陳 治 宋 娜 源利文 鄔倩倩 高天翔

(1. 海南熱帶海洋學(xué)院水產(chǎn)與生命學(xué)院, 三亞 572022; 2. 中國(guó)海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院, 青島 266003; 3. 神戶大學(xué)人間發(fā)達(dá)環(huán)境學(xué)研究科, 神戶 657-8501; 4. 浙江海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院, 舟山 316022)

環(huán)境DNA(Environmental DNA, eDNA)是指動(dòng)物、植物、微生物等釋放于空氣、土壤、水體等環(huán)境中的DNA總稱[1]。eDNA分析方法首先被應(yīng)用于微生物(Micro-organisms)群落的研究[1], 2008年開始拓展到水生大生物(Macro-organisms)研究領(lǐng)域[1]。eDNA獲取是eDNA分析的基礎(chǔ), 此步驟包括水樣采集、eDNA保存、eDNA提取三個(gè)環(huán)節(jié)[1]。關(guān)于常規(guī)水樣的eDNA獲取方法, 目前已有諸多研究報(bào)道[2—5]。高濁度水樣的eDNA獲取方法, 國(guó)內(nèi)外主要集中在微生物領(lǐng)域[6—8], 大生物領(lǐng)域的研究則較少。高濁度水樣大生物eDNA獲取具有以下兩個(gè)方面突出問題： (1)水體環(huán)境一般不適合大生物的生存[9,10]——與微生物相比, 大生物的eDNA含量極低; (2)泥沙等雜質(zhì)對(duì)eDNA獲取具有較強(qiáng)的干擾作用[11—14], 會(huì)增大eDNA獲取的難度。因此亟需建立和優(yōu)化高濁度水樣的eDNA獲取方法。

此外, 關(guān)于已有的水樣eDNA獲取方法, 目前仍無(wú)統(tǒng)一觀點(diǎn)。對(duì)于水樣采集, Dejean等[12]、Ficetola等[15]、Foote等[16]、Thomsen等[17,18]研究認(rèn)為乙醇沉淀法的eDNA產(chǎn)量最高; Minamoto等[3]、Olson等[19]、Takahara等[20,21]、Fukumoto等[22]則認(rèn)為使用0.2 μm的混合纖維素濾膜和0.7 μm的玻璃纖維濾膜抽濾效果優(yōu)于乙醇沉淀法; Deiner等[4]進(jìn)行了乙醇沉淀法與濾膜抽濾法比較, 結(jié)果卻顯示二者效果相同。對(duì)于eDNA獲取的第二個(gè)環(huán)節(jié)——eDNA的保存亦存在諸多爭(zhēng)議。Lever等[6]、Pilliod等[14]、Strickler等[23]、Takahara等[20]在研究過程中將濾膜置于-20℃冷凍保存。Minamoto等[3]用15 mL酒精對(duì)抽濾后的濾膜進(jìn)行脫水保存, 發(fā)現(xiàn)室溫下eDNA至少在6d內(nèi)不存在顯著降解, 而凍融反而影響eDNA產(chǎn)量。與上述兩種觀點(diǎn)不同, Pilliod等[14]、Strickler等[23]、Takahara等[21]對(duì)冷凍保存1—2d后的水樣進(jìn)行抽濾, 發(fā)現(xiàn)eDNA產(chǎn)量與現(xiàn)場(chǎng)抽濾的效果一致。除上述兩個(gè)環(huán)節(jié)外, 對(duì)于eDNA獲取的第三個(gè)環(huán)節(jié)(eDNA提取), 主流的觀點(diǎn)認(rèn)為DNeasy Blood and Tissue Kit的提取效果最佳, 故該試劑盒目前被廣泛應(yīng)用于eDNA研究。但Deiner等[4]、Senapati等[24]卻認(rèn)為使用標(biāo)準(zhǔn)的苯酚-氯仿-異戊醇提取方法結(jié)果顯著優(yōu)于MoBio PowerWater DNA Isolation Kit和DNeasy Blood and Tissue Kit試劑盒。此觀點(diǎn)又與Eichmiller等[25]、Yamanaka等[26]、Miya等[27]的結(jié)論沖突。綜上所述, eDNA獲取的最優(yōu)方法, 可能與研究的對(duì)象、水域、目的密切相關(guān)。因此有必要在空白研究水域?qū)σ延械膃DNA獲取方法進(jìn)行驗(yàn)證優(yōu)化。

