后，分別將供試菌株以0.05%的Tween 80滅菌水配制成濃度為1.0×108個·mL-1的分生孢子懸浮液，并逐級稀釋使?jié)舛葹?.0×106、1.0×107、1.0×108·個·mL-1，將馬尾松嫩枝(直徑0.8 cm、長12 cm)分別在孢子懸液中浸30 s，晾干嫩枝，將其放入消毒的干凈塑料杯中，松褐天牛成蟲接至塑料杯中飼養(yǎng)； 同時放置棉球保持濕度。以噴0.05%的Tween 80滅菌水的馬尾松嫩枝飼養(yǎng)為對照，每處理試蟲10頭，重復3次，處理后每天觀察1次，記錄死亡蟲數(shù)，直至處理后第40天。

2)浸蟲法： 分別將供試4個綠僵菌菌株以0.05%的Tween 80滅菌水配制成濃度為1.0×108孢子·mL-1的分生孢子懸浮液，采用浸漬法接種(潘永勝等， 2010)，將試蟲在孢子懸浮液中浸1 s進行接種，以0.05%的Tween 80滅菌水為對照，每個處理設3個重復，重復10頭試蟲。處理后的試蟲放入裝有新鮮馬尾松嫩枝的塑料瓶中飼養(yǎng)，同時放置棉球保持濕度，每天記錄死亡蟲數(shù)，連續(xù)觀察40天。

3)無紡布法： 為了檢測孢子的飄移是否會增加天牛成蟲的感染機會，在室內(nèi)進行觀察試驗。以100 cm×100 cm×100 cm尺寸制作養(yǎng)蟲籠，用不銹鋼紗網(wǎng)包裹。籠內(nèi)放置新鮮馬尾松嫩枝飼養(yǎng)天牛； 無紡布菌條固定于籠外30 cm，高50 cm處，使用風扇送風將孢子吹入籠內(nèi)。處理3個重復，以無菌布條為對照，每天記錄死亡蟲數(shù)，連續(xù)測定觀察40天。

1.7 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)各處理下供試昆蟲的死蟲數(shù)，按下式計算累計死亡率和校正死亡率：

死亡率(%)=死亡蟲數(shù)/供試總蟲數(shù)×100,

校正死亡率(%)=(處理組死亡率-對照組死亡率)/(100-對照組死亡率)×100。

數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用Spss 17.0中ProBit進行回歸分析，并計算半數(shù)死亡時間LT50。

2 結(jié)果與分析

2.1 4株綠僵菌的形態(tài)特征

4個供試菌株在PPDA培養(yǎng)基上菌落特征不同，分生孢子形態(tài)及大小差異較大。菌株WP08和WTKH菌落初期邊緣白色，菌絲濃密，中央產(chǎn)生暗綠色、厚而密的分生孢子層，后期2個菌株分生孢子層顏色不同。WP08后期分生孢子層顏色呈橄欖色，WTKH分生孢子層顏色呈灰褐色； 菌株qc1401和LV2菌落氣生菌絲較多，qc1401菌株培養(yǎng)至后期分生孢子層顏色變淡呈灰橄欖色，LV2分生孢子層顏色呈黑褐色。4個綠僵菌的分生孢子在形態(tài)上存在一定的差異。WP08、WTKH和LV2菌株的孢子呈長橢圓形，但WP08和WTKH菌株的孢子個體較小[(4.9～7.2) μm×(1.4～2.8) μm]，LV2菌株的孢子相對較大[(5.0～8.1) μm×(2.5～3) μm]，qc1401菌株孢子兩端鈍圓，大小為(7.0～9.0) μm×(2.0～3.0) μm(圖1)。

圖1 不同綠僵菌菌株的菌落特征和分生孢子形態(tài)Fig.1 Colony morphology and Conidiospora feature of four Metarhizium spp. isolates

2.2 4株綠僵菌EF1α基因序列分析

對4個菌株的EF1α基因5’序列進行擴增，將所得序列輸入到GenBank數(shù)據(jù)庫中進行Blast分析，在構(gòu)建的系統(tǒng)樹中，外群球孢白僵菌獨立于系統(tǒng)樹的基部，與各綠僵菌菌株的遺傳距離很遠。供試的綠僵菌菌株聚類為4個主要組群，即平沙綠僵菌(M.pingshaense)、羅伯茨綠僵菌(M.robertsii)、金龜子綠僵菌(M.anisopliae)和癭綿蚜綠僵菌(M.pemphigi)。供試菌株WTKH和WP08劃分在平沙綠僵菌組群中，結(jié)合形態(tài)學特征將WTKH和WP08鑒定為平沙綠僵菌； LV2劃分在金龜子綠僵菌組群中，結(jié)合形態(tài)學特征將其鑒定為金龜子綠僵菌； 菌株qc1401劃分在癭綿蚜綠僵菌組群中，根據(jù)Kepler等(2014)提出的黃綠綠僵菌的分類系統(tǒng)，將其鑒定為癭綿蚜綠僵菌Metarhiziumpemphigi(Driver & R.J. Milner) Kepler。

