張萌萌, 陳宏灝, 王文凱, 陳 立

(1.寧夏農(nóng)林科學(xué)院植物保護研究所, 銀川750002; 2.長江大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 湖北荊州 434000;3.中國科學(xué)院動物研究所, 農(nóng)業(yè)蟲害鼠害綜合治理研究國家重點實驗室, 北京100101;4.河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 生命科學(xué)與綠色發(fā)展研究院, 河北保定 071002)

東方絹金龜Maladeraorientalis，又名黑絨金龜、天鵝絨金龜子、東方金龜子等，屬鞘翅目(Coleoptera)鰓金龜科(Scarabaeidae)，是重要的農(nóng)林害蟲(劉廣瑞等, 1997; 喬志文等, 2014)，主要分布于我國華北、東北和西北地區(qū)，以及朝鮮、日本和蒙古(喬志文等, 2014; 師二帥, 2014)。東方絹金龜一年發(fā)生1代，以成蟲在土中越冬，越冬成蟲在4月上旬開始出土直至6月末，4月末至6月上旬為成蟲為害盛期(白文輝, 1981)。該蟲適應(yīng)性強，食性雜，可為害149種植物，分屬于45科116屬(劉廣瑞等, 1997)。成蟲喜食豆類、甜菜和林木、果樹的嫩芽、幼苗(賀達漢等, 2000; 陳博和陳磊, 2016)，幼蟲則對農(nóng)作物及苗木根系造成嚴重危害(韓國君等, 2002)。成蟲有假死性和趨光性，多在傍晚出土活動，約在17時出土取食，18-20時數(shù)量最多(喬志文等, 2014)。目前，防治東方絹金龜?shù)闹饕椒òㄕ衤洳稓?、黑光燈誘殺、噴灑農(nóng)藥以及利用白僵菌Beauveria制劑、TS1線蟲、蘇云金桿菌Bacillusthuringiensis制劑處理土壤等(胡長林和李莉, 2002; 賀曉紅, 2004; 孫瑞紅等, 2008; 馬慶州等, 2009; 許玉國和孫久勝, 2012; 周興武和丁廣州, 2012)。但是這些方法存在費時費力、污染環(huán)境、靶標害蟲選擇性差、防治效果有限等弊端，因此探索高效、環(huán)境相容性好的防治方法是害蟲治理的上策。植物源引誘劑具有省力、高效、環(huán)境安全、害蟲不易產(chǎn)生抗性等特點(李為爭等, 2013; 滕小慧等, 2017)，有可能成為防治金龜甲類害蟲的一個重要途徑(龔恒亮等, 2013)。

植物揮發(fā)性物質(zhì)在昆蟲-植物關(guān)系中起著重要的作用，寄主植物可通過自身釋放的揮發(fā)性物質(zhì)影響昆蟲的取食與產(chǎn)卵行為，而植食性昆蟲則能利用寄主植物和非寄主植物釋放的化學(xué)物質(zhì)來識別、定位寄主(Knolhoff and Heckel, 2014; Sunetal., 2014)。例如，六月金龜Phyllophagacuyabana偏好取食大豆，在大豆田的產(chǎn)卵量顯著高于棉花田，說明金龜甲成蟲能夠利用植物揮發(fā)物選擇更適宜后代生存的寄主(Oliveiraetal., 2007)；白星花金龜Potosiabrevitarsis和小青花金龜Oxycetoniajucunda能夠利用玫瑰花揮發(fā)物中的順-3-己烯醇進行寄主定位(李仲秀等, 1995; 王廣利和孫凡, 2005)；蒲公英花揮發(fā)物中的順-3-己烯醇乙酸酯、苯甲醛、苯乙醛、苯乙醇、苯甲酸苯酯可引起扁綠異麗金龜Anomalaoctiescostata的強烈趨向行為(Lealetal., 1994)；丙酸苯乙酯、丁子香酚和香葉醇(3∶7∶3, v/v)的混合物對日本麗金龜Popilliajaponica的引誘效果最佳，已被廣泛應(yīng)用于誘殺與監(jiān)測(Leal, 1998)。