舟山漁場(chǎng)是我國(guó)最大的近海漁場(chǎng), 位處長(zhǎng)江、錢塘江、甬江等河流的入海交匯區(qū), 東部受臺(tái)灣暖流的影響, 西部主要受由三江等大陸徑流形成的沿岸水影響, 北部還有黃海冷水團(tuán)的季節(jié)性分布, 具有獨(dú)特的高濁度水文環(huán)境[28—31]。迄今為止, 尚無(wú)該區(qū)域及類似水域大生物eDNA獲取的相關(guān)研究。徐念等[32]雖對(duì)長(zhǎng)江中下游干流eDNA樣本進(jìn)行了魚類多樣性初步研究, 但研究中并未進(jìn)行高濁度eDNA獲取方法的優(yōu)化工作。為提高后續(xù)eDNA分析結(jié)果的可靠性, 亟待在舟山近海建立和優(yōu)化eDNA獲取方法。曼氏無(wú)針烏賊(Sepiella japonica)曾與大黃魚、小黃魚、帶魚并稱為我國(guó)東海四大海產(chǎn), 近年來(lái)其資源衰退嚴(yán)重[33]。2000年以來(lái), 浙江省積極采取人工繁殖苗種和放流相結(jié)合的增殖養(yǎng)護(hù)措施。僅2013—2016年在浙江北部的累計(jì)增殖放流受精卵就達(dá)7835×104粒。目前, 浙江近海曼氏無(wú)針烏賊數(shù)量呈明顯增長(zhǎng)趨勢(shì)[33]。本研究以曼氏無(wú)針烏賊為eDNA定量檢測(cè)對(duì)象, 以方便后期開展追蹤調(diào)查及增殖放流效果評(píng)價(jià)工作。

1 材料與方法

1.1 物種選取與探針設(shè)計(jì)

根據(jù)曼氏無(wú)針烏賊、金烏賊(Sepia esculenta)、長(zhǎng)蛸(Octopus variabilis)等14種舟山近海常見頭足類序列, 使用Primer Express 3.0.1及Primer Premier 6設(shè)計(jì)了曼氏無(wú)針烏賊COⅠ基因特異性引物、探針。所得引物、探針序列為： L-2317： 5′-CAC CAGACATAGCCTTCC-3′; Pro-H-2432： HEXTGTTCATCCAGTTCCAGCACCT-TAMRA; H-2471： 5′-GCCAGCATGAGATAGATTAC-3′(引物、探針已申請(qǐng)發(fā)明專利)。

1.2 水樣采集及eDNA提取

于2017年4月1日至2017年6月14日, 采集浙江省舟山市海洋科學(xué)城(29°58′40.81″ N, 122°12′57.47″ E)和西閃島曼氏無(wú)針烏賊繁育中心(29°54′4.08″ N,122°19′45.10″ E)附近海域水樣。每一組實(shí)驗(yàn)處理取3個(gè)平行樣, 同時(shí)取滅菌后的去離子水為陰性對(duì)照?？紤]到eDNA獲取從水樣采集到eDNA保存、eDNA提取包含眾多小環(huán)節(jié), 單個(gè)水樣即使只抽濾200 mL所需時(shí)間也在30min左右, 因此實(shí)驗(yàn)過程中采用逐步優(yōu)化的方法, 減少不同小環(huán)節(jié)間的交叉組合。本研究共進(jìn)行了水樣采集、eDNA提取2個(gè)大環(huán)節(jié)(分7個(gè)小環(huán)節(jié))方面的優(yōu)化。

