樊秋元，朱丹，牛廣財(cái)*，魏文毅，朱立斌，張琪

1. 黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院（大慶 163319）；2. 黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院（大慶 163319）

黑加侖學(xué)名黑穗醋栗（Ribes nigrum L.），又稱紫梅或黑豆果，為虎耳草科茶藨子屬多年生小灌木[1]。常見于我國(guó)黑龍江、吉林、新疆等地區(qū)，其果實(shí)為紫黑色小漿果，外形與藍(lán)莓較為相似。黑加侖果實(shí)中含有豐富的花色苷、多酚類物質(zhì)、維生素C等營(yíng)養(yǎng)成分，具有保護(hù)視力、抗氧化、預(yù)防心腦血管疾病和癌癥等保健功能[2]。

酵素是指使用水果、蔬菜、菌類以及食用性藥材為原料，經(jīng)過酵母菌等多種有益菌發(fā)酵后而得到的，含有豐富的酶類、維生素、礦物質(zhì)及次生代謝產(chǎn)物等的功能性微生物發(fā)酵保健性食品[3-4]。酵素具有抗疲勞、抗衰老、清除自由基等功能[5]。通過有益微生物發(fā)酵產(chǎn)生的酵素中，超氧化物歧化酶含量增多，具有較好的抗氧化能力。超氧化物歧化酶（SOD）能夠清除羥基自由基（OH·）、超氧陰離子自由基（O2-·）和過氧化氫等活性氧（ROS），是細(xì)胞防御系統(tǒng)中的主要抗氧化酶[6]。

目前，國(guó)內(nèi)主要對(duì)葡萄、藍(lán)莓、蘋果、樹莓、火龍果、桂圓等酵素發(fā)酵工藝進(jìn)行了較深入研究[7-12]，但關(guān)于黑加侖酵素制備工藝的研究仍鮮見報(bào)道。以新鮮黑加侖果為原料，以高效活性酵母為發(fā)酵菌種，制備黑加侖酵素。以總抗氧化能力和SOD酶活力為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過單因素及正交試驗(yàn)對(duì)其發(fā)酵工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，并研究其最優(yōu)發(fā)酵工藝條件下酵素產(chǎn)品的自由基清除能力，以期為黑加侖酵素的制備提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑加侖，購(gòu)于黑龍江省尚志市亞布力北方小漿果種植專業(yè)合作社；安琪牌葡萄酒專用高活性干酵母，安琪酵母股份有限公司；白砂糖，市售；福林酚，國(guó)藥集團(tuán)；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉，天津大茂化學(xué)試劑廠；SOD酶活力檢測(cè)試劑盒、總抗氧化能力檢測(cè)試劑盒，南京建成生物工程研究所。Pectinex XXL果膠酶（酶活10 000 U/mL），諾維信（中國(guó)）生物技術(shù)有限公司；有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品，美國(guó)Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

WS 108手持式折光儀，河北潤(rùn)聯(lián)科技開發(fā)有限公司；HR 7633打漿機(jī)，飛利浦家庭電器（珠海）有限公司；電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科技有限公司；EX 324電子分析天平，奧豪斯儀器（上海）有限公司；TD5Z低速平衡離心機(jī)，金壇市城西春蘭實(shí)驗(yàn)儀器廠；UV-1100紫外可見分光光度計(jì)，上海凌析達(dá)儀器；DRP-9082電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；Angilent 1200高效液相色譜，美國(guó)安捷倫公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 黑加侖酵素制備工藝流程

黑加侖果→清洗、破碎→酶解→過濾→調(diào)糖→殺菌→冷卻→接種→發(fā)酵→黑加侖酵素

1.3.2 部分操作要點(diǎn)

1) 酶解：黑加侖清洗破碎之后，經(jīng)Pectinex XXL果膠酶在50 ℃下酶解2 h，果膠酶添加量按照2.0 mL/kg添加。

2) 調(diào)糖：在室溫條件下，將白砂糖加入到黑加侖果汁中，混勻后通過手持糖度儀對(duì)其糖度進(jìn)行測(cè)定，將其初始糖度調(diào)整至設(shè)定值。