桃樹是多種金龜甲的寄主植物，一株樹上可有十幾頭甚至幾十頭金龜子集中取食，輕者吃成花葉，重者只殘留葉脈，被為害的桃樹會推遲結(jié)果甚至形成小老樹以至枯死(渾志英和張之新, 1992; 李婭婭等, 2018)。本研究根據(jù)金龜子成蟲利用植物揮發(fā)物進行寄主定位的行為特點，通過動態(tài)頂空吸附法收集桃樹枝葉揮發(fā)物，采用氣相色譜觸角電位(GC-EAD)和氣質(zhì)聯(lián)用(GC-MS)技術(shù)鑒定揮發(fā)物中對東方絹金龜具有觸角電生理活性的化學(xué)物質(zhì)，并對這些物質(zhì)的行為活性進行測試，期望為開發(fā)高效、環(huán)保的東方絹金龜植物源引誘劑提供重要依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料和儀器

1.1.1供試昆蟲：東方絹金龜雌成蟲，采集于北京市朝陽區(qū)中國科學(xué)院奧運村園區(qū)內(nèi)，用桃樹葉飼養(yǎng)。

1.1.2供試植物：選取北京市朝陽區(qū)中國科學(xué)院奧運村園區(qū)內(nèi)的桃樹作為供試植物。

1.1.3主要試劑與儀器：采樣袋(60 cm×80 cm, Reynolds Oven Bag，美國)；吸附劑Porapak Q(80-100目，Supelco，美國)；吸附管(內(nèi)徑5 mm)；大氣采樣儀QC-1S型(北京市勞動保護科學(xué)研究所，北京)；觸角電位儀(Syntech, Kirchzarten，德國)；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(7890A-5975C, Agilent Technology，美國)；氣相色譜儀(GC-2010plus, Shimaduz，日本)。色譜純正己烷、二氯甲烷購自上海安譜科學(xué)儀器有限公司；供試揮發(fā)性氣味物質(zhì)的編號、標準化合物名稱、相對分子質(zhì)量和純度見表1，均購自北京百靈威科技有限公司。

1.2 寄主植物桃樹的選取和揮發(fā)物收集

在中國科學(xué)院奧運村園區(qū)內(nèi)，選取5棵桃樹，每棵樹重復(fù)2次，在東方絹金龜出土高峰段(18∶00-20∶00時)采集桃樹揮發(fā)物。參考李婭婭等(2018)的動態(tài)頂空吸附法，選取等量無病害且長勢良好的枝條，用采樣袋將枝條套住。然后在枝條基部放入裝有活性炭的玻璃管(長20 cm，內(nèi)徑5 cm)，用繩子將采樣袋連同枝條和玻璃管綁緊，在袋子頂端剪開一小口插入吸附管，用線繩綁緊，保證枝條完整且采樣袋不漏氣，用Teflon管依次連接吸附管的一端、氣體流量計和大氣采樣儀進氣口。吸附管裝有200 mg的吸附劑。大氣采樣儀流速設(shè)定為500 mL/min。采集時間為2 h。采集完成后立即用濃度為5 ng/μL的苯甲酸甲酯二氯甲烷溶液(苯甲酸甲酯為內(nèi)標)洗脫吸附管，得到0.5 mL洗脫液置于-20℃冰箱內(nèi)備用。

1.3 桃樹揮發(fā)物中EAD活性成分的鑒定

采用Agilent 7890A-5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀對收集的桃樹揮發(fā)物洗脫液分別進行組分分析。色譜柱為DB-WAX毛細管柱(30 m×250 μm×0.25 μm)，進樣量2 μL，無分流進樣。柱溫升溫程序：起始溫度40℃，保持1 min，以5℃/min升至180℃，再以10℃/min升至240℃，保持4 min。溶劑延遲5 min。進樣口溫度230℃，離子源溫度250℃，質(zhì)譜電離方式為EI，電離能量為70 eV，掃描質(zhì)量范圍40～500 amu。

根據(jù)質(zhì)譜數(shù)據(jù)檢索NIST08質(zhì)譜庫鑒定觸角電位(EAG)活性成分的結(jié)構(gòu)，并用標準品配制濃度為0.1 μg/μL的正己烷溶液，采用上述升溫程序進行保留時間和質(zhì)譜驗證。

1.4 東方絹金龜雌成蟲對桃樹揮發(fā)物的GC-EAD反應(yīng)

