劉春蓮,吳 昕,胡 蓉,王飛苗,裴利國,宋曉霞,張 倩,徐 仙

客觀地評(píng)估卵母細(xì)胞質(zhì)量是人類輔助生殖技術(shù)(ART)研究中的重要內(nèi)容，目前臨床上根據(jù)卵子形態(tài)、極體以及細(xì)胞質(zhì)的指標(biāo)進(jìn)行評(píng)估，但具有主觀性且可預(yù)測(cè)性仍然有限，因此確定卵母細(xì)胞質(zhì)量客觀評(píng)價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)至關(guān)重要。本研究利用激光破膜儀器對(duì)人卵母細(xì)胞進(jìn)行了定量形態(tài)學(xué)研究，系統(tǒng)分析了成熟卵母細(xì)胞的形態(tài)學(xué)參數(shù)，包括卵母細(xì)胞直徑、透明帶厚度、卵周間隙以及極體直徑，監(jiān)測(cè)透明帶硬度變化，評(píng)估這些形態(tài)參數(shù)與卵子受精及胚胎發(fā)育潛能之間的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料：2020年4月-5月在寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，首次接受自體外受精-胚胎移植(IVF-ET)的不孕癥夫婦，排除標(biāo)準(zhǔn)：① 女性年齡≥38歲或卵巢功能減退者；②男性中、重度少弱畸精子癥；③附睪睪丸穿刺周期；④ 供精及贈(zèng)卵周期。共篩選出158個(gè)周期，其中女方年齡22～37歲 (29.4±5.7)歲，男方年齡24～41歲 (32.2±6.3)歲，共獲得1 764枚卵母細(xì)胞復(fù)合物。其中78個(gè)周期接受了激光破膜儀器測(cè)量作為實(shí)驗(yàn)組，80個(gè)常規(guī)周期作為對(duì)照組，該臨床實(shí)驗(yàn)通過寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 控制性超促排卵及卵母細(xì)胞培養(yǎng)：女性患者進(jìn)入超促排卵周期，利用超聲監(jiān)測(cè)卵泡發(fā)育，當(dāng)卵泡直徑達(dá)到18～20 mm時(shí)，給予HCG(UK)，注射后36 h取卵。所有培養(yǎng)液均在37 ℃ 5% CO2的Galaxy S培養(yǎng)箱中平衡，收集的卵母細(xì)胞在裝有IVF培養(yǎng)基(IVF，Vitrolife，瑞典)的皿中培養(yǎng)，覆蓋1.5 ml礦物油(Ovoil-100，Vitrolife，瑞典)，并在培養(yǎng)箱中放置2～4 h，用透明質(zhì)酸酶(80 U/ml，SAGE體外受精，美國)進(jìn)行消化，剝除卵母細(xì)胞周邊的顆粒細(xì)胞，利用光學(xué)顯微鏡觀察卵母細(xì)胞的極體(Polar Body，PB)進(jìn)行篩選，挑選出未成熟的卵母細(xì)胞如生殖小泡(GV)和中期Ⅰ(MⅠ)，將中期Ⅱ(MⅡ)卵母細(xì)胞分別置于20μl的微滴中(MOPS Vitrolife，瑞典)，覆蓋礦物油后培養(yǎng)15 min，捕獲圖像進(jìn)行測(cè)量。將卵子和經(jīng)過密度梯度離心優(yōu)化后的精子共同培養(yǎng)受精，受精后2～3 h撈出卵子于IVF培養(yǎng)液滴，受精后5～6 h進(jìn)行再次測(cè)量和觀察，過夜培養(yǎng)。