2.3 松褐天牛綠僵菌侵染特征

松褐天牛成蟲被綠僵菌感染后，最初表現(xiàn)為活動遲緩，食量減少，而后停止活動，蟲體僵化。保濕培養(yǎng)后從成蟲觸角節(jié)間膜上或從成蟲頭部、胸部、腹部及足部的節(jié)間長出白色菌絲體，最后白色菌絲上出現(xiàn)綠色孢子堆(圖3)。

2.4 不同綠僵菌菌株對松褐天牛的致死率

采用浸蟲法測定4個綠僵菌菌株對松褐天牛的毒力。供試的4個綠僵菌菌株對松褐天牛表現(xiàn)出不同程度的致病效果，其中校正死亡率較高的是平沙綠僵菌WP08菌株和金龜子綠僵菌LV2菌株，40天的試驗期內(nèi)死亡率達到100%； 黃綠綠僵菌qc1401死亡率為91.9%，平沙綠僵菌WTKH菌株的校正死亡率為87.9%； 對照組死亡率為16.67%(表1)。

圖2 基于EF-1α基因5’序列構(gòu)建的綠僵菌菌株系統(tǒng)進化樹Fig.2 Evolution tree of the different Metarhizium strains based on the 5’ end of EF-1α sequences

圖3 松褐天牛被綠僵菌侵染死亡特征Fig.3 Death symptom of M. alternatus infected by Metarhizium spp.

2.5 綠僵菌對松褐天牛的致死速度

4株綠僵菌采用浸蟲法接種松褐天牛，試驗結(jié)果表明4株綠僵菌對試蟲的致死速度不同，供試綠僵菌中WP08菌株開始致死時間較早，致死速度較快(圖4)，LT50為5.52天； 其次為LV2菌株的致死速度也較快，LT50為10.38天，qc1401菌株的致死時間和致死速度相對較慢，半數(shù)死亡時間較長，WTKH菌株的致死時間和致死速度介于LV2和qc1401之間(表1)。

表1 不同綠僵菌菌株對松褐天牛的毒力測定Tab. 1 Toxicity test of different Metarhizium isolates to M. alternatus

圖4 不同綠僵菌對松褐天牛的毒力測定Fig.4 Pathogenic effect of different Metarhizium isolates to M. alternatus

2.6 WP08菌株不同孢子濃度致病力分析

以平沙綠僵菌WP08菌株為供試菌株，采用浸枝法接種松褐天牛成蟲，從表2可以看出，孢子濃度越高則半數(shù)死亡時間越短。當孢子濃度為1.0×108個mL-1時，半數(shù)死亡時間LT50為11.38天。隨著孢子濃度的降低，半數(shù)死亡時間也隨之延長，當孢子濃度為1.0×106個mL-1時，LT50為24.22天(表2)。從圖5中可以看出，較高孢子濃度可以更早地導致試蟲死亡。在孢子濃度的試驗中，從試蟲開始死亡直至試驗截止，各個濃度總會有一段試蟲集中死亡的時間，而后死亡速率減慢。部分試蟲集中死亡后，個別試蟲到試驗后期才死亡，累積死亡率曲線呈現(xiàn)對數(shù)型。

2.7 接種方式對松褐天牛的致病效果

以平沙綠僵菌WP08為供試菌株，采用浸枝法、浸蟲法和無紡布法均可致試蟲死亡。施菌40天內(nèi)供試松褐天牛死亡率均為100%，浸蟲法的LT50為5.52天； 浸枝法LT50為11.38天； 無紡布法LT50為17.21天。對照組死亡率為16.67%； 浸蟲法致死速率均高于浸枝法和無紡布法(表3)。

圖5 不同孢子濃度下綠僵菌對松褐天牛的致病效果Fig.5 Pathogenic effect to M. alternatus in different spore concentrations

表3 綠僵菌不同接種方法對松褐天牛的致病效果Tab.3 Pathogenic effect to M. alternatus in different inoculation method

