譚玲瓏,劉艷秋,黃婷婷,鄒永毅

(江西省婦幼保健院產(chǎn)前診斷中心，南昌330006)

胎兒神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育異常是最常見(jiàn)的先天性畸形之一，主要包括側(cè)腦室增寬、腦積水、全前腦、無(wú)腦兒、 脈絡(luò)叢囊腫、 小腦延髓池增寬、Dandy—walker 綜合征、胼胝體發(fā)育不良、顱內(nèi)腫瘤、顱后窩結(jié)構(gòu)畸形等。 導(dǎo)致畸形的病因可分為遺傳性因素、感染性因素、化學(xué)性因素或環(huán)境因素等[1]。 目前，應(yīng)用于檢測(cè)胎兒畸形的常見(jiàn)染色體檢查方法主要是傳統(tǒng)G 顯帶染色體核型分析[2]。 然而，G 顯帶染色體核型分析僅能檢出非整倍體染色體數(shù)目異常和較大片段的結(jié)構(gòu)異常， 即使利用高分辨顯帶技術(shù)也僅限于檢出4-5Mb 以上的染色體異常[3]。 并不能檢出染色體微缺失和微重復(fù)，然而微缺失和微重復(fù)與胎兒神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育異常具有相關(guān)性。染色體微陣列分析技術(shù) (Chromosome Microarray Analysis,CMA)是新近出現(xiàn)的用于檢測(cè)染色體微缺失和微重復(fù)的一項(xiàng)技術(shù)， 能將染色體拷貝數(shù)變異 （ copy number variations, CNVs）檢出率提高到10% 以上[4,5]。 與傳統(tǒng)染色體核型分析技術(shù)相比，CMA 分辨率高，能檢出大于400kb 的CNVs，準(zhǔn)確分析染色體微缺失微重復(fù)異常及相關(guān)并發(fā)癥。而且該項(xiàng)技術(shù)不需要對(duì)標(biāo)本進(jìn)行培養(yǎng)， 大大減少實(shí)驗(yàn)人員操作時(shí)間及流程，可以很快向患者告知診斷結(jié)果[6]。 本研究對(duì)140 例產(chǎn)前超聲提示神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育異常，伴或不伴其他系統(tǒng)結(jié)構(gòu)異常的胎兒標(biāo)本采用染色體微陣列分析技術(shù)進(jìn)行全面系統(tǒng)分析，探討CMA 在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育胎兒產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用價(jià)值， 現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2018 年1 月至2019 年6 月因產(chǎn)前超聲提示胎兒表現(xiàn)為神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育異常至江西省婦幼保健院產(chǎn)前診斷科行侵入性產(chǎn)前診斷的孕婦，共計(jì)140 例，根據(jù)是否合并其他系統(tǒng)結(jié)構(gòu)異常， 將胎兒樣本分為單純神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育異常胎兒組和復(fù)合神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育異常胎兒組。 所有孕婦行手術(shù)之前均簽署產(chǎn)前診斷知情同意書(shū)， 明確手術(shù)流程、手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)及染色體微陣列分析技術(shù)、染色體核型分析技術(shù)的意義、局限性，產(chǎn)前診斷方法根據(jù)孕周不同包括羊膜腔穿刺術(shù)和臍靜脈血穿刺術(shù)。 所有標(biāo)本同時(shí)進(jìn)行染色體微陣列分析和細(xì)胞染色體核型分析。