1.2.2 卵母細(xì)胞定量形態(tài)學(xué)測(cè)定：利用尼康Diaphot-300倒置顯微鏡對(duì)單個(gè)卵母細(xì)胞進(jìn)行實(shí)時(shí)成像，使用激光破膜成像軟件(Saturn,RI,英國)，測(cè)量卵母細(xì)胞直徑、透明帶厚度、卵周間隙以及胞質(zhì)直徑[1]。選取卵周間隙最寬的部位進(jìn)行畫線，測(cè)量卵母細(xì)胞的直徑和細(xì)胞質(zhì)直徑，在該線的對(duì)面進(jìn)行兩次透明帶(ZP)厚度測(cè)量，并取兩次測(cè)量平均值，卵周膜間隙寬度=卵母細(xì)胞總直徑-(細(xì)胞質(zhì)直徑+透明帶厚度)。

1.2.3 卵母細(xì)胞透明帶硬度測(cè)定：測(cè)量卵母細(xì)胞透明帶在受精前、后的厚度，用激光在透明帶上打一個(gè)孔，能量為14 ms，所有的操作都在覆蓋油的培養(yǎng)液滴中，保持熱臺(tái)溫度，操作結(jié)束迅速放入培養(yǎng)箱中。

2 結(jié)果

2.1 2組獲卵數(shù)、MII獲卵率情況比較:本研究中測(cè)量組78個(gè)周期獲得983枚卵母細(xì)胞，平均獲卵數(shù)12個(gè)，MII獲卵率75%(9/12)，對(duì)照組80個(gè)周期獲得891枚，平均獲卵數(shù)11個(gè)，MII獲卵率77%(8.5/11)，與測(cè)量組相比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 測(cè)量組MII卵子受精前后的形態(tài)參數(shù)比較:使用激光破膜儀器測(cè)量四條徑線，比較MII卵子形態(tài)參數(shù)受精前后變化發(fā)現(xiàn)，受精前后卵母細(xì)胞的直徑和細(xì)胞質(zhì)直徑差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，受精后卵母細(xì)胞的透明帶較受精前卵母細(xì)胞變薄[(15.5±0.4)μm與(13.8±0.4)μm，P<0.05]。此外，與未受精卵母細(xì)胞相比，受精卵母細(xì)胞卵周間隙的寬度[(6.5±0.4 )μm與(5.2±0.3)μm,P<0.05]縮小，卵子受精后透明帶打孔孔徑變小(P<0.05)，見表1。

表1 測(cè)量組MII卵子受精前后的形態(tài)參數(shù)比較

2.3 2組IVF實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)以及臨床結(jié)局比較:比較2組患者接受IVF技術(shù)助孕過程中的各項(xiàng)指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)測(cè)量組受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎率及冷凍胚胎率高于對(duì)照組(P<0.05)，而卵子的兩原核(2PN)卵裂率、著床率和妊娠率無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表2 測(cè)量組與對(duì)照組IVF實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)以及臨床結(jié)局比較[n(%)]

3 討論

自人類輔助生殖技術(shù)應(yīng)用于臨床以來，卵母細(xì)胞的質(zhì)量、形態(tài)與胚胎質(zhì)量的相關(guān)性是輔助生殖技術(shù)中一個(gè)有爭議的話題[2-3]，目前臨床研究集中在觀察細(xì)胞質(zhì)形態(tài)學(xué)的標(biāo)志物，如空泡、粗顆粒、折光體[4]和線粒體[5]等，還有研究利用偏振顯微鏡評(píng)估紡錘體的存在和位置，但研究結(jié)論尚不一致，如何客觀評(píng)估卵子質(zhì)量仍需不斷探索出新的方案，本項(xiàng)研究利用激光破膜儀器測(cè)量卵母細(xì)胞形態(tài)參數(shù)，評(píng)估其對(duì)預(yù)測(cè)受精和臨床妊娠結(jié)局的作用。

