李丹，朱蕊芳，張東杰

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，大慶 163319）

玉米醇溶蛋白是濕法生產(chǎn)玉米淀粉主要副產(chǎn)物，富含谷氨酰胺，其經(jīng)酶解后具有螯合微量元素的能力[1-2]。微量元素多肽螯合物是由微量元素與多肽物質(zhì)以共價(jià)鍵結(jié)合而形成的有機(jī)微量元素絡(luò)合物，屬新型營(yíng)養(yǎng)素添加劑[3]，相對(duì)比微量元素以無(wú)機(jī)鹽形式進(jìn)入生物體更容易消化吸收[4]、穩(wěn)定性好[5]、生物效價(jià)高[6]、抗干擾性強(qiáng)等，研究?jī)r(jià)值極大。

鋅是人類和動(dòng)物中許多生理功能所需的關(guān)鍵微量營(yíng)養(yǎng)素，缺鋅的發(fā)病率和死亡率逐年上升，引發(fā)全球關(guān)注[7]。生物鋅需要不斷補(bǔ)充，因?yàn)樗饕獊?lái)自飲食，身體鋅儲(chǔ)量有限，替代措施是尋求通過(guò)改善其生物可接近性來(lái)促進(jìn)鋅的生物利用度[8-9]。源自食物的肽可以作為膳食鋅載體使用[10]，楊杰等[11]研究表明魚(yú)蛋白小肽螯合鋅具有明顯的補(bǔ)鋅效果和抗氧化效果，與同等劑量的葡萄糖酸鋅或硫酸鋅效果相當(dāng)。一些研究報(bào)道鋅-蛋氨酸（Zn-Met）可以改善包括仔豬[12]和肉雞在內(nèi)的動(dòng)物的表現(xiàn)[13]。與其他低劑量組相比，高劑量的Zn-Met 可以增加肝臟和脛骨中的鋅含量[14]。Wang 等[16-17]證明適當(dāng)劑量的鋅-甘氨酸（Zn-Gly）可以提高仔豬鋅的組織沉積能力[15]，另外還有其他研究發(fā)現(xiàn)Zn-Gly 可以提高肉雞的生長(zhǎng)性能和改善腸道形態(tài)。

針對(duì)玉米醇溶蛋白的研究，目前主要集中于采用酸性蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶單一或復(fù)合酶解玉米蛋白制備玉米活性肽，而基于蛋白酶K對(duì)玉米醇溶蛋白的酶解作用鮮有報(bào)道。蛋白酶K 是一種絲氨酸蛋白酶，能夠切割脂肪族氨基酸的羧基端肽鍵，將蛋白質(zhì)的羧基暴露，理論上具有增強(qiáng)蛋白水解物螯合微量元素的潛在能力。并且蛋白酶K 的適用pH 范圍廣，尤其在強(qiáng)堿性條件下仍具有較高活性，鑒于玉米醇溶蛋白在堿性條件下表現(xiàn)出較好溶解性這一特點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)采用蛋白酶K 水解玉米醇溶蛋白，以鋅離子螯合能力為評(píng)價(jià)指標(biāo)優(yōu)化水解條件，并評(píng)價(jià)了酶解物清除1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基和羥自由基能力以及ABTS+·清除能力，以期為今后玉米醇溶蛋白鋅離子螯合物的研究開(kāi)發(fā)提供一定理論依據(jù)，為玉米醇溶蛋白在食品中的應(yīng)用提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米醇溶蛋白（蛋白質(zhì)含量86.41%），上海麥克林生化科技有限公司；蛋白酶K（40 U·mg-1），北京索萊寶科技有限公司；亮氨酸，Biosharp 白鯊生物科技；磷酸二氫鈉、硼酸、硼砂、六亞甲基四胺、無(wú)水乙醇，遼寧泉瑞試劑有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽自由基（2，2’-azinobis -（3 -ethylbenzthiazoline -6 -sulphonate）free radical，ABTS+·），合肥博美生物科技有限責(zé)任公司；十二烷基磺酸鈉（SDS）、氫氧化鈉，天津大茂化學(xué)試劑廠；鄰苯二甲醛（OPA）、二甲酚橙，Aladdin；β-巰基乙醇，南京森貝伽生物科技有限公司；硫酸鋅、乙二胺四乙酸、水楊酸、硫酸亞鐵、H2O2、過(guò)硫酸鉀，天津河?xùn)|紅巖試劑廠；試劑均為分析純。