1.2 研究方法 樣本采集：所有孕婦在簽署手術(shù)知情同意書(shū)的情況下，行無(wú)菌消毒，用B 型超聲波儀進(jìn)行胎兒、胎盤(pán)定位，避開(kāi)損傷胎兒和胎盤(pán)的位置進(jìn)針，無(wú)菌抽取標(biāo)本羊水或臍血。 DNA 提取：采用Qiagene DNA 提取試劑盒提取DNA。 染色體微陣列：采用美國(guó)Affy-metrix 公司750K 芯片試劑盒及美國(guó)Clontech 公司DNA 擴(kuò)增試劑盒， 首先采用NspI 酶將DNA 隨機(jī)消化為短片段，并進(jìn)一步連接補(bǔ)齊消化后產(chǎn)物末端。其次PCR 擴(kuò)增，并利用磁珠法純化、片段化，將產(chǎn)物標(biāo)記，后與芯片雜交，最后洗片、染色，掃描獲取數(shù)據(jù)并進(jìn)一步采用Chas v4軟件進(jìn)行分析及結(jié)果判讀。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 19.3 組與組之間t 檢驗(yàn)對(duì)兩組樣本進(jìn)行比較分析， 定義P<0.05 有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 產(chǎn)前診斷結(jié)果 共計(jì)140 例孕婦接受產(chǎn)前診斷， 染色體微陣列分析和胎兒細(xì)胞培養(yǎng)染色體核型分析成功率100%，根據(jù)伴或不伴其他系統(tǒng)結(jié)構(gòu)異常分為單純神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育異常胎兒組和復(fù)合神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育異常胎兒組， 以下簡(jiǎn)稱(chēng)單純組和復(fù)合組。 其中單純組病例112 例，共檢出異常染色體7例：其中18 三體2 例，染色體致病性微缺失2 例，染色體致病性微重復(fù)3 例。 同時(shí)CMA 檢出6 例意義不明病例。 復(fù)合神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育異常胎兒組28例，共檢出異常染色體8 例：其中18 三體4 例，21三體1 例，13 三體1 例， 染色體致病性微缺失2例。 同時(shí)CMA 檢出2 例意義不明病例。 見(jiàn)表1。

2.2 神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育異常與染色體異常間關(guān)系 140例神經(jīng)系統(tǒng)異常胎兒按異常病例結(jié)果分為單純脈絡(luò)膜囊腫3 例、單純側(cè)腦室增寬3 例、單純后顱窩池增寬1 例、左側(cè)脈絡(luò)膜囊腫合并室間隔缺損，左腎重復(fù)腎1 例、右側(cè)脈絡(luò)膜囊腫合并室間隔缺損1例、雙側(cè)脈絡(luò)膜囊腫合并雙側(cè)腎集合系統(tǒng)增寬，鼻骨骨化不全1 例、小腦蚓部稍小合并室間隔缺損1例、小腦體積稍小，左側(cè)側(cè)腦室增寬合并臍膨出1例、后顱窩池增寬合并室間隔缺損1 例、雙側(cè)腦室增寬合并膽囊區(qū)未見(jiàn)回聲，室間隔缺損1 例、透明隔缺如，胼胝體發(fā)育不良合并室間隔缺損1 例。 染色體核型分析發(fā)現(xiàn)異常病例共10 例，染色體微陣列分析發(fā)現(xiàn)異常病例共15 例。 見(jiàn)表2。

3 討論

目前，我國(guó)新生兒出生缺陷發(fā)生率約為5.6%，隨著人口出生增加， 每年新增缺陷出生兒病例總數(shù)不斷上漲[7]。 為降低先天出生缺陷的發(fā)生，世界衛(wèi)生組織提出了出生缺陷的“三級(jí)預(yù)防”策略，出生缺陷的預(yù)防分為三級(jí)，其中二級(jí)預(yù)防[8]是指“早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷、早期治療”，其中早期診斷是指在胎兒出生前，通過(guò)產(chǎn)前篩查、產(chǎn)前診斷等手段對(duì)胎兒先天性缺陷進(jìn)行診斷， 及早發(fā)現(xiàn)胎兒可能存在的先天缺陷，及早采取宮內(nèi)治療、終止妊娠等干預(yù)措施。 產(chǎn)前診斷[9]是妊娠期預(yù)防先天出生缺陷的重要措施，隨著醫(yī)療事業(yè)的進(jìn)步發(fā)展，臨床產(chǎn)前診斷技術(shù)不斷完善提高， 在診斷先天缺陷中應(yīng)用廣泛、效果明顯，能從根本上控制出生缺陷兒數(shù)量，對(duì)提高人口素質(zhì)有著重要的意義[10]。

