耿志剛 韓西紅 趙麗麗 張 琳 秦益民 陳 銘 王曉輝

（1 青島明月海藻集團有限公司 山東青島 266400；2 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部海藻類肥料重點實驗室 山東青島 266400；3 海藻活性物質(zhì)國家重點實驗室 山東青島 266400）

隨著采礦、冶煉等工業(yè)的發(fā)展，重金屬污染問題日益嚴重，其中Pb 是危害植物生長發(fā)育，危害人體健康的劇毒元素之一，也是毒性最強的重金屬元素之一［1］。此外，一些城郊、污灌區(qū)甚至果園的土壤中含鉛量也比較高［2］。鉛不是植物生長發(fā)育的必需元素，當鉛被動進入植物后，會在根、莖和葉組織中積累，破壞細胞膜通透性，引起光合作用、呼吸作用等代謝過程紊亂，植物地上部分生物量下降，葉片失綠明顯，嚴重時逐漸枯萎，導致植物死亡［3］。鉛的積累量也直接影響細胞的代謝，引起活性氧對代謝酶系統(tǒng)的破壞作用；高濃度鉛還會降低種子萌發(fā)率，抑制胚根胚軸的生長，甚至出現(xiàn)胚根組織壞死［4］。

研究表明，植物在正常情況下，活性氧的氧代謝保持動態(tài)平衡。植物受到脅迫時，細胞內(nèi)自由基的產(chǎn)生和清除之間的平衡受到破壞，導致大量的活性氧自由基產(chǎn)生，自由基引發(fā)膜中不飽和脂肪酸產(chǎn)生過氧化反應，破壞膜的結(jié)構(gòu)和功能［5］。Pb 脅迫和其它脅迫相似，當植物生長過程中遇到重金屬脅迫時，重金屬可作誘導劑引起膜脂質(zhì)過氧化，細胞內(nèi)自由基的產(chǎn)生和清除之間的平衡受到破壞，使大量的O2-·、OH-·、NO·、HOO-·等自由基產(chǎn)生，使蛋白質(zhì)和生物大分子變性、細胞膜脂過氧化加劇，傷害植物。目前，認為活性氧水平升高導致的膜脂過氧化加劇是膜損傷的重要原因［6］，膜質(zhì)過氧化反應主要的是由氧自由基啟動，經(jīng)連鎖反應生成氧化終產(chǎn)物丙二醛。因此，丙二醛（MDA）的積累在一定程度上反應了體內(nèi)自由基的動態(tài)效應。目前，MDA 已被廣泛用作衡量膜質(zhì)過氧化損傷的指標［7］。

重金屬處理能夠引起植物保護酶系統(tǒng)過氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）活性發(fā)生變化［8］，說明重金屬脅迫使活性氧自由基增多，膜脂過氧化加劇，其中SOD活性在一定范圍內(nèi)與細胞內(nèi)的活性氧自由基水平呈正相關(guān)，而POD 的活性則與植物體內(nèi)重金屬含量呈正相關(guān)。大量研究證明，重金屬離子濃度越高，MDA 積累越多，呈密切的正相關(guān)。MDA 和OH-·等在植物中都可以對細胞產(chǎn)生損害［9］。重金屬對植物的傷害是通過自由基介導，重金屬毒害試驗中，加入自由基清除劑（苯甲酸、抗壞血酸等）可以有效降低重金屬對植物的毒害及MDA 的生成［10］。

海藻的生活環(huán)境十分復雜，經(jīng)常出現(xiàn)結(jié)構(gòu)缺失和生理活性遭到損傷等。然而，海藻自身細胞的適應能力非常的強，可以通過產(chǎn)生次級代謝產(chǎn)物，保護自身免受氧化應激的損傷［11］，海藻產(chǎn)生的這種次級代謝物具有特殊的結(jié)構(gòu)和功能，是非常寶貴的海洋資源［12］。其中，海藻多酚類化合物是一種很好的天然抗氧化劑具有較強的抗氧化活性［13］。