測定所用的設(shè)備和技術(shù)參考Chen等(2019)。氣相色譜柱為DB-WAX毛細管柱(規(guī)格同上)，無分流進樣。起始溫度40℃，保持2 min，以5℃/min升至120℃，再以15℃/min升至240℃，保持4 min。進樣口溫度230℃，檢測器溫度為240℃。載氣為氮氣，流速為2 mL/min。以充滿導(dǎo)電液(750 mg/mL NaCl, 35 mg/mL KCl, 29 mg/mL CaCl2·2H2O的水溶液)的毛細管作為電極，快速切下東方絹金龜雌成蟲觸角，切口端與參比電極相連，觸角中間鰓瓣頂端接觸記錄電極。電極內(nèi)用銀-氯化銀絲連接信號探針(EAG Combi Probe, Syntech, Kirchzarten, 德國)，使用GC-EAD軟件(GC/EAD32, version 4.4, Syntech)記錄和分析數(shù)據(jù)。

每次取3 μL樣品進行試驗，至少得到5個成功的GC-EAD結(jié)果。若一種物質(zhì)能引起觸角強烈反應(yīng)且能重復(fù)3次以上，則視為電生理活性物質(zhì)。結(jié)合GC-MS結(jié)果，從而鑒定出對東方絹金龜雌成蟲觸角產(chǎn)生電生理反應(yīng)的物質(zhì)。

1.5 東方絹金龜雌成蟲對EAD活性揮發(fā)物標準品的EAG反應(yīng)

選擇由GC-EAD和GC-MS所鑒定出的活性化合物(表1)，用1 mL正己烷作溶劑將各化合物分別配制成濃度為0.1, 1和10 μg/μL的溶液，以正己烷作為對照進行觸角電位測定。

測定所用的設(shè)備和技術(shù)參考李婭婭等(2018)。觸角連接方法同上述GC-EAD操作，使用EAG 2000軟件(Syntech, Kirchzarten, 德國)記錄和分析數(shù)據(jù)。取10 μL待測樣品，均勻地滴在40 mm×5 mm濾紙條上，待溶劑揮發(fā)15 s后放入玻璃巴斯德管中，密閉平衡40 s后用于刺激觸角連接。吹向觸角連接的濕潤空氣的流速為1 L/min。按隨機方式測試樣品，每次刺激時間為0.2 s，刺激間隔為2 min。用正己烷對照的EAG值校正樣品的EAG值。

1.6 東方絹金龜雌成蟲對EAD活性揮發(fā)物標準品的行為反應(yīng)

使用表1中的標準品，用1 mL正己烷作溶劑將各化合物配制成濃度為10 μg/μL的溶液，以正己烷作為對照，測定東方絹金龜成蟲對桃樹揮發(fā)物的行為選擇。

Y型嗅覺儀生物測定裝置參考李俊龍等(2019)。測試時，用移液槍吸取10 μL揮發(fā)物或正己烷滴在1 cm2的定性濾紙上，并置于味源瓶中。通過聚四氟乙烯軟管將活性炭空氣過濾裝置、QC-1B型采樣儀、蒸餾水加濕瓶以及Y型管相連，空氣流速控制在500 mL/min。每10頭東方絹金龜雌成蟲為一組，重復(fù)5次。每次只放1頭東方絹金龜雌成蟲進行行為選擇，每頭試蟲觀察15 min，將進入選擇臂且超過選擇臂1/2以上并停留超過30 s的記為有選擇，否則記為無選擇。每測試一頭試蟲后將Y型管兩支臂互換，并空吹20 min，每5頭測試完成后，將整個系統(tǒng)中的玻璃儀器清洗，放入烘箱，溫度為180℃，時間為30 min。

1.7 數(shù)據(jù)分析

觸角電位數(shù)據(jù)均為校正后的EAG反應(yīng)絕對值，即將樣品EAG測量值減去空白對照的EAG測量值。用SPSS 18.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，東方絹金龜雌成蟲的EAG反應(yīng)絕對值(平均值±標準誤，n=7)采用Tukey-HSD檢驗，比較分析東方絹金龜雌成蟲對不同測試樣品的EAG反應(yīng)的差異顯著性；行為試驗數(shù)據(jù)采用卡方檢驗，比較東方絹金龜雌成蟲對不同揮發(fā)物行為反應(yīng)的差異顯著性，并通過以下公式計算選擇率：