水樣采集方法的優(yōu)化對(duì)于乙醇沉淀法, 分別采集15 mL、240 mL水樣。采集方式及后續(xù)DNA提取方法參照Minamoto等[3]、Goldberg等[34]、Jerde等[35,36]水樣處理方法。但因泥沙含量較高, 對(duì)原方法進(jìn)行了2處改動(dòng)： (1)樣品4℃下10000×g離心1h去掉上清液, 將原來(lái)200 μL一次潤(rùn)洗改為200 μL三次潤(rùn)洗(共600 μL), 將沉淀物轉(zhuǎn)移到2 mL離心管中; (2)消化結(jié)束取上清液到2 mL離心管后, 兩次用200 μL TE buffer (或400 μL超純水)潤(rùn)洗剩余沉淀并轉(zhuǎn)移上清液。

對(duì)于濾膜抽濾法, 處理過程為： (1)用直徑47 mm、孔徑0.45 μm的WCN硝酸纖維濾膜濾膜分別抽濾15和120 mL海水及對(duì)應(yīng)陰性對(duì)照。(2)用蒸餾水潤(rùn)洗抽濾裝置, 去除殘留的eDNA。抽濾剩余水樣及陰性對(duì)照。抽濾時(shí)間約45min (乙醇沉淀法10000×g離心1h結(jié)束時(shí), 則停止抽濾), 記錄抽濾體積。(3)之后按照乙醇沉淀法中的提取步驟進(jìn)行eDNA提取。

濾網(wǎng)孔徑對(duì)去除水樣中大顆粒雜質(zhì)的影響(1)取4個(gè)體積為1.5 L的塑料杯。其中3個(gè)塑料杯用網(wǎng)目尺寸分別為10、20和30 μm的Spectra Mesh尼龍網(wǎng)罩在塑料杯口上, 用50 mL的注射器緩慢吸取水樣加注到尼龍網(wǎng)上。用于除去水樣中粒徑較大的雜質(zhì)。水樣經(jīng)過尼龍網(wǎng)過濾后滴入1.5 L塑料杯中。最后1個(gè)塑料杯無(wú)尼龍網(wǎng)過濾。(2)每個(gè)塑料杯抽濾3×200 mL水樣及陰性對(duì)照。(3)按前文中提取濾膜eDNA方法進(jìn)行DNA提取。

濾膜孔徑對(duì)eDNA采集的影響(1)用直徑為47 mm, 孔徑為0.22、0.45和0.70 μm的硝酸纖維濾膜分別抽濾3×50、3×150和3×300 mL的水樣, 并設(shè)置陰性對(duì)照。記錄抽濾所需時(shí)間。(2)按前文中提取濾膜eDNA方法進(jìn)行DNA提取。

靜置時(shí)間對(duì)eDNA采集的影響取12個(gè)體積為1.5 L的塑料瓶。(1)分別在分裝結(jié)束的0、20min、40min及60min后抽濾水樣, 抽濾時(shí)間為5min。抽濾時(shí)用量程為50 mL的注射器(精確度到5 mL)從表層吸取水樣注入抽濾漏斗上。記錄5min抽濾的水樣體積, 并設(shè)置陰性對(duì)照。(2)濾膜規(guī)格及eDNA提取方法參考前文。

陽(yáng)離子表面活性劑(Cationic surfactanton)對(duì)eDNA采集的影響： 將水樣分裝到2個(gè)體積為1.5 L的塑料瓶中。a塑料瓶的水樣不做處理, b塑料瓶的水樣按1：1000的比例加入濃度為10%的苯扎氯銨(Benzalkonium chloride)試劑[37]。使b塑料瓶中苯扎氯銨的終止?jié)舛葹?.01%。在水樣分裝結(jié)束后, 分別對(duì)a、b兩組抽取3×300 mL水樣, 并設(shè)置陰性對(duì)照。濾膜規(guī)格及eDNA提取方法參考前文。