褐藻多酚是存在于褐藻中比較常見的一種多酚類化合物，主要是通過醋酸-丙二酸途徑，以間苯三酚為單元進行生物合成得到的低聚物。褐藻多酚的羥基與水能形成氫鍵，是水溶性很強的化合物，且它們的分子質(zhì)量為126～6 500 kDa［14］。與其他多酚類化合物相似，褐藻多酚也有多種生物活性，例如抗炎、抗癌、抗菌、抗氧化及血管緊張Ⅰ轉(zhuǎn)化酶抑制作用等，其中抗氧化活性的功能較為突出［15］，其對重金屬有較強的螯合作用，有效降低重金屬對細胞的損害［16］。植物中多酚類物質(zhì)能有效清除超氧化物自由基，降低植物在逆境下機體受到的傷害［17］。褐藻多酚在植物上應用研究還比較少，尤其是在增加作物對重金屬的耐受性方面，筆者通過對上海青小油菜進行Pb 脅迫處理，通過使用不同濃度褐藻多酚處理，測量其抗氧化指標及農(nóng)藝性狀指標，測試褐藻多酚在農(nóng)業(yè)上的應用效果。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗在農(nóng)業(yè)農(nóng)村部海藻類肥料重點實驗室功效研究室進行。供試肥料為青島明月海藻集團有限公司生產(chǎn)的有機無機復混肥（16-8-16）；褐藻多酚提取物呈黑褐色液態(tài)多酚總量為30%，由明月藍海生物科技有限公司提供。供試土壤為棕壤，取自青島明月海藻集團有限公司試驗田，有機質(zhì)含量16.23 g/kg，全氮1.13 g/kg，有效磷含量72.56 mg/kg，速效鉀含量70.31 g/kg，pH值5.18。土壤Pb 含量85 mg/kg。供試品種為‘上海青’小白菜。于4月18號播種育苗，生長周期50 d。

1.2 方法

1.2.1 試驗設(shè)計

本試驗為盆栽試驗。在試驗田取5～20 cm 表層土，晾曬風干后過2 mm 篩備用。以溶液形式加入Pb（NO3）2，Pb 濃度為1 200 mg/kg，處理濃度分別以純Pb 計。以不加Pb 處理作對照。土壤加入Pb 溶液后，充分混勻，保持土壤持水量60%，平衡10 d，然后風干裝盆，每盆盛土5.0 kg。每盆施有機無機復混肥1 kg，每個處理重復3 次，隨機區(qū)組排列。試驗設(shè)置7 個處理：CK，不脅迫，不施用褐藻多酚；T1，1 200 mg/kg Pb 脅迫處理，不噴施褐藻多酚；T2，不脅迫，噴施500倍稀釋褐藻多酚；T3，Pb 脅迫，褐藻多酚提取物500 倍；T4，Pb 脅迫，褐藻多酚提取物1 000 倍；T5，Pb 脅迫，褐藻多酚提取物1 500倍；T6，Pb脅迫，褐藻多酚提取物2 000 倍。移栽兩葉一心上海青幼苗，每缽3株，分別在移栽后的第10天、第20天和第30天時，按照試驗設(shè)計噴施褐藻多酚提取物，每天用去離子水澆灌，保持60%的田間持水量。每處理重復3次，隨機排列。培養(yǎng)35 d后，測量葉片的過氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）活性以及丙二醛（MDA）含量，50 d 收獲測定生物量鮮重及葉片SPAD 值、植株體內(nèi)Pb含量。

1.2.2 測定項目及方法

過氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）及丙二醛（MDA）含量均采用試劑盒方法測定（購自南京建成生物工程研究所）。采用羥胺氧化法測定O2-·產(chǎn)生速率。收獲時使用SPAD502儀測量葉片SPAD值，電子天平測量鮮重生物量。數(shù)據(jù)處理采用Microsoft Excel 2003 軟件處理數(shù)據(jù)和繪制圖表，采用DPS705 軟件進行統(tǒng)計分析，采用最小顯著極差法（LSD）進行差異顯著性檢驗（p＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對Pb脅迫下油菜體內(nèi)酶活性的影響