MII卵母細(xì)胞的形態(tài)包括形狀、顏色、細(xì)胞質(zhì)的顆粒狀態(tài)和均質(zhì)性、卵周間隙的寬度、卵周間隙碎片、空泡化、第一極體(1st PB)或透明帶的異常情況。李楠等發(fā)現(xiàn)不同形態(tài)的卵母細(xì)胞能夠預(yù)測(cè)胚胎發(fā)育的潛能[6]，有報(bào)道顯示1PB碎裂表明卵母細(xì)胞胞質(zhì)功能下降[7]，較大的卵周間隙空間導(dǎo)致受精率降低[8]，但有研究證實(shí)對(duì)極體的非整倍體研究不能客觀反映胚胎的染色體情況，因此不能提高胚胎的種植潛能[9]，Weghofer客觀指出每個(gè)婦女的卵子直徑差異較大，接近平均直徑的卵母細(xì)胞其發(fā)育潛能最佳，研究證實(shí)卵母細(xì)胞直徑與體重指數(shù)(BMI)及抗繆勒管激素(AMH)(P =0.03)呈負(fù)相關(guān)，與受精率呈正相關(guān)(P =0.008)[10]。肥胖婦女卵子胞質(zhì)直徑與妊娠呈負(fù)相關(guān)，胞質(zhì)直徑較大且透明帶厚度較薄的卵子其妊娠結(jié)局越好[11]，卵周間隙較窄且透明帶不均質(zhì)的卵子的兩原核(2PN)率、受精率以及妊娠率均下降，選擇卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射技術(shù)(ICSI)是可行的助孕方式[12]。研究發(fā)現(xiàn)直徑較小的卵母細(xì)胞減數(shù)分裂成熟受到抑制，可能是由于細(xì)胞大小依賴性檢查點(diǎn)或缺乏減數(shù)分裂所需的物質(zhì)導(dǎo)致，也就是說在卵母細(xì)胞生長的最后階段，需要提供發(fā)育潛能的物質(zhì)，如增加卵母細(xì)胞的大小，卵母細(xì)胞與透明帶(ZP)內(nèi)表面的連接增加了，極體排出和卵母細(xì)胞減數(shù)分裂恢復(fù)使卵母細(xì)胞體積變小。Azita認(rèn)為卵母細(xì)胞直徑可用作預(yù)測(cè)胚胎卵裂時(shí)間的標(biāo)志[13]，本研究回顧性地分析了MII卵母細(xì)胞的形態(tài)學(xué)參數(shù)對(duì)受精和妊娠結(jié)局的預(yù)測(cè)價(jià)值，與沒有進(jìn)行測(cè)量的周期相比，卵母細(xì)胞及胞質(zhì)直徑在受精前后無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，該結(jié)論和Romao研究一致[14]，但透明帶和卵周間隙直徑在受精后小于受精前，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，卵泡成熟過程中形成的透明帶的晶體網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)最佳的有序結(jié)構(gòu)，相反“無序”的透明帶結(jié)構(gòu)的卵子發(fā)育潛能較差。因此推測(cè)透明帶的正常結(jié)構(gòu)完整性可能反映卵母細(xì)胞及其各種細(xì)胞的最佳發(fā)育潛能和分子結(jié)構(gòu)，透明帶反應(yīng)較好的卵母細(xì)胞具有最佳發(fā)育植入能力；研究表明利用激光在2細(xì)胞期、桑葚胚以及囊胚期透明帶減薄術(shù)以及打孔術(shù)對(duì)胚胎發(fā)育和孵化沒有負(fù)面作用[15]。本研究通過監(jiān)測(cè)激光打孔的直徑作為間接評(píng)估透明帶厚度的指標(biāo)，直徑越小，表明透明帶厚度越硬，透明質(zhì)酸酶不影響透明帶厚度和結(jié)構(gòu)，受精后的透明帶變硬，阻止多精受精發(fā)生，保護(hù)胚胎不受外界影響并便于在輸卵管運(yùn)輸?shù)竭_(dá)子宮著床。

常規(guī)短時(shí)受精后，通過判斷2PB的出現(xiàn)評(píng)判受精與否，具有一定主觀性，易出現(xiàn)判讀失誤，導(dǎo)致受精率下降或過度補(bǔ)救，而常規(guī)方法結(jié)合激光破膜儀監(jiān)測(cè)指標(biāo)可提高判斷準(zhǔn)確性，從而提高受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、可移植胚胎率以及胚胎冷凍率，成為臨床上可供選擇的方法。