畢可海，孫玉奉，張伶俐，聶小偉，張玉清

1. 威海海洋職業(yè)學(xué)院食品工程系（威海 264300）；2. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院（泰安 271018）

類胡蘿卜素是一種脂溶性色素，廣泛存在于動物、藻類中的天然色素，常被應(yīng)用于醫(yī)藥和食品行業(yè)[1-2]。由于類胡蘿卜素含有很長的共軛雙鍵，常吃富含類胡蘿卜素的食物能起到延緩衰老、提高免疫力、預(yù)防腫瘤等作用[3-4]。而且類胡蘿卜素還是人體維生素A的主要來源之一，可以維持正常的視覺功能及促進(jìn)生長與生殖等[4]。因此，類胡蘿卜素是人體內(nèi)一種必不可少的物質(zhì)。

海帶是一種營養(yǎng)價值豐富的褐藻，是很多加工食品的原材料[5]。海帶由于富含碘、礦物質(zhì)以及能量低而具有很高藥用價值。中國是海帶生產(chǎn)大國，產(chǎn)量居世界第一[6]，但中國有關(guān)的海帶加工技術(shù)相對比較落后，致使海帶加工產(chǎn)品單一，主要集中在海帶掛面、海帶糕和海帶復(fù)合調(diào)味素等[7-8]，而對海帶深加工提取物如海帶多酚[9]、類胡蘿卜素的研究則不多。

海帶富含類胡蘿卜素，但由于類胡蘿卜素性質(zhì)不穩(wěn)定，光照、紫外線照射、高溫等都會使類胡蘿卜素降解[10]，因此類胡蘿卜素的提取并不容易。試驗(yàn)采用有機(jī)溶劑浸提法從海帶中提取類胡蘿卜素，優(yōu)化類胡蘿卜素的提取條件，為從海帶中提取類胡蘿卜素及其應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

海帶（市售，山東榮成）；抗壞血酸（上海源葉生物）；石油醚、丙酮、甲醇、無水乙醇、氯仿等（均為國產(chǎn)分析純）。

1.2 儀器與設(shè)備

紫外可見分光光度計(jì)（普析通用）；電子天平（奧豪斯儀器（上海））；TG 16-WS離心機(jī)（湖南湘怡實(shí)驗(yàn)室儀器）；KQ-500 DE超聲（昆山市超聲波儀器）。

1.3 海帶預(yù)處理

用超純水清洗海帶，洗去附著在表層的泥沙等物質(zhì)。將清洗好的海帶在50 ℃下真空干燥，粉碎，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 類胡蘿卜素的提取

稱取海帶粉末10 g置于錐形瓶中，加入一定量浸提溶劑，在一定溫度下攪拌提取一定時間后，重復(fù)提取一定次數(shù)，合并提取液，懸蒸濃縮至10 mL，離心，去除雜質(zhì)，取上清液。于448 nm處的分光光度計(jì)中測定吸光度。

1.5 類胡蘿卜素含量的測定

類胡蘿卜素提取液經(jīng)紫外-可見分光光度計(jì)全波長掃描，在400～500 nm之間選擇最大吸收波長448 nm作為類胡蘿卜素吸光度的檢測波長，計(jì)算類胡蘿卜素的提取量如式（1）[11]。

式中：A為448 nm下吸光度；V為提取溶劑用量，mL；D為提取液稀釋倍數(shù)；0.16為消光系數(shù)；W為樣品干質(zhì)量，g。

1.6 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.6.1 不同溶劑對海帶中類胡蘿卜素提取量的影響

分別稱取海帶粉末10 g置于6個500 mL錐形瓶中，每個錐形瓶中分別加入200 mL不同提取溶劑，分別為甲醇、無水乙醇、氯仿、丙酮、石油醚和石油醚-丙酮（1∶1，V/V）的混合溶劑。將錐形瓶在40 ℃條件下水浴加熱并攪拌。提取50 min后，抽濾出提取液，濾渣在相同條件下再次提取，合并提取液。

1.6.2 溫度對海帶中類胡蘿卜素提取量的影響

稱取10 g經(jīng)預(yù)處理的海帶粉末，以200 mL石油醚-丙酮（1∶1，V/V）作為提取溶劑，設(shè)定提取溫度分別為20，30，40，50和60 ℃，提取時間50 min，提取2次，探討溫度對提取海帶中類胡蘿卜素含量的影響。

1.6.3 時間對海帶中類胡蘿卜素提取量的影響

稱取10 g經(jīng)預(yù)處理的海帶粉末，以200 mL石油醚-丙酮（1∶1，V/V）作為提取溶劑，設(shè)定提取時間分別為20，30，40，50，60和70 min，提取溫度40 ℃，提取2次，探討時間對提取海帶中類胡蘿卜素含量的影響。