植物在生長過程中難免會遭受生物和非生物逆境脅迫，其代謝過程就會產(chǎn)生自由基破壞細胞膜；POD、SOD、CAT 作為植物自身的酶保護系統(tǒng)，可通過各種代謝過程來清除自由基，降低氧化損傷［18］。在一定程度上清除各種逆境因子脅迫下所產(chǎn)生的活性氧，使體內(nèi)活性氧維持在一個相對穩(wěn)定的水平，從而有效地阻止過氧化物質(zhì)在植物體內(nèi)積累。表1結(jié)果是在不同處理下，褐藻多酚對Pb 處理模擬重金屬脅迫下酶活性恢復的影響。Pb 脅迫下，SOD、POD 和CAT 活性的影響含量低于對照（CK），說明葉片受到重金屬離子脅迫后抗氧化酶活性發(fā)生改變，上海青植株體內(nèi)的氧化酶活性系統(tǒng)遭到破壞。正常處理下施用褐藻多酚提取物處理（T2 組）的SOD 酶活性顯著高于對照處理，而POD 和CAT 與對照差異不顯著。Pb 脅迫下，用不同稀釋濃度的褐藻多酚提取物處理的SOD、POD和CAT含量均高于1 200 mg/kg Pb脅迫不噴施褐藻多酚（T1）處理。且稀釋倍數(shù)越大，3種酶的活性越低，1 000倍稀釋時SOD 和CAT 活性與CK 組處理相比，無顯著差異，500倍稀釋時，3種酶的活性與CK 相比，均沒有顯著差異。以上結(jié)果說明，褐藻多酚提取物能顯著提高上海青油菜SOD 酶的活性，高濃度處理時明顯緩解了Pb 脅迫對油菜體內(nèi)POD、SOD 和CAT 活性的抑制作用，緩解了Pb 脅迫造成的氧化損傷，提高了油菜的抗氧化能力，增強了油菜抵抗Pb脅迫的能力。

2.2 不同處理對上海青葉片MDA含量的影響

MDA 是在植物器官衰老或逆境條件下，發(fā)生膜脂過氧化作用而產(chǎn)生的最終分解產(chǎn)物，其含量可以反映植物遭受逆境傷害的程度。由圖1 可知，Pb離子脅迫不噴施褐藻多酚下（T1），上海青幼苗葉片MDA 含量顯著高于CK 組處理，說明上海青小白菜受到重金屬離子脅迫而累積了大量的MDA，是CK 組的兩倍之多。非Pb 脅迫下施用褐藻多酚提取物處理（T2），MDA 含量與CK 組相比并無顯著差異。在Pb 離子脅迫下，施用不同褐藻多酚提取物處理的MDA 含量相比不施用海藻提取物處理顯著下降，且隨著褐藻多酚提取物稀釋濃度的增大，MDA 下降的越慢，500 倍稀釋倍數(shù)下效果最好，但仍高于正常對照處理，說明Pb 脅迫下施用褐藻多酚提取物對于降低葉片MDA 含量具有較好的作用，但不能完全清除重金屬鉛（Pb）造成的MDA積累。

表1 不同處理對上海青幼苗葉片抗氧化酶活性的影響

圖1 不同處理對上海青葉片MDA含量的影響

2.3 不同處理對·產(chǎn)生速率的影響

圖2 不同處理對上海青體內(nèi)O2-·產(chǎn)生速率的影響

2.4 不同處理對上海青生物量鮮重的影響

由圖3可知，在處理50 d后，Pb離子脅迫不噴施褐藻多酚下（T1）的上海青苗鮮重顯著低于正常對照及其他所有處理，其中非脅迫下褐藻多酚500 倍噴施處理（T2）與CK 處理相比鮮重有所增加，但無顯著差異，Pb 脅迫下施用褐藻多酚提取物處理（T3、T4）生物量鮮重比T1 生物量鮮重有顯著性差異，但也顯著低于CK。1 500倍稀釋以上（T5、T6）生物量鮮重與T1 相比無著性差異。這些結(jié)果表明，Pb脅迫抑制了上海青生物量鮮重積累，施用褐藻多酚取物有利于促進上海青生長，高濃度噴施時，一定程度上可以緩解Pb脅迫帶來的不利影響。