1.1 儀器與設(shè)備

THZ-82 A 水浴恒溫振蕩器，常州潤(rùn)華電器有限公司；SPECORD 210 Plus 全自動(dòng)紫外可見(jiàn)光譜儀，德國(guó)耶拿分析儀器股份公司；DELTA 320 pH 計(jì)，梅特勒-托利多儀器有限公司；5 430 R 冷凍離心機(jī)，Eppendorf 艾本德中國(guó)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 玉米醇溶蛋白酶解工藝流程

將玉米醇溶蛋白作為酶解底物，利用蛋白酶K作用于玉米醇溶蛋白羧基端肽鍵將蛋白質(zhì)水解，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)，考查底物濃度、酶添加量、反應(yīng)時(shí)間和反應(yīng)溫度對(duì)玉米醇溶蛋白鋅離子螯合能力及水解度的影響。

1.3.2 酶解工藝條件單因素試驗(yàn)

將玉米醇溶蛋白配制成濃度為10、20、30、40、50、60 mg·mL-1的溶液，并用0.2 mol·L-1氫氧化鈉溶液將蛋白溶液pH 調(diào)至12.0，封膜冷藏備用。稱取一定量的蛋白酶K，并配制成2.0、2.4、2.8、3.2、3.6、4.0 U·mg-1的酶溶液，分別反應(yīng)1、2、3、4、5、6 h、同時(shí)考查不同反應(yīng)溫度（45、50、55、60、65、70 ℃）對(duì)酶解反應(yīng)水解度及水解產(chǎn)物鋅離子螯合能力的影響，按照1.3.3.1 和1.3.3.2 分別計(jì)算水解度和鋅離子螯合能力。在最適酶解條件下制備玉米醇溶蛋白水解物，凍干備用。

1.3.3 指標(biāo)的測(cè)定

1.3.3.1 水解度測(cè)定

OPA 溶液配制[18]：準(zhǔn)確稱取2.00 g 十二烷基磺酸鈉（SDS），加入30 mL 0.4 moL·L-1的硼酸緩沖液（pH9.5），溶解完全后再加入1 mL，80 mg·mL-1的OPA 溶液（無(wú)水乙醇溶解）和200 μL β-巰基乙醇，最后用pH 9.5 的硼酸緩沖液定容至100 mL。此溶液現(xiàn)用現(xiàn)配。

測(cè)定方法：首先配制600 μg·mL-1的亮氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，再將其稀釋成濃度為（0、12、18、24、30、36 μg·mL-1）的溶液，不同濃度的稀釋液與OPA 試劑等體積混合，精準(zhǔn)反應(yīng)5 min，立即測(cè)定混合液在340 nm 處的吸光度值；亮氨酸濃度和吸光度值分別設(shè)定為橫縱坐標(biāo)，繪制亮氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。取1 mL 玉米醇溶蛋白酶解物稀釋100 倍，按照上述方法測(cè)定稀釋酶解物的吸光值。樣品中游離氨基的濃度（μmoL·mL-1）根據(jù)亮氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線所得公式計(jì)算。水解度計(jì)算方法如公式（1）。

式中：A 為樣品濃度（mg·mL-1），hT為樣品蛋白質(zhì)的總肽鍵數(shù)（7.8 mmol·g-1）

1.3.3.2 Zn2+螯合能力測(cè)定

在Wang 等[19]的方法基礎(chǔ)上稍加改動(dòng)測(cè)定鋅離子螯合能力。

鋅離子-肽螯合反應(yīng)：在50 mL 三角瓶中加入1 mL 0.05 mol·L-1的硫酸鋅溶液（乙醇溶解），再緩慢加入10 mL 5 mg·mL-1樣品溶液（用體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇溶解1.3.2 獲得的水解產(chǎn)物），25 ℃水浴搖床振蕩反應(yīng)1 h，直至生成白色沉淀。

螯合態(tài)鋅離子含量的測(cè)定：將上述反應(yīng)液中白色沉淀濃縮至近干后加15 mL 無(wú)水乙醇，混勻，4 ℃、5 000 r·min-1離心20 min。將沉淀懸浮于蒸餾水中并定容至50 mL。用EDTA 絡(luò)合滴定的方法確定螯合態(tài)鋅的含量。吸取20 mL 容量瓶中的溶液至錐形瓶中，分別滴加兩滴二甲酚橙指示劑（0.5%水溶液）和數(shù)滴質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%的六亞甲基四胺—鹽酸緩沖溶液（pH5.0），直至溶液呈穩(wěn)定的紫色后再加入4 mL 緩沖液，用已標(biāo)定的0.001 mol·L-1EDTA 溶液滴定至溶液由紫紅色變成黃色，并記錄EDTA 的消耗量（V）。用蒸餾水代替樣品做空白對(duì)照，并重復(fù)上述試驗(yàn)，記錄EDTA 的消耗量（V0）。沉淀中Zn2+含量以及樣品Zn2+螯合能力計(jì)算方法見(jiàn)公式（2）和（3）。