選擇率(%)=處理臂內(nèi)的總蟲數(shù)或?qū)φ毡蹆?nèi)的總蟲數(shù)/做出選擇的總蟲數(shù)×100%。

2 結(jié)果

2.1 東方絹金龜雌成蟲對桃樹揮發(fā)物的GC-EAD反應(yīng)

GC-EAD結(jié)果表明，有6種桃樹揮發(fā)物成分可重復(fù)引起東方絹金龜雌成蟲的EAD反應(yīng)(圖1)，經(jīng)GC-MS鑒定分別為反-2-己烯醛、順-3-乙酸己烯酯、反-3-己烯醇、順-3-己烯醇、水楊酸甲酯以及1種未知化合物，其相對含量見表2。內(nèi)標苯甲酸甲酯也能引起東方絹金龜雌成蟲明顯的EAD反應(yīng)。

圖1 東方絹金龜雌成蟲對桃樹揮發(fā)物的GC-EAD反應(yīng)

表2 桃樹揮發(fā)物中EAD活性物質(zhì)的相對含量

2.2 東方絹金龜雌成蟲對5種桃樹揮發(fā)物成分的EAG反應(yīng)

東方絹金龜雌成蟲觸角在不同劑量下對5種桃樹揮發(fā)物成分及苯甲酸甲酯都有明顯的EAG反應(yīng)。隨著劑量增大，EAG反應(yīng)越強烈。當揮發(fā)物成分的劑量分別為1和10 μg時，東方絹金龜雌成蟲觸角對反-2-己烯醛的反應(yīng)顯著大于對其余4種揮發(fā)物成分的反應(yīng)(1 μg:P<0.0001; 10 μg:P<0.0001)；當揮發(fā)物成分的劑量為100 μg時，東方絹金龜雌成蟲對反-3-己烯醇和水楊酸甲酯的反應(yīng)最強烈，EAG反應(yīng)值均為2.810 mV；對順-3-己烯乙酸酯的反應(yīng)最小，EAG反應(yīng)值約為1.209 mV，顯著低于對其余4種揮發(fā)物成分的反應(yīng)(P<0.0001)。

2.3 東方絹金龜雌成蟲對5種桃樹揮發(fā)物成分的行為反應(yīng)

利用Y型嗅覺儀，分別測試了東方絹金龜雌成蟲對5種桃樹揮發(fā)物成分及苯甲酸甲酯在劑量為100 μg時與正己烷對照之間的選擇性(圖3)。結(jié)果表明，100 μg的反-3-己烯醇、順-3-己烯醇和苯甲酸甲酯對東方絹金龜雌成蟲都表現(xiàn)出顯著的吸引作用，其中選擇反應(yīng)率最高的是順-3-己烯醇和苯甲酸甲酯，均為64%；其余3種桃樹揮發(fā)物樣品對東方絹金龜雌成蟲沒有表現(xiàn)出顯著的吸引或驅(qū)避作用。

圖2 東方絹金龜雌成蟲對不同劑量的桃樹揮發(fā)物成分及苯甲酸甲酯的EAG反應(yīng)

圖3 東方絹金龜雌成蟲對桃樹揮發(fā)物成分及苯甲酸甲酯(100 μg)的行為反應(yīng)

3 討論

本研究鑒定了在東方絹金龜寄主定位中發(fā)揮作用的桃樹揮發(fā)物成分。首先，利用GC-EAD和GC-MS技術(shù)鑒定出了6種有EAD活性的桃樹揮發(fā)物成分，包括醛類、醇類和酯類及1種未知化合物，其中酯類含量最高，約占30%。其次，測試了東方絹金龜雌成蟲觸角對不同劑量揮發(fā)物成分的EAG反應(yīng)，結(jié)果表明隨著測試的揮發(fā)物成分劑量升高EAG反應(yīng)值增大。最后，通過行為生測試驗發(fā)現(xiàn)反-3-己烯醇和順-3-己烯醇對東方絹金龜雌成蟲具有顯著的吸引作用。

