余鵬飛，倪娟楨，趙月鈞，陳可，董葉箐，何曉明

綠城農(nóng)科檢測技術(shù)有限公司（杭州 310052）

糖皮質(zhì)激素，是一種腎上腺分泌的類固醇激素，具有抗炎、抗過敏、抗休克和抗免疫抑制等作用，還可用作動物的生長促進(jìn)劑，加快動物生長，在畜牧業(yè)生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用[1-2]。然而有研究表明，過量使用會導(dǎo)致動物源性食品中藥物殘留，對人類健康產(chǎn)生危害[3]。農(nóng)業(yè)部235號公告《動物性食品中獸藥最高殘留限量》[4]對牛奶中部分糖皮質(zhì)激素類藥物的檢出和最高限量值做出明確規(guī)定：地塞米松0.3 μg/kg，氫化可的松不得檢出。

糖皮質(zhì)激素的檢測方法主要包括氣相色譜-質(zhì)譜法（GC）[5]、液相色譜法（LC）[6-7]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）[8-11]，其中，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法以其特異性強(qiáng)、靈敏度高和重現(xiàn)性好的特點，為獸藥檢測首選方法。由于糖皮質(zhì)激素在牛奶中通常以痕量存在，在進(jìn)行檢測分析前需進(jìn)行濃縮、富集和凈化等步驟，現(xiàn)有的國家標(biāo)準(zhǔn)與文獻(xiàn)報道多采用固相萃取[8,12]、液液萃取[9]、基質(zhì)固相分散萃取[10-11]等對樣品進(jìn)行前處理，這些方法的有機(jī)溶劑用量大、操作步驟繁瑣復(fù)雜、耗時較長，不能滿大批量快速檢測樣品的要求。因此，建立一種簡單、快速、靈敏的前處理方法用于篩查牛奶中糖皮質(zhì)激素殘留尤為重要。

中空纖維微萃?。℉F-SPME）是一種利用中空纖維的微孔孔徑較小限制樣品溶液中的大分子物質(zhì)進(jìn)入萃取相，集萃取和凈化一步完成的樣品預(yù)處理技術(shù)。在環(huán)境、生物樣品痕量分析中有良好使用[13-15]。但是，中空纖維中作為受體相的有機(jī)溶劑存在容易在萃取過程中溶于樣品溶液的情況，降低萃取效率。

氧化石墨烯是近年來興起的一種新型納米材料，具有超大的比表面積及豐富的含氧官能團(tuán)，可與有機(jī)化合物形成π-π相互作用，被廣泛應(yīng)用于樣品的前處理研究[16-17]。近年來，有研究者將中空纖維和氧化石墨烯2種材料獨特的優(yōu)點相結(jié)合，制備氧化石墨烯/中空纖維復(fù)合材料用于樣品前處理過程并取得良好的應(yīng)用效果[18-19]。

該方法采用中空纖維/氧化石墨烯用于樣品前處理，并與高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法相結(jié)合建立同時測定牛奶中7種糖皮質(zhì)激素的分析方法。該方法簡單高效，同時靈敏度也能滿足日常檢測需求，適合于實驗室大批量檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

糖皮質(zhì)激素標(biāo)準(zhǔn)品：倍氯米松、地塞米松、甲基潑尼松龍、氟氫可的松、氫化可的松、可的松、潑尼松龍（德國Dr. Ehrenstorfer公司，純度≥95%）；氘代氫化可的松內(nèi)標(biāo)物（加拿大CDN公司，純度≥99%）。

1.2 儀器與設(shè)備

三重四級桿液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜儀（LC-MS 8050，日本Shimadzu公司）；多管渦旋混合儀（DMT-2500，杭州米歐儀器有限公司）；超聲波清洗器（KQ-500E，昆山市超聲儀器有限公司）；超純水機(jī)（美國Millipore公司）。

1.3 方法

1.3.1 氧化石墨烯/中空纖維制備

將中空纖維膜剪成長度約2 cm小段，用丙酮超聲清洗10 min，取出晾干。取50 mg氧化石墨烯分散于100 mL N, N-二甲基甲酰胺中，超聲分散2 h，制備成500 mg/L氧化石墨烯溶液。將晾干的中空纖維浸入500 mg/L氧化石墨烯溶液中超聲2 h，使氧化石墨烯完全固定在中空纖維膜的微孔中，取出用去離子水洗滌數(shù)次，除去中空纖維表面及內(nèi)部多余的氧化石墨烯，晾干備用。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取適量的標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇分別配制成100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)貯備液，置于-18 ℃冰箱保存。使用時，用甲醇稀釋成各種濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液和內(nèi)標(biāo)工作液，備用。