式中：AP為沉淀中Zn2+含量（mg），P 為樣品蛋白質(zhì)含量（g），C 為EDTA 濃度（0.001 mol·L-1），V 為樣品滴定過(guò)程中消耗EDTA 的體積（mL），V0為空白試驗(yàn)消耗的EDTA 的體積（mL）。

1.3.4 玉米醇溶蛋白肽螯合物抗氧化實(shí)驗(yàn)

在最適反應(yīng)條件下獲得玉米醇溶蛋白水解物，并參照1.3.3.2 中鋅-肽螯合反應(yīng)，制備玉米醇溶蛋白水解物鋅離子螯合物（ZK），凍干備用。

1.3.4.1 DPPH 自由基清除率的測(cè)定

參考趙聰?shù)萚20]和Mehmet 等[21]的方法，準(zhǔn)確配制濃度為0.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mg·mL-1的ZK 樣品溶液，分別取2 mL 不同濃度的樣品溶液于試管中，依次加入1 mL 0.2 mol·L-1磷酸鹽緩沖液（pH 6.6），2 mL 0.1 mmol·L-1的DPPH 溶液，混合搖勻，室溫下避光靜置30 min。于517 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，蒸餾水作為空白對(duì)照。同時(shí)用0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg·mL-1的VC 溶液作陽(yáng)性對(duì)照。DPPH 自由基清除率計(jì)算方法見(jiàn)公式（4）。

式中：A0為樣品或VC 的吸光度，A1為樣品或VC 加DPPH 的吸光度，A2為DPPH 的吸光度。

1.3.4.2 羥基自由基清除率的測(cè)定

參照TIAN 等[22]和Liu 等[23]的方法，分別取2 mL濃度為0.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mg·mL-1的ZK 樣品溶液于試管中，分別依次加入3 mL 蒸餾水、0.5 mL 6 mmol·L-1水楊酸溶液、0.5 mL 6 mmol·L-1FeSO4溶液、1 mL 6 mmol·L-1的H2O2溶液，混合搖勻，室溫下避光靜置30 min。于510 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，蒸餾水作為空白對(duì)照。同時(shí)用0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg·mL-1的VC 溶液作陽(yáng)性對(duì)照。羥自由基清除率計(jì)算方法見(jiàn)公式（5）。

式中：A0為樣品或VC 加蒸餾水的吸光度，A1為樣品或VC 的吸光度，A2為樣品溶液換成等量蒸餾水的吸光度。

1.3.4.3 ABTS+·清除率的測(cè)定

ABTS 溶液的配制：用0.2 mol·L-1的磷酸緩沖溶液將0.1 g ABTS+·和0.029 g 過(guò)硫酸鉀溶解，定容至100 mL，混合后用錫箔紙包緊于25 ℃避光反應(yīng)16 h備用，吸取2 mL 該反應(yīng)液和18 mL 磷酸鹽緩沖液混合配成ABTS+·儲(chǔ)備液，避光儲(chǔ)存現(xiàn)用現(xiàn)配。用上述磷酸鹽緩沖液稀釋ABTS+·儲(chǔ)備液，于波長(zhǎng)734 nm 處測(cè)吸光度值為0.85 左右，即確定為ABTS+·工作液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

測(cè)定方法：0.1 mL ZK 樣品溶液和3.9 mL ABTS+·工作液混勻室溫靜置10 min，在波長(zhǎng)734 nm 處測(cè)定吸光度A1，以試樣溶劑代替樣品溶液測(cè)定空白吸光度值A(chǔ)0，以磷酸鹽緩沖液代替ABTS+·工作液測(cè)得吸光度值A(chǔ)2；VC 做陽(yáng)性對(duì)照[24-26]。ABTS+·清除率計(jì)算方法見(jiàn)公式（6）。

1.4 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel 2007 和Origin 8.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和做圖，用SPSS 22.0 進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 反應(yīng)時(shí)間對(duì)玉米醇溶蛋白Zn2+螯合能力的影響