eDNA提取方法的優(yōu)化碎膜消化法與去膜消化法比較 抽濾12個(gè)體積為150 mL水樣及陰性對(duì)照。前3個(gè)濾膜采用碎膜法提取eDNA(a組), 具體提取方法參考前文。后9個(gè)濾膜采用去膜法提DNA,具體的去膜操作如下： (1)取Salivette唾液收集管, 去除離心柱上的唾液收集綿。(2)用鑷子將濾膜輕卷成長(zhǎng)條狀, 放入Salivette唾液收集管的離心柱中。(3)1000×g分別離心1min (b—1組)、5min (b—2組)、10min (b—3組)。(4)將Salivette唾液收集管收集的混合物用200 μL超純水潤(rùn)洗并倒入2 mL離心管中。(5)再次用200 μL超純水潤(rùn)洗混合物并倒入離心管中。之后的操作步驟與碎膜法相同。

酚抽除沙法對(duì)eDNA提取的影響取6個(gè)體積為150 mL的水樣。前3個(gè)濾膜采用去膜法提取eDNA(a組, 具體操作參考前文), 后3個(gè)濾膜采用酚抽法提DNA。具體的改動(dòng)如下： 去膜操作使Salivette唾液收集管底部含有eDNA及泥沙雜質(zhì)的混合物后, 用400 μL STE裂解液潤(rùn)洗混合物兩次并倒入2 mL離心管中(共800 μL)。之后按照標(biāo)準(zhǔn)的苯酚-氯仿-異戊醇法提取eDNA。最后一步加入600 μL酒精后用參考DNeasy Blood and Tissue Kit試劑盒提取說明書進(jìn)行后續(xù)eDNA提取。使用酶標(biāo)儀進(jìn)行A260/A230、A260/A280測(cè)定。

1.3 數(shù)字定量PCR(digital PCR, dPCR)擴(kuò)增

由于模板中的抑制劑使熒光定量PCR(qPCR)擴(kuò)增效果不理想, 本實(shí)驗(yàn)統(tǒng)一使用數(shù)字定量PCR(Digital PCR, dPCR)進(jìn)行eDNA定量檢測(cè)。dPCR體系和步驟見表1。將反應(yīng)混合液加入電子芯片后進(jìn)行油封并壓緊, 隨后放入QuanStudio 3D Digital PCR反應(yīng)箱進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)結(jié)束后讀取eDNA濃度(copies/μL)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 18.0軟件對(duì)不同實(shí)驗(yàn)組間的分子拷貝數(shù)進(jìn)行單因子方差分析(One-way ANOVA)。差異顯著系數(shù)為P＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 濾膜抽濾法與乙醇沉淀法比較

同體積水樣使用乙醇沉淀法獲得的eDNA產(chǎn)量高于濾膜抽濾法(表2、圖1)。兩種方法在15和120 mL實(shí)驗(yàn)組上均存在極顯著差異(P＜0.01)。120 mL乙醇沉淀法的eDNA產(chǎn)量與350 mL濾膜抽濾法的eDNA產(chǎn)量相當(dāng)(F=0.33,P=0.60)。15和120 mL水樣用乙醇沉淀法獲得的eDNA產(chǎn)量是濾膜抽濾法的1.76—2.53倍。增大采樣體積會(huì)顯著提高eDNA產(chǎn)量。同一采樣方法下15、120和350 mL任意兩組間P＜0.01。同時(shí), 檢測(cè)結(jié)果的變異系數(shù)(Coefficient of variation,CV)(SD/AVE×100%)隨采樣量的增大而減小。這說明在采樣量較低時(shí), 基于eDNA濃度對(duì)物種相對(duì)生物量的判定結(jié)果誤差會(huì)較大。配套設(shè)備的限制, 嚴(yán)重影響乙醇沉淀法的應(yīng)用。目前很少有實(shí)驗(yàn)室配置4×400 mL以上規(guī)格的離心機(jī)。但濾膜抽濾法在45min則可采集350 mL以上的水樣。濾膜抽濾法在水樣抽濾體積上的優(yōu)勢(shì),消除了其自身eDNA采集效率低于乙醇沉淀法的劣勢(shì)。