1.6.4 料液比對海帶中類胡蘿卜含量的影響

稱取10 g經(jīng)預(yù)處理的海帶粉末，以石油醚-丙酮（1∶1，V/V）作為提取溶劑，設(shè)定海帶粉末與提取溶劑的料液比分別為1∶5，1∶10，1∶15，1∶20，1∶25和1∶30（g/mL），提取溫度40 ℃，提取時間50 min，提取2次，探討料液比對提取海帶中類胡蘿卜素含量的影響。

1.6.5 提取次數(shù)對海帶中類胡蘿卜素提取量的影響

稱取10 g經(jīng)預(yù)處理的海帶粉末，置于200 mL石油醚-丙酮（1∶1，V/V）提取溶劑中分別提取1次，2次，3次和4次。提取溫度40 ℃，提取時間50 min，探討提取次數(shù)對海帶中類胡蘿卜素提取量的影響。

1.7 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

通過對有機(jī)溶劑法對類胡蘿卜素提取的單因素試驗(yàn)及結(jié)果分析，選取提取溫度、提取時間、提取料液比3個因素，進(jìn)行正交試驗(yàn)，考查各因素條件對類胡蘿卜素提取量的影響。

1.8 超聲輔助提取對海帶中類胡蘿卜素提取量的影響

稱取10 g經(jīng)預(yù)處理的海帶粉末，置于200 mL石油醚-丙酮（1∶1，V/V）提取溶劑中，將提取樣品置于35 kHz超聲中輔助提取，溫度50 ℃，提取一定時間，提取2次，探討超聲輔助對海帶中類胡蘿卜素提取量的影響。

1.9 抗氧化劑對海帶中類胡蘿卜素提取量的影響

稱取10 g經(jīng)預(yù)處理的海帶粉末，置于200 mL石油醚-丙酮（1∶1，V/V）提取溶劑中。加入1%抗壞血酸，溫度50 ℃，料液比1∶20（g/mL），提取2次，探討抗氧化劑對海帶中類胡蘿卜素提取量的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溶劑對海帶中類胡蘿卜素提取量的影響

類胡蘿卜素是一種脂溶性色素，極性較強(qiáng)，根據(jù)相似相容原理，類胡蘿卜素可能會易溶于極性較強(qiáng)的溶劑中，因此試驗(yàn)選用甲醇、乙醇、氯仿、丙酮、石油醚和石油醚-丙酮（1∶1，V/V）混合溶劑等幾種不同溶劑作為提取溶劑。由圖1可知，不同提取溶劑對海帶中類胡蘿卜素的提取率不同。其中類胡蘿卜素在石油醚-丙酮（1∶1，V/V）混合溶劑中的提取量明顯高于其他幾種溶劑，說明石油醚-丙酮混合溶劑更適合類胡蘿卜素的提取，這與劉長付等[12]的研究結(jié)果一致。因此選用石油醚-丙酮（1∶1，V/V）混合溶劑作為類胡蘿卜素提取溶劑。

圖1 提取溶劑對類胡蘿卜素提取量的影響

2.2 溫度對海帶中類胡蘿卜素提取量的影響

由圖2可知，溫度對類胡蘿卜素提取量影響較大，溫度低于40 ℃時，類胡蘿卜素提取量隨著溫度升高而增大；溫度在40～50 ℃時，類胡蘿卜素提取量受溫度影響較小，趨于平緩；但溫度高于50 ℃時，類胡蘿卜素的提取量明顯降低，這可能是因?yàn)闇囟雀哂?0℃，類胡蘿卜素結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，影響類胡蘿卜素的穩(wěn)定性，使得類胡蘿卜素的提取量降低[10,13]。因此，試驗(yàn)選用類胡蘿卜素的最適提取溫度為40 ℃。

圖2 提取溫度對類胡蘿卜素提取量的影響

2.3 時間對海帶中類胡蘿卜素提取量的影響

由圖3可知，在20～50 min范圍內(nèi)，類胡蘿卜素提取量隨著提取時間延長而升高，提取時間50 min時提取量達(dá)到最大，但提取時間超過50 min后，類胡蘿卜素提取量開始降低。這可能是由于在提取開始時類胡蘿卜素溶出速度大于降解速度，隨著時間延長，類胡蘿卜素在提取溶劑中基本達(dá)到平衡，過長時間提取會對類胡蘿卜素起降解作用，使得胡蘿卜素提取量下降。與空氣中的氧氣接觸，類胡蘿卜素被氧化分解，降低類胡蘿卜素提取量。因此，選用類胡蘿卜素最適提取時間為50 min。