表1 產(chǎn)前診斷結(jié)果

表2 神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育異常與染色體異常間關(guān)系

本研究對(duì)超聲提示神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育異常， 伴或不伴其他系統(tǒng)結(jié)構(gòu)異常的胎兒進(jìn)行產(chǎn)前診斷，同時(shí)運(yùn)用染色體微陣列分析技術(shù)和傳統(tǒng)G-顯帶染色體核型分析技術(shù)。 研究結(jié)果顯示染色體核型分析發(fā)現(xiàn)10 例異常核型， 染色體異常的檢出率為7.1%，染色體微陣列分析發(fā)現(xiàn)15 例異常核型，染色體異常的檢出率為10.7%，較染色體核型分析另檢出5 例致病性CNVs 胎兒樣本， 包括3 例B 超提示胎兒雙側(cè)側(cè)腦室增寬，1 例B 超提示胎兒后顱窩池增寬，1 例B 超提示胎兒雙側(cè)腦室增寬合并膽囊區(qū)未見(jiàn)回聲、室間隔缺損，染色體致病性拷貝數(shù)變異片段大小不等，均未能被傳統(tǒng)G-顯帶染色體核型分析技術(shù)識(shí)別。因此，CMA 技術(shù)可以一定程度上彌補(bǔ)傳統(tǒng)G-顯帶染色體核型分析的不足，能夠更好的提高神經(jīng)系統(tǒng)胎兒染色體異常的檢出率。

傳統(tǒng)G 顯帶染色體核型分析僅能檢出5～10 Mb 以上的異常。 而染色體微陣列分析可識(shí)別約400 Kb 左右的不平衡拷貝數(shù)變異。研究表明，在胎兒超聲結(jié)構(gòu)異常而染色體核型分析結(jié)果正常的病例中，6%被檢出染色體致病性拷貝數(shù)變異，而在胎兒超聲和染色體核型分析結(jié)果都正常的病例中，1.7% 被檢出染色體拷貝數(shù)變異[11]，CMA 與傳統(tǒng)染色體核型分析相比，可發(fā)現(xiàn)更多異常病例[12]，因此，CMA 被美國(guó)婦產(chǎn)科協(xié)會(huì)等廣泛推薦用于診斷胎兒心臟結(jié)構(gòu)異常、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育異常如顱腦畸形等[13-15]。 本研究顯示，1 例B 超提示胎兒?jiǎn)渭兒箫B窩池增寬[16]，染色體分析核型結(jié)果提示正常，而CMA 結(jié)果提示Xp22.2 存在640.49Kb 重復(fù)，如此小片段的致病性CNVs 并不能被傳統(tǒng)染色體核型分析所識(shí)別，因此，臨床應(yīng)用中，CMA 更能深入了解胎兒異常的遺傳背景，提供更有臨床意義的遺傳咨詢(xún)。