在反應(yīng)體系pH 值為12，底物濃度10 mg·mL-1、酶添加量2.8 u·mg-1、反應(yīng)溫度60 ℃條件下，考察反應(yīng)時(shí)間對(duì)玉米醇溶蛋白Zn2+螯合能力及水解度的影響，如圖1 所示。

圖1 反應(yīng)時(shí)間對(duì)玉米醇溶蛋白水解度及其水解物鋅離子螯合能力的影響Fig.1 Effect of reaction time on Zn2+chelating ability and degree of hydrolysis of zein and hydrolysate

由圖1 可知，隨著反應(yīng)時(shí)間增加，水解度呈現(xiàn)逐漸上升且趨于平緩的趨勢(shì)，而Zn2+螯合能力先增加后下降，在反應(yīng)2 h 的時(shí)候Zn2+螯合能力達(dá)到最大值9.95 mg·g-1，此時(shí)所對(duì)應(yīng)水解度為6.18%。反應(yīng)2 h 的Zn2+螯合能力顯著高于其他酶解時(shí)間玉米醇溶蛋白的螯合能力，故反應(yīng)最佳時(shí)間選為2 h。隨著反應(yīng)時(shí)間增加，且初始底物濃度相對(duì)較大，酶與底物接觸時(shí)間延長(zhǎng)，接觸幾率相對(duì)較高，故水解度呈現(xiàn)上升趨勢(shì)；隨后底物濃度下降，蛋白酶K 可作用位點(diǎn)減少，酶催化反應(yīng)趨于平衡狀態(tài)，水解度成平緩趨勢(shì)。

2.1.2 底物濃度對(duì)玉米醇溶蛋白Zn2+螯合能力的影響

在反應(yīng)體系pH 值為12，反應(yīng)時(shí)間2 h、酶添加量2.8 U·mg-1、反應(yīng)溫度60 ℃條件下，考察底物濃度對(duì)玉米醇溶蛋白Zn2+螯合能力及水解度的影響，如圖2 所示。

圖2 底物濃度對(duì)玉米醇溶蛋白水解度及其水解物鋅離子螯合能力的影響Fig.2 Effect of substrate concentration on Zn2+chelating ability and degree of hydrolysis of zein and hydrolysate

由圖2 可知，隨著玉米醇溶蛋白的濃度增加，玉米醇溶蛋白Zn2+螯合能力及水解度呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在玉米醇溶蛋白濃度達(dá)到10 mg·mL-1時(shí)，Zn2+螯合能力達(dá)到最大值9.95 mg·g-1，此時(shí)所對(duì)應(yīng)水解度為6.18%，故選定玉米醇溶蛋白濃度為10 mg·mL-1進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。底物濃度過(guò)低，減少底物與酶的結(jié)合機(jī)會(huì)，Zn2+螯合能力及水解度相對(duì)低；反應(yīng)體系分子黏度隨著底物濃度增大，蛋白不能充分浸潤(rùn)，即使在加熱作用下分子運(yùn)動(dòng)相對(duì)減緩，不利于蛋白與酶活性部位的結(jié)合，多肽也會(huì)隨之減少，可能與Zn2+結(jié)合的分子也產(chǎn)生較少，所以Zn2+螯合能力隨著底物濃度增大而降低；玉米醇溶蛋白中可能含有一定的蛋白酶抑制劑，能與蛋白酶K 作用于玉米醇溶蛋白競(jìng)爭(zhēng)蛋白酶的結(jié)合集團(tuán)，產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用，隨著玉米醇溶蛋白濃度增大，蛋白酶K 含量相對(duì)減少，同時(shí)抑制性蛋白酶含量相對(duì)會(huì)增加，導(dǎo)致玉米醇溶蛋白不能水解完全，水解度出現(xiàn)下降，且Zn2+螯合能力大幅度下降。

2.1.3 酶添加量對(duì)玉米醇溶蛋白Zn2+螯合能力的影響

在反應(yīng)體系pH 值為12，反應(yīng)時(shí)間2 h、底物濃度10 mg·mL-1、反應(yīng)溫度60 ℃條件下，考察酶添加量對(duì)玉米醇溶蛋白Zn2+螯合能力及水解度的影響，如圖3 所示。

圖3 酶添加量對(duì)玉米醇溶蛋白水解度及其水解物鋅離子螯合能力的影響Fig.3 Effect of enzyme addition on Zn2+chelating ability and degree of hydrolysis of zein and hydrolysate