圖3 提取時間對類胡蘿卜素提取量的影響

2.4 料液比對海帶中類胡蘿卜含量的影響

由圖4可知，在一定范圍內(nèi)，類胡蘿卜素提取量隨著料液比增加而增大，料液比為1∶20（g/mL）時，提取量達(dá)到最大；繼續(xù)增大料液比，類胡蘿卜素提取量反而有所降低。這可能是因?yàn)?，初期增大料液比，使得海帶與溶劑充分接觸，增大提取接觸面積，類胡蘿卜素提取量增加。因此，試驗(yàn)選用最適料液比為1∶20（g/mL）。

圖4 提取料液比對類胡蘿卜素提取量的影響

2.5 提取次數(shù)對對海帶中類胡蘿卜提取量的影響

由圖5可知，類胡蘿卜素提取量隨著提取次數(shù)增加而增大，但后2次的提取量變化不明顯。多次提取會增加溶劑使用量和提取時間。從節(jié)約成本和時間的角度考慮，將提取次數(shù)定為2次。

圖5 提取次數(shù)對類胡蘿卜提取量的影響

2.6 正交試驗(yàn)分析

由表2可知，溫度、時間、料液比對提取類胡蘿卜素的影響順序?yàn)椋簻囟龋玖弦罕龋緯r間。說明提取溫度是關(guān)鍵控制因素，對于提取類胡蘿卜素的影響最大，影響較小的是料液比，最小的是提取時間。通過試驗(yàn)分析，類胡蘿卜素的提取最優(yōu)條件為：提取溫度50 ℃、提取時間50 min、料液比1∶20（g/mL）。

將通過試驗(yàn)分析的A2B2C2與通過正交試驗(yàn)分析的A3B2C2進(jìn)行試驗(yàn)比較，發(fā)現(xiàn)在提取溫度40 ℃、提取時間50 min、料液比1∶20（g/mL）時，提取量為0.411 mg/g，而提取溫度50 ℃、提取時間50 min、料液比1∶20時，提取量為0.427 mg/g。因此，選取提取溫度50 ℃、提取時間50 min、料液比1∶20（g/mL）為最優(yōu)提取條件。

2.7 超聲輔助對海帶中類胡蘿卜素提取量的影響

類胡蘿卜素為細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)物，由于細(xì)胞壁的存在采用有機(jī)溶劑浸提法不能充分使類胡蘿卜素溶出，導(dǎo)致提取率下降。近年來超聲波提取技術(shù)由于提取率高，能有效縮短提取時間等優(yōu)點(diǎn)備受關(guān)注。超聲波通過溶劑中小氣泡的形成和破碎會破碎細(xì)胞組織，從而達(dá)到較高提取效率[14]。采用1.8的試驗(yàn)條件進(jìn)行提取，由圖6可知，超聲輔助提取可明顯縮短提取時間并提高類胡蘿卜素提取量，類胡蘿卜素提取量在25 min時可達(dá)0.476 mg/g，增加了11.48%。這可能是因?yàn)槌曌饔每赡軙茐暮У募?xì)胞壁從而有助于類胡蘿卜素的溶出，從而提高類胡蘿卜素提取量。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

圖6 超聲輔助提取對類胡蘿卜素提取量的影響

2.8 抗氧化劑對海帶中類胡蘿卜素提取量的影響

圖7 抗壞血酸對類胡蘿卜素提取量的影響

由于類胡蘿卜素的性質(zhì)不穩(wěn)定，極易被氧化，因此嘗試在提取過程中添加抗氧化劑，探討對類胡蘿卜素提取量的影響。由圖7可知，抗壞血酸的加入可以明顯提高類胡蘿卜素提取量，對比于不添加抗壞血酸的提取方法來說，提取量增加15.46%，達(dá)0.493 mg/g。這可能是因?yàn)轭惡}卜素找中含有的不飽和雙鍵在提取過程中容易被氧化，使得類胡蘿卜素提取量降低；添加抗壞血酸可使類胡蘿卜素防止被氧化，所以類胡蘿卜素可以被充分提取。

3 結(jié)論

試驗(yàn)討論不同提取溶劑、溫度、時間、料液比、提取次數(shù)、超聲輔助及抗氧化劑對類胡蘿卜素提取量的影響。通過試驗(yàn)確定提取海帶中類胡蘿卜素最適條件為：提取溶劑采用石油醚-丙酮（1∶1，V/V）混合溶劑、溫度50 ℃、時間50 min、料液比1∶20（g/mL）、提取2次，類胡蘿卜素提取量可達(dá)0.427 mg/g。通過研究超聲輔助提取，發(fā)現(xiàn)超聲輔助可增大類胡蘿卜素的提取量，達(dá)0.476 mg/g。通過添加抗壞血酸，可更充分提取出海帶中的類胡蘿卜素，可達(dá)0.493 mg/g。海帶是一種較為理想的類胡蘿卜素提取原料，通過超聲輔助或是加入抗氧化劑提取類胡蘿卜素提取效率高、綠色環(huán)保、方便快捷。