1.3.3 樣品前處理

在多少個寒冷的、屋頂漏水的晚上，易非徹夜不眠，她睜著眼睛盯著屋頂，腦海里一遍又一遍地重復(fù)這句話：我是爸爸的親女兒呢，能不像爸爸嗎？易非覺得爸爸一直在黑暗中陪著她，甚至不時用他那有著淡淡煙草味道的雙手撫摸著她的頭。只有爸爸仍然把她當(dāng)一個孩子來看待。

稱取5 g樣品于10 mL離心管中，加入50 μL 500 μg/L氘代氫化可的松同位素工作液，用0.1 mol/L的NaOH溶液調(diào)至pH 10，將處理好的氧化石墨烯/中空纖維放入離心管中，超聲萃取10 min。取出氧化石墨烯/中空纖維，濾紙擦干后放入裝有1 mL甲醇的小瓶中，超聲解析3 min，經(jīng)0.22 μ m濾膜過濾后待測。

1.3.4 儀器條件

1.3.4.1 色譜條件

ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；進(jìn)樣量3 μ L；柱溫40 ℃；流動相A為0.1%甲酸-2 mmol/L水溶液，B為乙腈溶液；流速0.15 mL/min；采用梯度洗脫的分離程序，洗脫程序：0～0.5 min，10% B；0.5～1.5 min，10%～40% B；1.5～2.5 min，40%～90% B；2.5～5 min，90% B；4～5 min，65%～90%B；5～6 min，90%～10% B。

1.3.4.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（ESI）：負(fù)離子模式；加熱塊溫度400 ℃，毛細(xì)管電壓4 000 V；霧化氣流量3.0 L/min；加熱氣流量10.0 L/min；定性與定量離子對、碰撞能量等參數(shù)見表1。

表1 7種糖皮質(zhì)激素及相應(yīng)內(nèi)標(biāo)物質(zhì)譜參數(shù)

2 結(jié)果與分析

2.1 萃取條件的優(yōu)化

2.1.1 樣品量的優(yōu)化

由于糖皮質(zhì)激素類藥物在牛奶中以痕量存在，加大樣品的稱樣量，增加富集倍數(shù)，是提高實際檢測濃度的有效手段之一?？疾鞓悠?～10 g時對萃取效率的影響。結(jié)果表明（見圖1），樣品量增加到5 g時，萃取效率沒有明顯變化，繼續(xù)增加樣品量，萃取效率逐漸減少。這可能是樣品量5 g時剛好達(dá)到吸附平衡，樣品量繼續(xù)增大，僅用2 cm的氧化石墨烯/中空纖維和10 min的萃取時間無法充分吸附目標(biāo)化合物，致使萃取效率降低。因此，選擇樣品量為5 g。

圖1 樣品量對萃取效率的影響

2.1.2 樣品溶液pH的優(yōu)化

樣品溶液pH不僅能改變目標(biāo)化合物的存在形態(tài)，也會改變吸附材料表面電荷和密度，是影響萃取效率的重要因素?？疾靝H 4～14的萃取效率。結(jié)果表明（見圖2），pH 4～10時，隨著pH增加，萃取效率明顯增大。這是由于目標(biāo)化合物為堿性化合物，在堿性環(huán)境中呈分子狀態(tài)，隨著pH增大，與氧化石墨烯之間的疏水作用力增強(qiáng)，萃取效率增大；之后隨著pH增大，萃取效率略有下降，這可能是氧化石墨烯絮凝沉淀的關(guān)系。因此，試驗選擇最佳pH 10。

圖2 樣品溶液pH對萃取效率的影響

2.1.3 萃取條件的優(yōu)化

試驗比較超聲萃取和振蕩萃取2種萃取方式對7種糖皮質(zhì)激素類萃取效率的影響。結(jié)果表明（見圖3），在相同時間下，超聲萃取的萃取效率明顯好于渦旋萃取。這是因為渦旋萃取時容易產(chǎn)生氣泡附在中空纖維膜的外壁，影響目標(biāo)化合物的萃取，而超聲萃取時超聲波輻射產(chǎn)生的強(qiáng)烈空化效應(yīng)、機(jī)械效應(yīng)和熱效應(yīng)可以加強(qiáng)傳質(zhì)過程，從而提高萃取效率。

圖3 萃取方式萃取效率的影響

進(jìn)一步考察萃取時間（4～14 min）對萃取效率的影響。結(jié)果表明（見圖4），萃取時間10 min時萃取效率最好，萃取時間繼續(xù)增加，解析效率略有下降，可能是過長的超聲時間使氧化石墨烯從中空纖維壁上脫落。因此，試驗選擇萃取方式為超聲萃取10 min。

圖4 萃取時間對萃取效率的影響

2.1.4 離子強(qiáng)度的優(yōu)化

在水溶液中加入適量的鹽可以增加離子強(qiáng)度，減少目標(biāo)化合物在樣品中的溶解度，有助于提高萃取效率。通過在樣品溶液中加入不同濃度NaCl（0～20%），考察離子強(qiáng)度對目標(biāo)化合物萃取效率的影響。結(jié)果顯示，在其他條件不變時，額外添加NaCl對目標(biāo)化合物的萃取效率無顯著影響。因此，試驗選擇不加NaCl。

