朱 鵬 覃 剛 吳莉莉

(四川省遂寧市第一人民醫(yī)院消化內(nèi)科，遂寧市 629000，電子郵箱：tougaozhu001@163.com)

【提要】 肝細胞癌是臨床上常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，預后較差。肝細胞癌的早期診斷有助于臨床早期干預，提高患者生存率。體液活檢是近年來較受關注的惡性腫瘤早期篩查診斷方法，其具有無創(chuàng)、準確、可重復的優(yōu)點。循環(huán)腫瘤細胞(CTC)檢測屬于體液活檢技術(shù)之一，在肝細胞癌的診斷和預后評估中具有重要的臨床價值。本文就CTC在肝細胞癌診斷和預后評估中的應用價值進行綜述。

肝細胞癌是臨床上十分常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，在全球范圍內(nèi)其發(fā)病率均較高，死亡病例約占惡性腫瘤患者的8%[1]。肝細胞癌的致病機制十分復雜，與慢性肝炎病毒感染、遺傳、藥物、環(huán)境等多因素均有關[2]。在我國，由于慢性乙型肝炎病毒及丙型肝炎病毒感染的廣泛流行，每年新發(fā)肝細胞癌總數(shù)為35萬～45萬人，約占全球新發(fā)肝細胞癌患者的40%，造成了嚴重的公共衛(wèi)生負擔[3]。肝細胞癌通常起病隱匿，患者確診時常已處于疾病中晚期，此時缺乏有效的治療手段，因此臨床預后極差。肝細胞癌的早期篩查診斷有助于指導臨床進行針對性干預，尤其是采取根治性手術(shù)切除，從而改善患者的臨床預后[4]。

體液活檢是近年來受到廣泛關注的惡性腫瘤診斷方法，其主要是通過無創(chuàng)技術(shù)檢測實體腫瘤或轉(zhuǎn)移病灶釋放到外周循環(huán)中的腫瘤成分，主要包括循環(huán)腫瘤細胞(circulating tumor cell,CTC)、循環(huán)腫瘤相關DNA及RNA、腫瘤外泌體等[5]。其中CTC檢測作為體液活檢技術(shù)的重要組成部分，在惡性腫瘤患者的診斷、預后及療效評估等方面具有重要價值。除了美國食品藥品監(jiān)督管理局已批準的CellSearch?系統(tǒng)，目前在改進及研發(fā)更為便捷準確的CTC檢測技術(shù)方面也取得一些進展[6]。大量研究顯示，肝細胞癌細胞在疾病早期即可從實體瘤中脫離并進入外周循環(huán)而成為CTC，即使在未發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移的情況下，肝細胞癌患者的CTC計數(shù)亦可長期處于較高水平，且CTC計數(shù)在肝細胞癌的臨床診斷及預后評估中具有較高的價值[7-8]。本文就CTC檢測應用于肝細胞癌臨床診斷及預后評估的研究進展進行綜述，為肝細胞癌的臨床診斷及預后評估提供參考。

1 CTC的檢測方法

1.1 主要檢測方法 CTC是實體腫瘤或轉(zhuǎn)移灶釋放入外周循環(huán)的腫瘤細胞，具有原發(fā)性腫瘤的生物學特性。惡性腫瘤患者的CTC計數(shù)通常極低，約109個紅細胞或106～107個白細胞中僅能檢出1個CTC，而且CTC容易聚集成微栓，這影響了CTC的檢測[9]。目前用于檢測CTC的方法主要有免疫磁性分離富集和基于形態(tài)學的分離富集。其中免疫磁性分離富集的應用最為廣泛，包括CellSearch?、NanoVelcro?、CanPatrol?、CTC-Chip、免疫磁性細胞分選儀、iFISH?、AdnaTest?檢測系統(tǒng)等?；诿庖叻磻?，CTC分選富集方法可分為正性分選及負性分選。其中，正性分選是使用針對腫瘤相關抗原的特異性抗體，對目標CTC進行捕獲和富集；而負性分選則是利用白細胞抗原(如CD45)來去除白細胞。目前，美國食品藥品監(jiān)督管理局僅批準了CellSearch?系統(tǒng)用于CTC的臨床檢測，其可用于乳腺癌、結(jié)直腸癌及前列腺癌患者，該技術(shù)方法能夠在分選富集CTC同時，較好地保存細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)，且商品化的半自動檢測儀可使操作流程明顯簡化，相應的技術(shù)標準也得到了臨床的驗證[10]。CellSearch?系統(tǒng)的檢測原理主要是通過偶聯(lián)上皮細胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule，EpCAM)、細胞角蛋白(cytokeratin，CK)等腫瘤特異表面標志物來富集CTC。經(jīng)免疫分選富集后獲得的CTC還需進一步鑒定，主要方法是固定CTC后使用4,6-二脒基-2-苯基吲哚熒光染料標記細胞核，使用CD45、CK8、CK18、CK19、Ckmix等熒光抗體標記CTC細胞，熒光顯微鏡下的EpCAM+DAPI+CD45-CK+細胞即可定義為CTC[11]。