圖3 不同處理對上海青鮮重的影響

2.5 不同處理對Pb 脅迫下上海青植株內(nèi)Pb 含量的影響

由圖4可見，與對照相比，Pb離子脅迫不噴施褐藻多酚下（T1），上海青植株葉片和根系內(nèi)Pb含量明顯增加；使用不同濃度的褐藻多酚提取物處理上海青植株后，均可降低了油菜葉片和根系內(nèi)Pb 含量；使用稀釋500、1 000 和1 500 倍褐藻多酚噴施處理時，油菜葉片和根系內(nèi)Pb含量顯著降低；稀釋500 倍褐藻多酚（T2）處理與單獨Pb 脅迫（T1）處理相比，上海青葉片和根系內(nèi)Pb含量分別顯著降低了67.5%和48.1%。以上結(jié)果表明，褐藻多酚提取物稀釋濃度1 000 倍以內(nèi)時，均能顯著降低上海青植株體內(nèi)Pb 的水平，可有效緩解重金屬Pb對上海青的脅迫毒害作用。

圖4 不同處理對上海青Pb含量的影響

2.6 不同處理對上海青葉片SPAD值的影響

由圖5 可知，Pb 脅迫處理的上海青幼苗葉SPAD值顯著低于對照組及其他所有處理，其中T2和T3兩個處理顯著高于Pb脅迫（T1）處理，且與正常對照處理無顯著差異。這些結(jié)果可以說明，Pb 脅迫下上海青葉片葉綠素含量降低，植株葉片出現(xiàn)黃化現(xiàn)象，而施用褐藻多酚提取物的處理可以提高葉綠素含量，從而促進光合作用，減輕重金屬所致的黃化現(xiàn)象。

圖5 不同處理對上海青葉片SPAD的影響

3 結(jié)論

土壤重金屬超標是農(nóng)業(yè)種植過程中常見的問題，也是造成作物不良生長的重要因素之一［20］，重金屬離子造成的傷害大多數(shù)與超氧陰離子自由基等活性氧有關(guān)，植物在重金屬超標的土壤中，會加速活性氧物質(zhì)的積累，增加膜脂過氧化和提高膜的滲透性，造成膜系統(tǒng)損傷［21］。

超氧化物歧化酶（SOD）是一種存在于動植物體內(nèi)的天然超氧自由基清除因子，它可以把對細胞有害的超氧自由基向過氧化氫轉(zhuǎn)變，之后在過氧化氫酶（CAT）和過氧化物酶（POD）的作用下，將過氧化氫分解為對作物無害的水，避免超氧自由基多植物膜脂造成的損傷［22］。外源海藻提取物處理后的煙草幼苗，在植株生長受到脅迫時可明顯提高葉片的相對含水量和葉綠素的含量，降低電導率和MDA 的含量，提高POD、CAT 和SOD 酶活性［23］。本論文研究了在Pb 脅迫下。植物體內(nèi)的這3種酶的含量變化進行了分析，結(jié)果表明SOD、POD 和CAT 3 種酶活性在重金屬離子Pb 脅迫下均會顯著降低，MDA 和O2-·含量顯著增加；經(jīng)過褐藻多酚提取物處理后，會顯著提高3種抗氧化酶活性，減少MDA和O2-·含量，使其恢復到接近正常水平，從而降低了自由基對細胞膜的傷害。本研究發(fā)現(xiàn)，使用不同倍數(shù)的褐藻多酚處理，上海青體內(nèi)Pb含量與稀釋倍數(shù)成負相關(guān)，500～1 000倍稀釋處理下，植株體內(nèi)重金屬鉛的含量明顯下降，并且增加了上海青的生物量，提高葉片SPAD 值，有效改善植株黃化。在Pb 脅迫下，施用褐藻多酚有利于緩解Pb 脅迫給上海青帶來的傷害，減少重金屬Pb 對作物帶來的傷害。對于土壤重金屬Pb 對作物的影響，有望通過使用褐藻多酚提取物來降低Pb 在作物體內(nèi)的累積，提高農(nóng)作物的安全性，但對其他金屬作用是否起作用以及在不同作物、最佳使用量等還需進一步試驗。