3 討論

關于綠僵菌的分類一直是眾多學者的研究熱點。Tulloch(1976)根據(jù)形態(tài)特征將綠僵菌劃分為金龜子綠僵菌、黃綠綠僵菌(M.flavoviride)和白色綠僵菌(M.album)3個種。但是，由于綠僵菌屬內(nèi)形態(tài)差異微小，而菌落特征受培養(yǎng)條件的影響，分生孢子大小和形態(tài)存在一定變化范圍，單純依靠形態(tài)特征來對綠僵菌屬種進行分類具有較大局限性(王峰等， 2017)，利用分子生物學的研究技術有利于解決綠僵菌屬近緣種的分類難題。Drive和Milner(2000)根據(jù)綠僵菌ITS1-5.8S-ITS2 rDNA序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果，將37株綠僵菌同樣劃分為3個種(金龜子綠僵菌、黃綠綠僵菌和白色綠僵菌)，其中，黃綠綠僵菌下分5個變種，黃綠綠僵菌癭綿蚜變種M.flavoviridevar.pemphigi(Driver & R.J. Milner) Kepler被首次定名。Kepler等(2014)認為僅僅以ITS來分析綠僵菌的系統(tǒng)發(fā)育非常有限，不能有效區(qū)分綠僵菌的近緣種，他采用EF-1α，RPB1，RPB2和β-tubulin多基因進化的方法結(jié)合形態(tài)學特征對綠僵菌及其近緣種進行了研究，認為黃綠綠僵菌癭綿蚜變種與Metarhiziumpemphigi應為同物異名，隨即取消了黃綠綠僵菌癭綿蚜變種，改為Metarhiziumpemphigi(Driver & R.J. Milner) Kepler。Nishi等(2017)根據(jù)形態(tài)學特征及PCR-RFLP和多基因的系統(tǒng)分析的結(jié)果，同樣認為應將黃綠綠僵菌癭綿蚜變種改為Metarhiziumpemphigi。本文中qc1401菌株為蠐螬即弧麗金龜(Popilliasp.)幼蟲僵蟲上分離得到，該種曾被鑒定為黃綠綠僵菌癭綿蚜變種Metarhiziumflavoviridevar.pemphigi(張亞波等， 2015)，后因黃綠綠僵菌及其近緣種的重新劃分，本文中對該菌株重新定名為Metarhiziumpemphigi。本研究中的菌株WP08、WTKH和LV2的孢子顏色和形態(tài)上相近，而在構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹中劃分兩個組群，菌株WP08、WTKH聚在平沙綠僵菌分支上，LV2聚在金龜子綠僵菌的分支上。WTKH最初被鑒定為金龜子綠僵菌，本文依據(jù)形態(tài)學和EF-1α基因序列分析將其重新鑒定為平沙綠僵菌。

松材線蟲病是松樹(Pinusspp.)的一種毀滅性病害，松褐天牛是病原線蟲的主要媒介昆蟲。羽化的松褐天牛有20%～30%攜帶有松材線蟲，羽化10天后松材線蟲開始轉(zhuǎn)移到寄主體內(nèi)，轉(zhuǎn)移期可以持續(xù)79天(Lietal., 2007)。蔣平等(2002)研究表明，線蟲的脫出數(shù)量在松褐天牛成蟲羽化后20～30天最多，前10天傳播的數(shù)量不到總量的10%。而最早產(chǎn)卵時間為補充營養(yǎng)后的第8天即羽化后第8天，說明在成蟲羽化后14天內(nèi)殺死松褐天牛，才能對控制松材線蟲病有明顯效果。王四寶等(2004)和何學友等(2005)室內(nèi)毒力測定的結(jié)果表明，松褐天牛成蟲感染金龜子綠僵菌后第7天就開始死亡，10～15天為死亡高峰期； 而本試驗中供試的平沙綠僵菌WP08菌株浸蟲法的LT50為5.52天，5～10天為死亡高峰期，浸枝法的LT50為11.38天，10～15天為死亡高峰期； 金龜子綠僵菌LV2菌株的致病速度也較快，浸蟲法LT50為10.38天，10～15天為死亡高峰期，均具有較大實際應用價值。

在相同環(huán)境條件下，昆蟲接觸到的病原菌越多，其被感染的幾率越大。本試驗中采用了3種施菌方法，浸蟲法使蟲體接觸到的孢子數(shù)量最多，故殺蟲效果最好，其次為浸枝法，而無紡布法孢子數(shù)量相對較少，其殺蟲效果較差。通常在林間使用噴霧、噴粉法防治森林蛀干害蟲，真菌孢子很難接觸到樹干內(nèi)的幼蟲，而且對羽化不整齊的天牛成蟲效果常不理想，難以完全發(fā)揮優(yōu)良菌株的效果與作用，這是蛀干害蟲防治中的難題。無紡布法可以延長孢子在林間的擴散時間，在這方面的研究取得了一些進展(Tsutsumietal.， 1997； Okitsuetal., 2000； 王濱等， 2003)。本試驗中的無紡布法能夠說明孢子的飄移是能夠增加天牛成蟲的感染機會，后期還可以結(jié)合天牛的趨性特點選擇相應的無紡布顏色開展林間試驗。針對成蟲開展致病力強的優(yōu)良菌株選育并開發(fā)相應的施菌技術，以提高其在天牛等蛀干類害蟲防治中的應用價值。

4 結(jié)論

平沙綠僵菌WP08菌株對松褐天牛致死率高、致死速度快，為防治松褐天牛的優(yōu)良菌株。孢子濃度是影響防效的關鍵因素，林間應用時，建議綠僵菌孢子濃度應在1×108個·mL-1以上。此外，可采用噴施綠僵菌孢子懸浮液或懸掛無紡布法防治松褐天牛成蟲。