1.2 新型或改良檢測技術(shù) 目前針對CTC檢測的臨床價值研究大多是基于CellSearch?系統(tǒng)進行，而新型CTC檢測技術(shù)的開發(fā)也多使用CellSearch?系統(tǒng)作為對照。有研究者在嘗試開發(fā)新型CTC分選富集方法以改進CTC的臨床檢測方法，并取得了一些進展。例如，Pang等[12]開發(fā)了一種新型的拉曼散射生物感受器(使磁珠表面的磁性增強)來檢測肝細胞癌患者的CTC，這種生物感受器包含2個主要組成部分，即抗脫唾液酸糖蛋白受體抗體-Fe3O4-Ag復合納米粒子及抗磷脂酰肌醇蛋白多糖3抗體-Au-Ag-5，5-二硫二硝基苯甲酸納米棒；基于臨床標本的驗證試驗結(jié)果顯示，當血液樣本中的肝細胞癌相關CTC在1～100個/mL的濃度范圍內(nèi)，該系統(tǒng)檢測具有較好的線性相關性，具有潛在的臨床檢測價值。Xue等[13]構(gòu)建了集成細胞差相富集與免疫熒光原位雜交的iFISH?檢測平臺，臨床驗證試驗顯示，iFISH?對肝細胞癌 CTC的檢測率高于CellRearch?，其檢出肝細胞癌患者的CTC計數(shù)也高于CellSearch?。Liu等[14]開發(fā)了一種基于高細胞核質(zhì)比(high karyoplasmic ratio，HKR)來分選富集CTC的方法，這種方法無須使用腫瘤特異性標志物對肝細胞癌相關CTC進行標記；驗證試驗結(jié)果顯示，肝細胞癌患者外周循環(huán)中的HKR細胞計數(shù)明顯高于無肝細胞癌者，且存在微血管侵襲的患者HKR細胞計數(shù)更高，此外HKR細胞計數(shù)用于診斷肝細胞癌的受試者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲線下面積也高于基于EpCAM+分選富集的CTC計數(shù)。上述研究結(jié)果為改進應用于肝細胞癌患者的CTC分選富集方法，提供了重要參考。

2 CTC用于肝細胞癌的臨床診斷

無創(chuàng)生物學指標在肝細胞癌的早期篩查及診斷中具有重要的臨床價值，其中應用最廣泛的指標是血清甲胎蛋白，國內(nèi)外各大指南均推薦對肝細胞癌患者(包含疑似患者)常規(guī)檢測甲胎蛋白，并在肝細胞癌治療隨訪的全過程中將甲胎蛋白作為重點監(jiān)測指標[15]。然而，外周循環(huán)中的甲胎蛋白易受機體其他疾病(如卵巢癌、急慢性肝炎、睪丸癌等)或生理狀態(tài)(如妊娠、肝病后肝臟細胞再生等)的影響，臨床上也存在大量全程無甲胎蛋白升高的肝細胞癌患者，從而降低了甲胎蛋白診斷肝細胞癌的準確度[16-17]。因此，臨床上也一直在尋找更為準確的無創(chuàng)生物學指標，以提高對肝細胞癌的診斷效能。CTC作為直接來源于肝細胞癌瘤體的脫落細胞，理論上，只要檢測方法足夠準確，檢測CTC等同于對腫瘤組織進行直接活檢，且CTC的檢測方法具有無創(chuàng)性和可重復性，是十分有價值的無創(chuàng)生物學標志物。