3) 殺菌：采用超聲波處理15 min對(duì)黑加侖果汁進(jìn)行殺菌。

4) 菌種的活化：安琪葡萄酒專用高活性干酵母按與蒸餾水1∶10倍（g/mL）溶解，在30～32 ℃恒溫水浴鍋中活化30 min，備用。

5) 接種：在無菌室中，按試驗(yàn)設(shè)計(jì)要求的比例，對(duì)處理后的黑加侖果汁接入活化后的酵母菌。

6) 發(fā)酵：在試驗(yàn)設(shè)計(jì)的溫度和時(shí)間等條件下，接種后的黑加侖果汁進(jìn)行靜置發(fā)酵，在發(fā)酵過程中和結(jié)束后分別測(cè)定產(chǎn)品的總抗氧化能力和SOD酶活力的變化。

1.3.3 發(fā)酵時(shí)間的確定

調(diào)整黑加侖果汁發(fā)酵初始糖度為18%，酵母菌接種量為0.03%，發(fā)酵溫度28 ℃，發(fā)酵時(shí)間設(shè)定為24，48，72，96和120 h，測(cè)定總抗氧化能力和SOD酶活力的變化。

1.3.4 接種量的確定

調(diào)整黑加侖果汁發(fā)酵初始糖度為18%，分別向黑加侖果汁中接入0.01%，0.03%，0.05%，0.07%和0.09%的酵母菌液，于28 ℃條件下發(fā)酵72 h，測(cè)定總抗氧化能力和SOD酶活力的變化。

1.3.5 初始糖度的確定

調(diào)整黑加侖果汁發(fā)酵初始糖度分別為14%，16%，18%，20%和22%，酵母菌接種量為0.03%，于28 ℃條件下發(fā)酵72 h，測(cè)定總抗氧化能力和SOD酶活力的變化。

1.3.6 發(fā)酵溫度的確定

調(diào)整黑加侖果汁發(fā)酵初始糖度為18%，酵母菌接種量為0.03%，分別在26，28，30，32和34 ℃條件下發(fā)酵72 h，測(cè)定總抗氧化能力和SOD酶活力的變化。

1.3.7 正交試驗(yàn)

依據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以發(fā)酵時(shí)間、接種量、發(fā)酵液初始糖度和發(fā)酵溫度4個(gè)因素進(jìn)行L9(43)正交優(yōu)化試驗(yàn)（表1），以總抗氧化能力和SOD酶活力為指標(biāo)，確定黑加侖酵素的最佳發(fā)酵工藝條件。

表1 發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)因素水平

1.4 檢測(cè)方法

1.4.1 黑加侖酵素總抗氧化能力的測(cè)定

將黑加侖酵素液以3 500 r/min離心10 min后，取上清液，根據(jù)總抗氧化能力試劑盒說明書進(jìn)行總抗氧化能力的測(cè)定。

1.4.2 黑加侖酵素SOD酶活力的測(cè)定

將黑加侖酵素液以3 800 r/min離心10 min后，取上清液，根據(jù)SOD酶試劑盒說明書進(jìn)行SOD酶活力的測(cè)定。

1.4.3 有機(jī)酸含量測(cè)定

Angilent 1200高效液相色譜檢測(cè)的條件[10]：色譜柱，Supersil AQ-C185 μ m ID 4.6 mm×250 mm；流動(dòng)相，0.02 mol/L KH2PO4溶液（用磷酸調(diào)pH 2.80）。液相條件：等梯度洗脫10 min；流速，1 mL/min；柱溫，30 ℃；進(jìn)樣量，10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)，210 nm。樣品用超純水稀釋10倍，用0.22 μm濾膜過濾后直接進(jìn)樣，每個(gè)樣品重復(fù)3次。

1.4.4 黑加侖酵素超氧陰離子自由基清除能力的測(cè)定

取0.1 mL發(fā)酵液，加入4.5 mL的Tris-HCl溶液（pH 8.2），與0.4 mL的25 mmol/L的鄰苯三酚溶液混勻，在25 ℃下水浴5 min，然后加入1 mL的8 mol/L的鹽酸溶液，在325 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度A1?？瞻讓?duì)照以蒸餾水代替樣液，測(cè)定吸光度A0。以同體積的蒸餾水代替鄰苯三酚溶液，測(cè)定發(fā)酵液在體系中的吸光度A2。以4 mg/mL的VC為對(duì)照，按式（1）計(jì)算清除率：