由圖3 可知，在加酶量2.0～2.4 U·mg-1范圍內(nèi)，Zn2+螯合能力呈現(xiàn)小幅度上升的趨勢(shì)，但是在酶添加量為2.8 U·mg-1時(shí)，Zn2+螯合能力突然下降，在加酶量2.8～4.0 U·mg-1范圍內(nèi)呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)；在酶添加量為2.4 U·mg-1時(shí)Zn2+螯合能力相對(duì)較高，達(dá)到12.16 mg·g-1，此時(shí)對(duì)應(yīng)的水解度為4.10%，且從經(jīng)濟(jì)角度出發(fā)，酶添加量選擇2.4 U·mg-1。Zn2+螯合能力突然下降可能是因?yàn)樵诿柑砑恿繛?.8 U·mg-1時(shí)可溶性多肽被進(jìn)一步水解為游離氨基酸，螯合活性也隨之降低。水解度隨著酶添加量呈現(xiàn)先大幅度增加后趨于平緩的趨勢(shì)，隨著酶添加量不斷增加，酶與底物活性部位結(jié)合的幾率也增加，水解度呈現(xiàn)大幅上升的趨勢(shì)；隨著酶不斷增加，玉米醇溶蛋白可作用活性部位相對(duì)減少，反應(yīng)速度降慢，水解度呈現(xiàn)平緩的趨勢(shì)。

2.1.4 反應(yīng)溫度對(duì)玉米醇溶蛋白Zn2+螯合能力的影響

在反應(yīng)體系pH 值為12，反應(yīng)時(shí)間2 h、底物濃度10 mg·mL-1、酶添加量2.4 U·mg-1條件下，考察反應(yīng)溫度對(duì)玉米醇溶蛋白Zn2+螯合能力及水解度的影響，如圖4 所示。

圖4 反應(yīng)溫度對(duì)玉米醇溶蛋白水解度及其水解物鋅離子螯合能力的影響Fig.4 Effect of reaction temperature on Zn2+chelating ability and degree of hydrolysis of zein and hydrolysate

由圖4 可知，玉米醇溶蛋白Zn2+螯合能力及水解度隨著反應(yīng)溫度呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，溫度對(duì)酶解反應(yīng)有雙重作用，在溫度45～60 ℃范圍內(nèi)，溫度升高，反應(yīng)體系分子熱運(yùn)動(dòng)速度加快，水解度逐步提高，可能產(chǎn)生Zn2+螯合活性較高的多肽，因此水解度和Zn2+螯合能力在此溫度范圍內(nèi)逐步升高，Zn2+螯合能力達(dá)到最大值12.16 mg·g-1，此時(shí)所對(duì)應(yīng)水解度為4.10%；溫度繼續(xù)升高，對(duì)蛋白酶K 產(chǎn)生破壞作用，酶活性降低，與玉米醇溶蛋白作用幾率減少，產(chǎn)生Zn2+螯合活性較高的多肽含量減少，Zn2+螯合率和水解度也隨之降低，故反應(yīng)溫度選在60 ℃。

綜上，以玉米醇溶蛋白與Zn2+螯合的能力為主要考察指標(biāo)，確定的最適反應(yīng)條件為：玉米醇溶蛋白濃度10 mg·mL-1、酶添加量2.4 U·mg-1、反應(yīng)溫度60 ℃、反應(yīng)時(shí)間2 h。

2.2 玉米醇溶蛋白鋅螯合物抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 玉米醇溶蛋白鋅離子螯合物對(duì)DPPH 自由基清除效果

由圖5 可知，玉米醇溶蛋白鋅離子螯合物（ZK）DPPH 自由基清除效果隨著其濃度的增加而顯著逐步增加，且清除效果顯著高于（P<0.5）未反應(yīng)玉米醇溶蛋白（Zein），在ZK 濃度增大到10 mg·mL-1時(shí)，DPPH自由基清除率為88.27%，較之未反應(yīng)玉米醇溶蛋白的DPPH 清除率（60.10%），提高了28.17%；Vc 溶液DPPH 自由基清除率在其濃度0.2 mg·mL-1時(shí)達(dá)到最大值84.57%，濃度繼續(xù)增大時(shí)，其清除效果趨于恒定；在ZK 濃度達(dá)到8 mg·mL-1時(shí)，DPPH 自由基清除率接近Vc 溶液的清除率，當(dāng)濃度大于8 mg·mL-1時(shí)，ZK 的DPPH 自由基清除率效果稍高于Vc 溶液的。木瓜蛋白酶解油茶籽粕蛋白所得水解物對(duì)DPPH 自由基清除效果達(dá)到85%以上，較ZK 對(duì)DPPH 自由基清除效果稍顯著，且有較好的金屬離子螯合能力[27]；劉曉霏[28]采用堿性蛋白酶酶解玉米黃粉，其酶解產(chǎn)物DPPH 清除率達(dá)到77.15%，研究中ZK 的DPPH清除效果顯著優(yōu)于基于堿性蛋白酶水解的玉米黃粉酶解產(chǎn)物。