表1 數(shù)字定量PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)步驟Tab. 1 System and procedure of digital PCR reaction

表2 乙醇沉淀法與濾膜抽濾法eDNA產(chǎn)量(均值±標(biāo)準(zhǔn)差)Tab. 2 The yield of eDNA by ethanol precipitation and filtering(AVE±SD)

圖1 乙醇沉淀法與濾膜抽濾法結(jié)果比較Fig. 1 The comparison between ethanol precipitation and filtering

2.2 濾網(wǎng)孔徑對(duì)去除水樣中大顆粒雜質(zhì)的影響

200 mL水樣抽濾時(shí)間在12.1—12.5min。無(wú)濾網(wǎng)組和有濾網(wǎng)組(10、20和30 μm)所需要的抽濾時(shí)間基本一致。單因子方差分析(one-way ANOVA)顯示各組之間在抽濾時(shí)間上不存在顯著差異(F=1.06,P=0.45)。200 mL水樣曼氏無(wú)針烏賊eDNA濃度在5457—5560 copies/μL之間, 4個(gè)組間亦不存在顯著差異(F=0.28,P=0.84)。10、20和30 μm濾網(wǎng)對(duì)泥沙等大顆粒雜質(zhì)無(wú)過濾作用, 添加濾網(wǎng)并不能增加水樣抽濾體積和提高eDNA產(chǎn)量(圖2)。

2.3 濾膜孔徑對(duì)eDNA采集的影響

三種濾膜在抽濾50 mL水樣時(shí), 在抽濾時(shí)間上存在極顯著差別(F=43.35,P=0.0003); 但抽濾150及300 mL水樣時(shí), 在抽濾時(shí)間上卻不存在顯著差異。孔徑0.22、0.45和0.70 μm的三種濾膜的eDNA產(chǎn)量在50及150 mL兩組上分別存在極顯著及顯著差異(F=33.09,P=0.0006;F=5.51,P=0.044), 但在300 mL組上無(wú)差異(F=1.72,P=0.257)。小體積水樣采集時(shí), 濾膜孔徑的大小對(duì)eDNA產(chǎn)量有很大影響, 此時(shí)應(yīng)選擇孔徑較小的濾膜進(jìn)行抽濾; 大體積水樣采集時(shí), 濾膜孔徑的大小對(duì)eDNA產(chǎn)量無(wú)影響(表3、圖3)。

圖2 不同孔徑的濾網(wǎng)效果比較Fig. 2 The comparison of filter screens with different apertures

2.4 靜置時(shí)間對(duì)eDNA產(chǎn)量的影響

隨著靜置時(shí)間的增加, 固定時(shí)間內(nèi)(5min)抽濾的水樣體積會(huì)逐步增加。靜置60min后抽濾的體積約是初始組抽濾體積的1.7—1.8倍。單因子方差分析顯示隨著靜置時(shí)間的增加, 抽濾體積上存在極顯著差異(F=72.03,P＜0.01)。ANOVA分析結(jié)果顯示,不同靜置時(shí)間的樣品在eDNA濃度上不存在顯著差異(F=3.92,P=0.0544)。靜置雖然能增大單位時(shí)間內(nèi)的抽濾體積, 但并不能提高eDNA產(chǎn)量。隨著靜置時(shí)間的增加, eDNA濃度的變異系數(shù)(標(biāo)準(zhǔn)差/均值×100%)有變大的趨勢(shì), 已經(jīng)接近顯著差異(F=3.37,P=0.052)。靜置處理有可能會(huì)增大eDNA結(jié)果的波動(dòng)性, 使生物量評(píng)估結(jié)果誤差較大(表4、圖4)。