式中：A0為空白的吸光度；A1為樣液的吸光度；A2為樣液在體系中的吸光度。

1.4.5 DPPH自由基清除能力的測(cè)定

取發(fā)酵液2 mL，離心取上清液并用蒸餾水稀釋10倍得待測(cè)液。取2 mL待測(cè)液加入2 mL的0.2 mmol/L的DPPH乙醇溶液，混勻避光放置30 min，在波長(zhǎng)為517 nm處測(cè)吸光度為A1，用等體積的無水乙醇代替DPPH乙醇溶液，測(cè)吸光度為A2，將樣品用等體積的無水乙醇代替，吸光度記A0。以4 mg/mL的VC為對(duì)照，按式（2）計(jì)算DPPH自由基清除率。

式中：A0為空白對(duì)照液吸光度；A1為樣品測(cè)定管吸光度；A2為樣品本底管吸光度。

1.4.6 羥自由基清除能力的測(cè)定

取10 μ L發(fā)酵液，加入2 mL 6 mmol/L的H2O2溶液、FeSO4溶液，搖勻靜置10 min后，加入2 mL 6 mmol/L的水楊酸溶液，搖勻，37 ℃恒溫水浴1 h，在510 nm下測(cè)定吸光度A1，以去離子水為參比溶液，測(cè)定吸光度A0，以同體積的蒸餾水代替水楊酸溶液，測(cè)定吸光度A2。以4 mg/mL的VC為對(duì)照，按式（3）計(jì)算羥自由基清除能力：

式中：A0為空白的吸光度；A1為樣液的吸光度；A2為樣液在體系中的吸光度。

1.4.7 其他指標(biāo)測(cè)定

可滴定酸測(cè)定：GB/T 12456—2008《食品中總酸的測(cè)定》方法。菌落總數(shù)測(cè)定：參照GB 4789.2—2016《菌落總數(shù)測(cè)定》方法。大腸菌群數(shù)測(cè)定：參照GB 4789.3—2016《大腸菌群計(jì)數(shù)》方法。金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)：參照GB 4789.10—2016《金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)》方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)黑加侖酵素的影響

發(fā)酵時(shí)間對(duì)黑加侖酵素總抗氧化能力和SOD酶活力的影響見圖1。由圖1可知，發(fā)酵96 h時(shí)總抗氧化能力達(dá)到最大值844.83 U/mL，之后下降；SOD酶活力在發(fā)酵第72 h達(dá)到4 869.80 U/mL，隨后趨于穩(wěn)定狀態(tài)。因此，選擇酵母菌發(fā)酵黑加侖酵素的較適合發(fā)酵時(shí)間為72～120 h。

圖1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)黑加侖酵素總抗氧化能力與SOD酶活力的影響

2.2 酵母菌接種量對(duì)黑加侖酵素的影響

酵母菌接種量對(duì)黑加侖酵素總抗氧化能力和SOD酶活力的影響見圖2。由圖2可知，接種量為0.07%時(shí)，總抗氧化能力最高，達(dá)到878.13 U/mL，SOD酶活力隨著接種量的增加而緩慢增長(zhǎng)，在接種量為0.07%時(shí)達(dá)到最大值4 245.26 U/mL，隨后稍有下降。因此，確定酵母菌發(fā)酵黑加侖酵素的較適合接種量為0.05%～0.09%。

2.3 初始糖度對(duì)黑加侖酵素的影響

初始糖度對(duì)黑加侖酵素總抗氧化能力和SOD酶活力的影響見圖3。由圖3可知，初始糖度在16%～20%時(shí)總抗氧化能力較高，在18%時(shí)為最大值846.07 U/mL。SOD酶活力在初始糖度為16%～20%時(shí)也較高。因此，確定酵母菌發(fā)酵黑加侖酵素的較適合初始糖度為16%～20%。