這幾種植物揮發(fā)物對其他金龜甲的吸引作用已有報道。例如，順-3-己烯醇對庭園發(fā)麗金龜Phylloperthahorticola有強烈的吸引作用(Rutheretal., 2002)。反-3-己烯醇、順-3-己烯醇都能在一定程度上引誘五月鰓金龜Melolonthamelolontha(Reineckeetal., 2005)。東方絹金龜與銅綠麗金龜Anomalacorpulenta都對水楊酸甲酯有顯著的電生理反應(yīng)(鞠倩等, 2016)，這可能與它們?nèi)∈诚嗤募闹髦参镉嘘P(guān)。孫凡等(2006)研究發(fā)現(xiàn)，反-2-己烯醛能引起東北大黑鰓金龜Holotrichiaoblita雌、雄成蟲顯著的EAG反應(yīng)，且行為測試顯示反-2-己烯醛對該成蟲具有吸引作用。但是在復(fù)雜的自然環(huán)境中，各種揮發(fā)物都不是單獨存在的，昆蟲定位寄主植物不僅依靠單個物質(zhì)，因此將不同化合物按一定的比例混合，可能會增強它們的引誘力(Ladd and McGovern, 1980; Pauletal., 2009)。本研究鑒定出的活性物質(zhì)對東方絹金龜?shù)淖罴岩T比例還有待進一步研究。

昆蟲對具有EAD活性物質(zhì)的電生理和行為反應(yīng)與其相對含量不一定呈正相關(guān)。玉米果穗揮發(fā)物中含量較低的順-3-己烯醇和含量較高的(+)-環(huán)苜蓿烯、β-石竹烯均對未交配亞洲玉米螟Ostriniafurnacalis成蟲有引誘作用(蔣興川等, 2018)。本研究鑒定的具有EAD活性物質(zhì)中，順-3-己烯乙酸酯的相對含量最高，約為28%，但其引起的試蟲EAG反應(yīng)值較小且對東方絹金龜雌成蟲無顯著的吸引作用；相反，相對含量較低的順-3-己烯醇和反-3-己烯醇卻對東方絹金龜雌成蟲有明顯的吸引力(表2；圖2)，這表明低含量物質(zhì)可能在其寄主定位中發(fā)揮關(guān)鍵的作用。

昆蟲對某些刺激物的EAG反應(yīng)程度與行為反應(yīng)相一致，但對另外一些刺激物，兩種反應(yīng)則可能表現(xiàn)為不相關(guān)甚至負相關(guān)(郭線茹等, 2003; 張振等, 2010)。如綠葉氣味中的反-2-己烯醛和5-甲基-1-己醇都能引起東北大黑鰓金龜成蟲較強的EAG反應(yīng)，但反-2-己烯醛對成蟲具有定向作用，而5-甲基-1-己醇對成蟲無顯著的行為作用(孫凡等, 2006)。在本研究中，東方絹金龜雌成蟲對水楊酸甲酯有較高的EAG反應(yīng)，但趨向行為反應(yīng)不顯著(圖2和3)。這表明EAG反應(yīng)只是昆蟲觸角對外界氣味刺激的感受，不能代表行為反應(yīng)。

不同性別的同種昆蟲對氣味的敏感性存在差異，在尋找寄主、繁殖后代等行為中所采用的策略不同。例如綠盲蝽Lyguslucorum雄蟲利用雌蟲產(chǎn)生的性信息素搜索、定位雌蟲，對性信息素類似物更敏感；而雌蟲對植物揮發(fā)物更敏感，有利于尋找適宜產(chǎn)卵的寄主(陳展冊等, 2010)。華北大黑鰓金龜雌蟲對柿樹、金銀木、榆樹揮發(fā)物的EAG反應(yīng)均顯著大于雄蟲(李婭婭等, 2018)。故本試驗選取東方絹金龜雌成蟲作為研究對象。綜上所述，反-3-己烯醇和順-3-己烯醇對東方絹金龜雌成蟲表現(xiàn)出顯著的吸引作用，說明東方絹金龜很可能是利用這幾種物質(zhì)來定位桃樹。本研究為開發(fā)安全、高效的植物源引誘劑奠定了基礎(chǔ)，同時為其他金龜甲的綠色防控提供了技術(shù)參考。反-3-己烯醇和順-3-己烯醇對東方絹金龜?shù)囊T作用，還需進行田間試驗進一步驗證和篩選。