2.5 陽(yáng)離子表面活性劑對(duì)eDNA采集的影響

a、b兩組300 mL水樣中曼氏無(wú)針烏賊eDNA濃度(均值±標(biāo)準(zhǔn)差)分別為(213±37)和(275±48) copies/μL。b組(苯扎氯銨組)eDNA產(chǎn)量約是a組(無(wú)苯扎氯銨組)的1.29倍。ANOVA結(jié)果顯示a、b兩組間存在極顯著差異(F=30.40,P=0.0052)。陽(yáng)離子表面活性劑對(duì)eDNA降解有明顯的抑制作用(圖5)。

2.6 碎膜消化法與去膜消化法比較

去膜法效果優(yōu)于碎膜法(圖6)。碎膜法(a組)與去膜法(b-1組、b-2組和b-3組)的eDNA產(chǎn)量(均值±標(biāo)準(zhǔn)差)分別為： (1290±273)、(1258±177)、(1494±244)和(1941±241) copies/μL。One-way ANOVA結(jié)果顯示： 四組間差異極顯著(F=60.90,P=0.0009)。離心時(shí)間對(duì)去膜法eDNA產(chǎn)量有顯著影響。1min的離心處理效果與碎膜法結(jié)果無(wú)區(qū)別(a組與b-1組：F=8.45,P=0.1008)。隨著離心時(shí)間的增大, b-2組與b-3組的eDNA產(chǎn)量顯著增大, 與b-1組存在顯著差異(F=51.58,P=0.0048)。使用去膜法進(jìn)行eDNA處理時(shí), 應(yīng)增加離心時(shí)間, 使濾膜上的eDNA充分下沉到混合物中。

表3 用三種不同孔徑的濾膜抽濾不同體積的水樣所需的時(shí)間及eDNA產(chǎn)量(均值±標(biāo)準(zhǔn)差)Tab. 3 Time and the yield of eDNA of 3 different filter membrane filting different volume waters (AVE±SD)

圖3 不同孔徑的濾膜效果比較Fig. 3 The comparison of filters with different apertures

表4 五分鐘內(nèi)抽濾的水樣體積及eDNA濃度(均值±標(biāo)準(zhǔn)差)Tab. 4 Water volume and eDNA yield within 5 minutes (AVE±SD)

圖4 靜置時(shí)間對(duì)eDNA獲取的影響Fig. 4 The effect of standing time on eDNA yield

圖5 陽(yáng)離子表面活性劑對(duì)eDNA獲取的影響(a組： 無(wú)苯扎氯銨組; b組： 有苯扎氯銨組)Fig. 5 The effect of cationic surfactanton on eDNA yield(a.without benzalkonium chloride; b. with benzalkonium chloride)

圖6 碎膜消化法與去膜消化法比較Fig. 6 The comparison between membrane removal treatment and fragmentation treatment

2.7 酚抽除沙法對(duì)eDNA提取的影響

去膜法(a組)與酚抽法(b組)兩種方法得到的eDNA產(chǎn)量分別為(2023±454)和(1991±349) copies/μL。One-way ANOVA分析顯示： a、b兩組在eDNA產(chǎn)量上不存在顯著差別(F=0.07,P=0.81)。在產(chǎn)物純度上, 酚抽法優(yōu)于去膜法(A260/A230：F=96.98,P=0.0006;A260/A280：F=59.71,P=0.0015)。酚抽法雖然不能提高eDNA產(chǎn)量, 但能顯著提高產(chǎn)物純度。建議使用酚抽法進(jìn)行eDNA提取(表5、圖7)。

3 討論

3.1 泥沙是影響舟山近海eDNA獲取的關(guān)鍵因素

泥沙不僅直接造成抽濾體積的銳減和抽濾時(shí)間的激增, 還通過增大濾膜折疊處理后的縫隙、滲涸裂解液有效體積、阻礙消化搖勻、堵塞試劑盒離心柱等環(huán)節(jié)影響后續(xù)所有操作。本實(shí)驗(yàn)中, 水樣的極限抽濾(濾膜徹底堵塞)體積很難超過500 mL。而常規(guī)水樣, 一般能達(dá)到1—2 L[37—39]。抽濾300 mL—1 L常規(guī)水樣所需時(shí)間為10min左右[2—8,40], 但本實(shí)驗(yàn)抽濾300 mL水樣需要30min以上。泥沙對(duì)試劑盒離心柱的堵塞作用會(huì)直接導(dǎo)致eDNA提取中斷。