一項薈萃分析結(jié)果顯示，CTC計數(shù)用于診斷肝細胞癌的總體ROC曲線下面積可達0.93(95%CI：0.90～0.95)，且CTC陽性與無復發(fā)生存率及總體生存率存在相關性[18]。這提示CTC計數(shù)在肝細胞癌的臨床診斷方面具有良好的價值。Court等[19]基于NanoVelcro?CTC檢測平臺，使用脫唾液酸糖蛋白受體、聚糖蛋白-3及Ep-CAM作為腫瘤特異性表面標志物對富集CTC進行鑒定，結(jié)果顯示，在97%的肝細胞癌患者中檢出了CTC，CTC計數(shù)(當最佳截斷值為6個/mL時)用于鑒別診斷肝細胞癌患者與健康人的ROC曲線下面積可達0.92，其診斷靈敏度和特異度分別為0.842和0.885；此外，波形蛋白陽性的CTC(EpCAM+細胞的亞組)用于鑒別診斷早期與局部轉(zhuǎn)移患者的ROC曲線下面積可達0.89，診斷靈敏度及特異度分別為0.871及0.900。Chen等[20]使用了Canpatrol? CTC平臺對肝細胞癌患者的CTC進行檢測，結(jié)果顯示在95%的患者中檢出了CTC，CTC計數(shù)與腫瘤巴塞羅那分期、遠處轉(zhuǎn)移及血清甲胎蛋白水平具有相關性，CTC計數(shù)鑒別診斷肝細胞癌轉(zhuǎn)移與非轉(zhuǎn)移患者的ROC曲線下面積可達0.861(95%CI：0.782～0.940)。此外，該研究結(jié)果還顯示，在肝細胞癌患者中上皮性、混雜性和間充質(zhì)性CTC的檢出率分別為53%、83%及57%，而手術(shù)后復發(fā)患者的混雜性和間充質(zhì)性CTC比例更高，說明混雜性及間質(zhì)性CTC是更具有侵襲性及遠處轉(zhuǎn)移能力的CTC表型。上述研究結(jié)果均提示，CTC在肝細胞癌的臨床診斷及預后評估具有良好的應用價值，這為針對肝細胞癌的無創(chuàng)診斷提供了重要參考。

3 CTC用于肝細胞癌的臨床預后評估

CTC作為從實體腫瘤脫離的細胞，仍具有腫瘤相關的生物學特性，包括增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移能力，在外科手術(shù)切除或其他方法治療后，若仍能檢測出CTC，則提示患者存在復發(fā)的風險或已存在隱匿性的遠處轉(zhuǎn)移[21]。因此，CTC計數(shù)在評估肝細胞癌預后方面具有重要的參考價值，尤其是對于接受手術(shù)或其他輔助治療的患者，CTC計數(shù)可用于評估復發(fā)及遠處轉(zhuǎn)移風險。