圖5 玉米醇溶蛋白及其鋅離子螯合物對(duì)DPPH 自由基清除效果Fig.5 DPPH radical scavenging capacity of zein and zein-Zn2+chelate

2.2.2 玉米醇溶蛋白鋅離子螯合物對(duì)羥自由基清除效果

由圖6 可知，ZK 的羥自由基清除效果顯著優(yōu)于未反應(yīng)玉米醇溶蛋白（Zein）（P<0.05），且隨著ZK 濃度增大羥自由基清除效果顯著增強(qiáng)，當(dāng)ZK 的濃度增大到10 mg·mL-1時(shí)，羥自由基及清除率達(dá)到88.60%，而未反應(yīng)玉米醇溶蛋白的清除率為65.46%，提高了23.14%，ZK 羥自由基清除效果增強(qiáng)趨勢(shì)同于Vc 溶液，但Vc 溶液清除效果優(yōu)于ZK。1.0 mg·mL-1的Vc溶液羥自由基清除率達(dá)到94.97%，有極強(qiáng)的羥自由基清除效果。胡二坤等[29]采用堿性蛋白酶酶解玉米醇溶蛋白，酶解產(chǎn)物的羥自由基清除效果達(dá)到60%～70%，比較而言，實(shí)驗(yàn)中ZK 的羥自由基清除效果更顯著。

圖6 玉米醇溶蛋白及其鋅離子螯合物對(duì)羥自由基清除效果Fig.6 Hydroxyl radical scavenging capacity of zein and zein-Zn2+chelate

2.2.3 玉米醇溶蛋白鋅離子螯合物對(duì)ABTS+·清除效果

由圖7 可知，10 mg·mL-1的ZK 和未反應(yīng)的玉米醇溶蛋白ABTS+·清除率分別為77.22%和61.65%，ZK 的ABTS+·清除率相對(duì)于未反應(yīng)的玉米醇溶蛋白顯著提高了15.57%，但均低于相同濃度下Vc 對(duì)ABTS+·的清除效果。研究表明，蛋白質(zhì)的抗氧化活性與其分子量和疏水性有顯著相關(guān)性[30]。李雪芬等[31]研究發(fā)現(xiàn)蠶豆蛋白酶解物的銅離子螯合活性越高，其抗氧化活性越高。代衍峰[30]采用堿性蛋白酶酶解玉米蛋白，濃度為10 mg·mL-1水解物對(duì)ABTS+·清除率58.00%，略低于本研究中同濃度的ZK 對(duì)ABTS+·的清除效果。同是植物蛋白，400 mg·mL-1的玉米胚芽粕清蛋白酶解產(chǎn)物對(duì)ABTS+·的清除率為82.87%[32]，也遜色于研究中ZK 的清除效果。

3 結(jié)論

選用蛋白酶K 對(duì)玉米醇溶蛋白進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)確定了以Zn2+螯合能力為指標(biāo)的蛋白酶K水解玉米醇溶蛋白的最適條件為：在pH 12 的反應(yīng)條件下，底物濃度10 mg·mL-1、酶添加量2.4 U·mg-1、反應(yīng)溫度60 ℃、反應(yīng)時(shí)間2 h。在最佳酶解條件下玉米醇溶蛋白Zn2+螯合能力達(dá)到12.16 mg·g-1，對(duì)應(yīng)水解度為4.10%。在抗氧化實(shí)驗(yàn)中，玉米醇溶蛋白鋅離子螯合物清除DPPH 自由基、羥自由基和ABTS+·的效果均顯著優(yōu)于未反應(yīng)的玉米醇溶蛋白，為今后新型膳食補(bǔ)充劑研究提供理論及數(shù)據(jù)支持。

圖7 玉米醇溶蛋白及其鋅離子螯合物對(duì)ABTS+·清除效果Fig.7 ABTS+·scavenging capacity of zein and zein-Zn2+chelate