水體中的泥沙等懸浮物粒徑一般在10 μm以上, 而游離的eDNA分子粒徑一般在10 μm以下[3,5,41];在進(jìn)行水樣抽濾之前通常用10—20 μm孔徑的濾網(wǎng)對(duì)水樣中的雜質(zhì)進(jìn)行過濾[42], 可能由于舟山近海高濁度水樣泥沙含量過高同時(shí)泥沙粒徑范圍很大,10、20和30 μm的濾網(wǎng)對(duì)舟山近海水樣無(wú)除雜作用。舟山近海高濁度水樣經(jīng)過處理后得到的eDNA模板溶液常呈淡紅色; 即使模板中的eDNA濃度在102copies/μL以上, 熒光定量PCR結(jié)果也經(jīng)常呈陰性或熒光曲線明顯波動(dòng)。eDNA模板中有大量雜質(zhì)和PCR抑制劑影響模板顏色和qPCR定量檢測(cè)結(jié)果。故本研究使用高靈敏度、高耐受性的數(shù)字PCR進(jìn)行定量檢測(cè)[41]。

表5 去膜法(a組)與酚抽法(b組)兩種方法所得的產(chǎn)物純度(均值±標(biāo)準(zhǔn)差)Tab. 5 Purity comparison between membrane-removed treatment and phenol-chloroform treatment (AVE±SD)

圖7 去膜法(a組)與酚抽法(b組)兩種方法結(jié)果比較Fig. 7 The comparison between membrane removal treatment and phenol treatment

有研究認(rèn)為, 濾膜孔徑越小, eDNA產(chǎn)量就越高[3]。本研究得出的結(jié)論與之不同[3]。在大體積水樣抽濾時(shí), 各種孔徑的濾膜(0.22、0.45和0.70 μm)在抽濾時(shí)間和eDNA產(chǎn)出上無(wú)區(qū)別。這可能是因?yàn)楸狙芯繛楦邼岫人畼? 水樣抽濾時(shí)濾孔易被堵塞。靜置可能會(huì)造成水樣中的泥沙和eDNA同步下沉, 對(duì)eDNA產(chǎn)量的提高無(wú)作用。

總之, 在eDNA提取環(huán)節(jié)中, 除沙效果最有效的途徑是采用傳統(tǒng)的苯酚-氯仿-異戊醇法, 利用離心力的不同隔離掉泥沙。酚抽除沙增加了eDNA提取環(huán)節(jié), 造成DNA損失。它雖然不能提高eDNA產(chǎn)量,卻能顯著提高后續(xù)eDNA提取步驟的流暢度和最終產(chǎn)物的純度, 進(jìn)而增加定量PCR的可靠性。

3.2 eDNA獲取的重要原則

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明： 采樣量增大導(dǎo)致eDNA濃度顯著增大, 而檢測(cè)結(jié)果的變異系數(shù)隨之減小。采樣量較低時(shí), 基于eDNA濃度對(duì)物種相對(duì)生物量的判定結(jié)果誤差會(huì)很大。在野外水體中, 某一物種的eDNA濃度往往很低[41], 為了得到相對(duì)穩(wěn)定的結(jié)果及增加物種的檢出率, 水樣采集過程應(yīng)盡可能增大采樣體積——“量大從優(yōu)”原則。eDNA水樣采集量一般為15 mL—2 L[1—8,32,42], 綜合本研究水量要求、抽濾極值、抽濾時(shí)間、eDNA降解速率等因素, 舟山近海高濁度水樣采集量以300 mL為佳。eDNA獲取的第二個(gè)重要原則是及早處理。隨著放置時(shí)間的加長(zhǎng), eDNA的含量越來(lái)越少[3]。水體中的eDNA室溫下6h內(nèi)約降解60%[37]。本研究推薦在調(diào)查行程中(如出海作業(yè)途中)即進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)抽濾, 抽濾后的濾膜及提取后的eDNA也應(yīng)盡快處理。由于舟山近海高濁度水樣抽濾困難, 抽濾體積的增大直接導(dǎo)致抽濾時(shí)間和eDNA降解量的增加, 因此水樣采集后應(yīng)先加入終止?jié)舛葹?.01%的苯扎氯銨(Benzalkonium chloride)試劑[37]。