CNVs 即拷貝數(shù)變異，現(xiàn)階段常用的檢測(cè)方法為染色體微陣列或CNV 測(cè)序，DNA 拷貝數(shù)有異常，也并不表明該個(gè)體表型有異常，根據(jù)2019 年美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)學(xué)會(huì)[17]對(duì)結(jié)構(gòu)拷貝數(shù)變異的解釋?zhuān)Y(jié)合多方面的評(píng)分體系：⑴引入了定量的、基于證據(jù)的評(píng)分框架； ⑵實(shí)施廣泛用于序列變異分類(lèi)的五級(jí)分類(lèi)系統(tǒng)； ⑶將基于證據(jù)的變異分類(lèi)與對(duì)特定個(gè)體的潛在影響進(jìn)行分離。 由于拷貝數(shù)缺失和拷貝數(shù)重復(fù)之間的顯著特性和固有差異,因此針對(duì)兩種拷貝數(shù)變異制定了單獨(dú)的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn),每個(gè)計(jì)分的證據(jù)類(lèi)別都被標(biāo)出（1A，1B 等）以便于參考。 對(duì)CNVs 的結(jié)果分成五類(lèi): 致病性 （P）、 可能致?。↙P）、不確定臨床意義（VUS）、可能是良性的、良性（LB）。 其中致病性CNVs 包括：⑴與多個(gè)同行評(píng)審出版物報(bào)道具有一致臨床表型的CNVs，即使存在外顯不全和可變表達(dá)，但其外顯和表達(dá)證據(jù)充分；⑵與已知的劑量敏感區(qū)完全重疊的獨(dú)特CNVs；⑶多基因CNVs，其中已知至少一個(gè)基因具有劑量敏感性，即使其他基因的意義不確定。

本研究有1 例病例產(chǎn)前胎兒彩超提示單純側(cè)腦室增寬，CMA 結(jié)果提示6q27 區(qū)段2.3Mb 的缺失， 該區(qū)段包含THBS2、PHF10、TCTE3、WDR27、C6orf70、DLL1 基因等,根據(jù)ACMG 判讀指南，該缺失判讀為致病性變異。 有文獻(xiàn)報(bào)道報(bào)道，在12 名患者中均檢出6q27 區(qū)域缺失一個(gè)拷貝，且缺失區(qū)域均覆蓋大小為1.2Mb 的熱點(diǎn)缺失區(qū)域， 該區(qū)域包 含 THBS2、 PHF10、TCTE3、DLL1、WDR27 和C6orf70 基因。 患者的主要臨床表現(xiàn)包括腦發(fā)育異常、腦室周?chē)Y(jié)節(jié)狀異位、胼胝體發(fā)育不全、空洞腦、小腦發(fā)育不全、多小腦回等[18]。 另?yè)?jù)Peddibhotla 報(bào)道，在7 例患者中均檢出6q27 區(qū)域的缺失一個(gè)拷貝， 且缺失區(qū)域均覆蓋大小為1.7Mb 的熱點(diǎn)缺失區(qū)域， 該區(qū)域包含THBS2、PHF10、DLL1 和C6orf70 基因。 所有患者均表現(xiàn)為腦結(jié)構(gòu)異常[19]。

140 例神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育異常胎兒的孕婦中，單純神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育異常胎兒組112 例： CMA 檢出6 例意義不明病例， 檢出率5.4%（6/112）。 復(fù)合神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育異常胎兒組28 例： CMA 檢出2 例意義不明病例，檢出率7.1%（2/28）。 隨著CMA 技術(shù)的發(fā)展進(jìn)步，分辨率、檢出率隨之增加，因此臨床意義不明確的CNVs 的檢出率也隨之提高。意義不明病例不僅增加了產(chǎn)前門(mén)診咨詢(xún)的難度， 也使孕婦及其家屬產(chǎn)生焦慮情緒， 醫(yī)生并不能明確告知患者胎兒的預(yù)后。 目前不同國(guó)家的學(xué)術(shù)指南對(duì)于CMA臨床意義不明結(jié)果的報(bào)道和解釋存在尚爭(zhēng)議[20]。我國(guó)針對(duì)此情況主要是通過(guò)采取父母外周血行CMA比對(duì)，協(xié)助解釋不明確CNVs 的性質(zhì)，從而降低臨床意義不明確的CNVs 的檢出率。

本研究通過(guò)探討分析染色體微陣列分析技術(shù)(CMA)在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育異常胎兒中的應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)與傳統(tǒng)染色體核型分析相比較， 染色體微陣列分析技術(shù)在異常胎兒的產(chǎn)前診斷中，檢出率明顯提高。但本研究的研究樣本較小， 對(duì)胎兒神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育異常產(chǎn)前診斷的臨床價(jià)值仍需作進(jìn)一步的深入研究。