圖2 接種量對(duì)總抗氧化能力與SOD酶活力的影響

圖3 初始糖度對(duì)總抗氧化能力與SOD酶活力的影響

2.4 發(fā)酵溫度對(duì)黑加侖酵素的影響

發(fā)酵溫度對(duì)黑加侖酵素總抗氧化能力和SOD酶活力的影響見圖4。由圖4可知，最適發(fā)酵溫度范圍為26～30 ℃，發(fā)酵溫度在26 ℃時(shí)總抗氧化能力較高，為778.23 U/mL；SOD酶活力在發(fā)酵溫度為28 ℃時(shí)較高，為3 979.80 U/mL。因此，選擇黑加侖酵素的較適合發(fā)酵溫度范圍為26～30 ℃。

圖4 發(fā)酵溫度對(duì)總抗氧化能力與SOD酶活力的影響

2.5 黑加侖酵素發(fā)酵條件的正交試驗(yàn)結(jié)果

由表2的試驗(yàn)結(jié)果可知，4個(gè)因素對(duì)總抗氧化能力影響的主次順序?yàn)锳＞B＞D＞C，即發(fā)酵時(shí)間＞酵母菌接種量＞發(fā)酵溫度＞初始糖度，試驗(yàn)最優(yōu)組合為A2B3C3D1，即最佳發(fā)酵時(shí)間為96 h、酵母菌接種量為0.09%、初始糖度為20%、發(fā)酵溫度為26 ℃；從對(duì)SOD酶活力影響情況看，其主次順序?yàn)镃＞D＞A＞B，即初始糖度＞發(fā)酵溫度＞發(fā)酵時(shí)間＞接種量，試驗(yàn)最優(yōu)組合為A2B2C3D2，即最佳發(fā)酵時(shí)間為96 h、酵母菌接種量為0.07%、初始糖度為20%、發(fā)酵溫度為28 ℃。

表2 發(fā)酵條件的正交試驗(yàn)結(jié)果及分析

2.6 驗(yàn)證試驗(yàn)

由表3驗(yàn)證試驗(yàn)可知，正交最優(yōu)組合A2B3C3D1總抗氧化能力為最高為887.25 U/mL，正交最優(yōu)組合A2B2C3D2為880.60 U/mL，兩種發(fā)酵條件下總抗氧化能力差異不大。但是，正交最優(yōu)組合A2B2C3D2的發(fā)酵條件中SOD酶活力明顯高于A2B3C3D1的4 778.54 U/mL。因此，黑加侖酵素酵素最佳的發(fā)酵工藝條件為：最佳發(fā)酵時(shí)間為96 h、酵母菌接種量為0.07%、初始糖度為20%、發(fā)酵溫度為28 ℃。在此最佳工藝條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，總抗氧化能力為880.60 U/mL，SOD酶活力為4 873.13 U/mL。

表3 最佳工藝條件驗(yàn)證試驗(yàn)

2.7 黑加侖酵素的品質(zhì)指標(biāo)

2.7.1 感官指標(biāo)

色澤，深紫玫紅色，均一有光澤；口味，細(xì)膩，微酸；香氣，有黑加侖獨(dú)特的香氣；組織狀態(tài)，液態(tài)均勻，有微量沉淀；雜質(zhì)，無外來雜質(zhì)。

2.7.2 理化指標(biāo)

可溶性固性物含量，7.2%；總酸（以乳酸計(jì)），4.7%；總抗氧化能力值，880.60 U/mL，SOD酶活力，4 873.13 U/mL。

2.7.3 微生物指標(biāo)