3.1 CTC計數(shù)與患者臨床預后的關系 肝細胞癌患者的CTC計數(shù)與腫瘤分期、門靜脈癌栓形成及遠處轉(zhuǎn)移等臨床預后因素相關。Ogle等[22]使用了CK、EpCAM、甲胎蛋白、磷脂酰肌醇蛋白多糖3及DNA依賴性蛋白激酶作為特異標志物來檢測肝細胞癌患者的血液CTC計數(shù)，最終在65.2%的肝細胞癌患者中檢出了CTC，而健康對照組均未檢出CTC；同時發(fā)現(xiàn)肝細胞癌患者的CTC計數(shù)與腫瘤大小及門靜脈癌栓形成相關，CTC計數(shù)>1個/mL的患者中位生存時間僅為7.5個月，明顯低于CTC計數(shù)<1個/mL患者的34個月，CTC計數(shù)是影響患者遠期生存的獨立危險因素。Ou等[23]的研究結(jié)果顯示，70.9%的肝細胞癌患者CTC陽性(≥2個/5 mL)，CTC計數(shù)及間充質(zhì)CTC(mesenchymal CTC，MCTC)與高甲胎蛋白水平、多發(fā)病灶、高TNM/巴塞羅那分期、存在腫瘤栓子相關；此外，MCTC計數(shù)還與肝細胞癌早期復發(fā)相關，可用于預測無短期復發(fā)生存率。Qi等[24]采用CanPatrol?CTC富集技術(shù)檢測了肝細胞癌患者的CTC計數(shù)，結(jié)果顯示， 90.18%的患者可檢出CTC(包含并無遠處轉(zhuǎn)移證據(jù)的早期肝細胞癌患者)，術(shù)前CTC計數(shù)≥16/mL及間充質(zhì)樣CTC比例≥2%與早期復發(fā)、肝內(nèi)多處復發(fā)及肺轉(zhuǎn)移相關；此項研究也同時發(fā)現(xiàn)，CTC陽性的慢性乙型肝炎病毒感染患者，在隨訪5個月內(nèi)出現(xiàn)了早期肝細胞癌。上述研究結(jié)果均提示，早期CTC計數(shù)用于評估肝細胞癌患者的臨床預后具有重要價值。

3.2 CTC計數(shù)與手術(shù)后患者預后的關系 肝細胞癌患者接受外科手術(shù)或其他輔助治療后，CTC計數(shù)也可作為復發(fā)、轉(zhuǎn)移及遠期生存的參考指標。例如，Yu等[25]的研究結(jié)果顯示，肝細胞癌患者在手術(shù)切除肝細胞癌后，總體CTC計數(shù)反而較術(shù)前顯著升高，手術(shù)后CTC升高(≥2個/mL)的患者較低CTC(<2個/mL)患者的無病生存期及總生存期更短。Li等[26]發(fā)現(xiàn)，肝臟腫瘤患者(43例肝細胞癌及7例肝轉(zhuǎn)移腫瘤)行射頻消融術(shù)后3 d的CTC水平明顯升高，且CTC計數(shù)升高與肝細胞癌早期復發(fā)相關。分析上述研究結(jié)果的原因，可能是手術(shù)(消融)創(chuàng)傷直接導致部分腫瘤細胞從瘤體上脫落而形成了CTC，因此在手術(shù)切除腫瘤時應更為小心，避免對瘤體的物理擠壓及損傷。而Hao等[27]的研究結(jié)果則顯示，EpCAM+CTC≥3.5個/mL的肝細胞癌患者手術(shù)切除后的復發(fā)率更高于<3.5個/mL的患者，前入路肝切除的患者CTC計數(shù)較傳統(tǒng)入路肝切除患者更低、遠期預后更好。這從側(cè)面反映了肝細胞癌患者術(shù)后CTC計數(shù)升高的原因，即前入路肝細胞癌切除對瘤體的擠壓更少，從而避免了CTC形成。Zhou等[28]的研究結(jié)果顯示，手術(shù)前CTC及調(diào)節(jié)性T細胞計數(shù)較高的肝細胞癌患者發(fā)生術(shù)后復發(fā)的風險高于低計數(shù)水平患者，且EpCAM+CTC≥2.22/mL是患者術(shù)后1年內(nèi)復發(fā)的獨立危險因素。還有研究顯示，特定亞型的CTC及EpCAM+的循環(huán)腫瘤干細胞用于預測手術(shù)后肝細胞癌的復發(fā)具有較高的臨床應用價值[29]。

4 小 結(jié)

CTC計數(shù)用于肝細胞癌的臨床診斷及預后評估具有重要的臨床價值。目前在肝細胞癌CTC檢測方面存在的問題主要有分選富集方法不夠高效，CTC的鑒定特異度有待提高，以及對實驗室及設備要求較高等。隨著CTC檢測技術(shù)的不斷完善以及臨床證據(jù)的積累，CTC必將在肝細胞癌的臨床診治中得到更廣泛的應用，從而使患者更大獲益。