2.1.5 解析條件的優(yōu)化

萃取完成后，為了將目標(biāo)化合物從氧化石墨烯/中空纖維上盡可能完全地解析，試驗考察甲醇、乙腈、丙酮、異丙醇4種解析溶劑的解析效率。結(jié)果表明（見圖5），甲醇的解析效率最好。

進(jìn)一步考察解析溶劑用量為0.5～3 mL時對于解析效率的影響。結(jié)果表明，隨解析溶劑用量增加，解析效率逐漸變大，解析溶劑用量1 mL時，解析效率達(dá)到最大；繼續(xù)增加解析溶劑用量，解析效率基本不變。

考察解析時間在1～5 min范圍內(nèi)對萃取效果的影響。結(jié)果表明，解析時間在1～3 min時，隨著時間增加，解析效率逐漸提高；超過3 min后解析效率趨于平穩(wěn)，說明3 min時基本能達(dá)到解析完全。因此，試驗采用1 mL甲醇作為解析溶劑，解析時間3 min作為最佳解析條件。

圖5 解析溶劑對萃取效率的影響

2.2 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)在質(zhì)譜分析中普遍存在，共流出干擾物對目標(biāo)物離子造成的離子抑制或增強(qiáng)效應(yīng)，可能嚴(yán)重影響定量的準(zhǔn)確性。試驗采用提取后添加法，測定空白基質(zhì)提取液與純?nèi)軇┲型瑵舛饶繕?biāo)化合物的離子響應(yīng)強(qiáng)度，通過二者比值來評價基質(zhì)效應(yīng)（ME）。如式（1）所示。結(jié)果表明（見表2），除氟氫可的松外，其余6種目標(biāo)化合物基質(zhì)效應(yīng)影響不大，說明中空纖維的微孔結(jié)構(gòu)有效限制牛奶中的蛋白質(zhì)、脂肪等大分子物質(zhì)進(jìn)入，具有減弱基質(zhì)干擾的能力。試驗參照GB/T 21981—2008[12]采用氘代氫化可的松同位素內(nèi)標(biāo)校正，因此無須使用基質(zhì)匹配的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行測定，從而提高該方法在日常檢測效率。

式中：A和B分別為純?nèi)軇┡c基質(zhì)溶液中目標(biāo)化合物的峰面積。若ME＜0.8，說明基質(zhì)對目標(biāo)化合物產(chǎn)生較強(qiáng)的抑制作用；ME＞1.2，則說明基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)；0.8＜ME＜1.2表明基質(zhì)效應(yīng)可以忽略。

2.3 方法學(xué)驗證

2.3.1 線性范圍、檢出限及定量限

配制6點不同質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，溶液中7種糖皮質(zhì)激素質(zhì)量濃度分別為1，5，10，25，50和100 μg/L，氫化可的松同位素的質(zhì)量濃度均為25 μg/L，以濃度（X，μg/L）為橫坐標(biāo)，目標(biāo)化合物峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積的比值（Y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。從表2可以看出，7種目標(biāo)化合物線性相關(guān)性良好，相關(guān)系數(shù)不低于0.99。根據(jù)檢出限大于等于3倍信噪比，定量限大于等于10倍信噪比的計算方法，得出7種糖皮質(zhì)激素的方法檢出限為0.04～0.09 μ g/kg，定量限為0.12～0.30 μ g/kg。

表2 7種糖皮質(zhì)激素的線性方程、回歸方程、相關(guān)系數(shù)和定量限

2.3.2 加標(biāo)回收試驗

在空白牛奶樣品中分別添加3個水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個水平平行測試6次，計算其平均回收率。結(jié)果表明，7種糖皮質(zhì)激素的平均加標(biāo)回收率范圍為72.9%～89.0%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.1%～9.5%，符合獸藥殘留測定的要求。

表3 空白牛奶中7種糖皮質(zhì)激素的加標(biāo)回收率和標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）

2.4 實際樣品的測試

采用該方法對市售的10種不同品牌的牛奶中糖皮質(zhì)激素殘留量進(jìn)行檢測，均未檢出7種糖皮質(zhì)激素。

3 結(jié)論

基于自制的氧化石墨烯/中空纖維的固相微萃取技術(shù)，結(jié)合高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法建立測定牛奶中7種糖皮質(zhì)激素的方法，對影響萃取效率的條件，如樣品體積、樣品溶液pH、萃取條件、離子強(qiáng)度、解析條件進(jìn)行優(yōu)化。該方法操作簡單、快速，精密度和重現(xiàn)性較好，可應(yīng)用于牛奶中糖皮質(zhì)激素的快速篩查。