3.3 eDNA獲取方法的標(biāo)準(zhǔn)化

水環(huán)境自身的復(fù)雜性給eDNA獲取方法的標(biāo)準(zhǔn)化造成了很大困難。以抽濾體積為例, 為了增大物種的檢出率和結(jié)果的穩(wěn)定性, 原則上要“大體積抽濾”; 為了對(duì)不同時(shí)間、不同站點(diǎn)、不同斷面的結(jié)果進(jìn)行比較, 又需要進(jìn)行“等量抽濾”[20,21,36,39]。本研究發(fā)現(xiàn), 同一采樣點(diǎn)在不同采樣時(shí)間內(nèi)(6h—2d)很難同時(shí)滿足“大體積”及“等量”兩大要求。水樣之間的最大抽濾值有時(shí)差異懸殊, 抽濾時(shí)間也差別明顯。某一地點(diǎn)的水質(zhì)組成(特別是泥沙含量)在短時(shí)間內(nèi)的變化可能是很大的, 這給不同海區(qū)、不同調(diào)查航次之間的eDNA數(shù)據(jù)比較造成了困難。實(shí)際應(yīng)用過程中, 對(duì)常規(guī)水樣可通過預(yù)實(shí)驗(yàn)設(shè)置一個(gè)各站點(diǎn)都普遍能達(dá)到的、統(tǒng)一的大體積抽濾值。但對(duì)高濁度水樣,“統(tǒng)一抽濾值”由于數(shù)值較低, 往往不容易得到高產(chǎn)量eDNA。后續(xù)應(yīng)分多張濾膜抽濾,對(duì)單張濾膜設(shè)置固定抽濾值(如100 mL), 最后用去膜法對(duì)全部濾膜進(jìn)行eDNA提取, 以達(dá)到增加eDNA產(chǎn)量和體積標(biāo)準(zhǔn)化的目的。

同時(shí), 水樣間的差異也造成了提取環(huán)節(jié)標(biāo)準(zhǔn)化的困難。DNeasy Blood 和 Tissue Kit已經(jīng)廣泛利用于常規(guī)水樣eDNA提取[25—27]。本實(shí)驗(yàn)中嘗試用該試劑盒對(duì)舟山近海高濁度水樣進(jìn)行eDNA提取。泥沙很容易吸收掉孵化所需的裂解液, 并影響下一步搖勻。研究表明蛋白酶K的量對(duì)eDNA產(chǎn)量也有顯著影響[2]。根據(jù)樣品情況增加蛋白酶K、STE或AL buffer的用量或許能進(jìn)一步提高eDNA提取的效果。但增大試劑用量又會(huì)導(dǎo)致混合液在后續(xù)操作步驟中溢出離心管。實(shí)驗(yàn)中用10 μL蛋白酶K及400 μL STE裂解液或AL buffer進(jìn)行消化, STE或AL buffer的量在對(duì)泥沙含量較低的樣品處理時(shí)是過量的,對(duì)個(gè)別泥沙含量極高的樣品又是不夠的。本研究建議統(tǒng)一使用700—800 mL混合液對(duì)樣品進(jìn)行消化處理, 并將苯酚除沙操作后的上清液體積控制在500—600 mL, 之后使用2 mL離心管取代1.5 mL離心管進(jìn)行eDNA提取后續(xù)操作。

4 結(jié)論