菌落總數(shù)為≤100 CFU/mL，大腸菌群數(shù)≤10 CFU/mL，致病菌未檢出。

2.8 黑加侖酵素有機(jī)酸

黑加侖酵素有機(jī)酸HPLC結(jié)果如圖5。由圖5可知，8中標(biāo)準(zhǔn)有機(jī)酸分離效果很好，以各標(biāo)準(zhǔn)有機(jī)酸質(zhì)量濃度對(duì)峰面積進(jìn)行線性回歸，采用外標(biāo)法測(cè)定黑加侖酵素有機(jī)酸種類和含量。經(jīng)測(cè)定得到黑加侖酵素有機(jī)酸種類主要為：檸檬酸（2 745.27 mg/L）、蘋果酸（448.65 mg/L）、奎寧酸（188.89 mg/L）、莽草酸（23.48 mg/L）、抗壞血酸（19.59 mg/L）和草酸（19.59 mg/L）。有機(jī)酸是酵素發(fā)酵過程中改變其風(fēng)味的重要因素，研究表明，有機(jī)酸種類會(huì)隨著發(fā)酵的進(jìn)行而改變，果蔬發(fā)酵代謝中積累了少量丙酮酸、富馬酸和莽草酸，其中，莽草酸是多種有機(jī)酸代謝過程的重要產(chǎn)物[13]。

2.9 黑加侖酵素的超氧陰離子自由基清除能力

超氧陰離子自由基是活性氧自由基的一種，可以誘導(dǎo)脂類、蛋白質(zhì)和核酸的氧化損傷[14]。由圖6可知，黑加侖酵素發(fā)酵過程中超氧陰離子自由基清除能力在24 h內(nèi)先呈急速上升的趨勢(shì)，隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，超氧陰離子自由基清除能力呈緩慢下降趨勢(shì)。雖然發(fā)酵后的黑加侖酵素清除能力要低于4 mg/mL的VC對(duì)超氧陰離子自由基清除率（87.78%），但是，發(fā)酵后產(chǎn)品對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力均高于未發(fā)酵樣品的清除率，這與發(fā)酵后酵素中的SOD酶活力增加有關(guān)，說明酵母菌發(fā)酵有利于黑加侖酵素的超氧陰離子自由基清除能力提高。

圖6 黑加侖酵素發(fā)酵過程中超氧陰離子自由基清除能力的變化

2.10 黑加侖酵素的DPPH自由基清除能力

DPPH自由基是一個(gè)較穩(wěn)定的自由基，與其他測(cè)定方法相比較，DPPH可以短時(shí)間內(nèi)評(píng)價(jià)抗氧化活性[15]，因此，被廣泛應(yīng)用于的抗氧化能力評(píng)價(jià)中。由圖7可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，黑加侖酵素DPPH自由基清除率呈上升趨勢(shì)。在48 h時(shí)DPPH自由基清除能力達(dá)到了96.37%，要略高于4 mg/mL的VC對(duì)DPPH自由基清除率（95.80%）。

圖7 黑加侖酵素發(fā)酵過程中DPPH自由基清除能力的變化

2.11 黑加侖酵素的羥自由基清除能力

羥自由基具有很強(qiáng)的氧化能力，羥自由基清除率是評(píng)估酵素抗氧化能力的另一個(gè)重要指標(biāo)。由圖8可知，黑加侖酵素發(fā)酵至72 h時(shí)，羥自由基清除率達(dá)到了最大值（70.54%），但要低于4 mg/mL的VC對(duì)羥自由基的清除率（73.21%）。

圖8 黑加侖酵素發(fā)酵過程中羥自由基清除能力的變化

3 結(jié)論

試驗(yàn)采用單因素和正交試驗(yàn)對(duì)制備黑加侖黑加侖酵素工藝進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，酵母菌發(fā)酵黑加侖酵素最佳發(fā)酵時(shí)間為96 h、酵母菌接種量為0.07%、初始糖度為20%、發(fā)酵溫度為28 ℃。在此最佳工藝條件下，制備的黑加侖酵素總抗氧化能力為880.60 U/mL，SOD酶活力為4 873.13 U/mL，其有機(jī)酸主要種類為：檸檬酸（2 745.27 mg/L）、蘋果酸（448.65 mg/L）、奎寧酸（188.89 mg/L）、莽草酸（23.48 mg/L）、抗壞血酸（19.59 mg/L）和草酸（19.59 mg/L）。該酵素產(chǎn)品對(duì)超氧陰離子自由基、DPPH自由基和羥自由基具有較好的清除能力，具有較好的抗氧化性能。