周 強， 潘清清， 沈 敏， 陳霜霜

（1.重慶市銅梁區(qū)中醫(yī)院檢驗科，重慶 402560；2.寧波美康生物參考實驗室，浙江 寧波 315104）

萬古霉素是20世紀50年代從鏈霉菌中分離得到的糖肽類抗菌藥物，其作用機制主要是阻礙細菌細胞壁的合成，改變細菌細胞膜的通透性并影響RNA的合成[1]，對革蘭陽性菌有強大的抗菌作用，臨床上主要用于治療革蘭陽性菌引起的嚴重感染[2]，尤其對目前臨床治療較為棘手的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）、耐甲氧西林表皮葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus epidermidis，MRSE）和腸球菌耐藥菌株感染有較好的療效[3]，且不易產(chǎn)生耐藥[4]。由于萬古霉素有較高的谷濃度，臨床療程長，所以有一定的耳、腎、肝及神經(jīng)系統(tǒng)毒性，易出現(xiàn)靜脈滴注相關性不良反應等[5]，這些不良反應與血藥濃度（30～65 μg/mL），尤其是谷濃度過高有關[6-7]；但如果血藥濃度過低，易誘導產(chǎn)生耐藥菌，導致治療失敗。因此，臨床使用萬古霉素時必須嚴格控制劑量，這就需要進行治療藥物監(jiān)測（therapeutic drug monitoring，TDM），以指導個體化用藥[8-9]，特別是對于老年患者和腎功能不全患者，需根據(jù)TDM結(jié)果及時調(diào)整用藥方案，使血藥濃度能維持在一個相對安全的范圍內(nèi)，避免耳、腎功能損傷。美國感染病學會（the Infectious Diseases Society of America，IDSA）、美國衛(wèi)生系統(tǒng)藥師學會（American Society of Health-System Pharmacists，ASHP）和感染病學藥師協(xié)會（the Society of Infectious Diseases Pharmacists，SIDP）于2011年發(fā)布的萬古霉素治療指南及2016年發(fā)布的醫(yī)院獲得性肺炎和呼吸機相關肺炎管理指南建議將萬古霉素的血清谷濃度控制在10～20 mg/L，至少需要保持在10 mg/L以上[10]，以獲得最優(yōu)的抗感染效果及最小的腎毒性。目前，萬古霉素的血藥濃度測定方法主要有微生物檢測法、酶放大免疫測定法（enzyme multiplied immunoassay technique，EMIT）、熒光偏振免疫分析法（fluorescence polarization immunoassay，F(xiàn)PIA）[11]、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）[12]和高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）[13]等。在這些方法中，F(xiàn)PIA具有全自動化、快速的優(yōu)點，但其試劑昂貴、專屬性差，且檢測結(jié)果的準確性和重復性不佳，往往導致臨床作出錯誤的判斷，給治療方案的調(diào)整帶來很大困難[14]。微生物檢測法無需特殊的儀器，成本低、操作簡單，但用時過長，結(jié)果受多種因素影響，且不適用于微量樣本的測定。HPLC雖然檢測限和精密度沒有FPIA高，但特異性強，結(jié)果準確，對微量濃度樣本更具優(yōu)勢，在國內(nèi)應用較為普遍[15]。本研究在采用HPLC測定萬古霉素血藥濃度的方法[16]的基礎上，對色譜條件和樣本前處理進行優(yōu)化，以期能建立一種基于超高效液相色譜（ultra performance liquid chromatography，UPLC）技術(shù)的快速、準確、靈敏的更適合臨床常規(guī)TDM的方法，為降低藥物檢測及治療成本，指導臨床合理使用萬古霉素提供理論參考。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2019年4—5月使用萬古霉素進行抗感染治療的患者50例，其中男36例、女14例，年齡50～90歲；所患疾病包括尿毒癥、顱內(nèi)感染、腦梗死后遺癥、肺炎、關節(jié)炎、膀胱腫瘤、慢性阻塞性肺疾病等。該50例患者的合格血清樣本分成 2份，-20 ℃保存待測。

1.2 儀器與試劑

SHIMADZU LC-30A高效液相色譜儀（日本島津公司）、Phenomenex Kinetex C18色譜柱（2.6 μm，100 mm×2.1 mm）、XS 205DU型分析天平（瑞士METTLER TOLEDO公司）、Multi Reax漩渦混合器（德國Heidolph公司）、Eppendorf 5427R高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司）、SevenMulti S40K型pH計（德國梅特勒-托利多有限公司）、Eppendorf移液器（德國Eppendorf AG公司）、PS-10型無油隔膜式真空泵（天津津騰實驗設備有限公司）、T-50型溶劑過濾器（天津津騰實驗設備有限公司）、容量瓶（日本ASone公司）、Milli-Q超純水系統(tǒng)（德國Millipore公司）。

鹽酸萬古霉素標準品（純度為100.0%，批號為0477708）購自美國Cayman公司。去甲萬古霉素標準品（純度為83.4%，批號為130338-200303）購自中國食品藥品檢定研究院。磷酸二氫鉀（色譜級）和正磷酸（色譜級）均購自美國Thermo Fisher公司。七水合硫酸鋅為生物試劑，購自美國Sigma公司。甲醇（質(zhì)譜級）和乙腈（質(zhì)譜級）均購自美國Thermo Fisher公司。實驗用水為Milli-Q水。

1.3 溶液配制

1.3.1 標準品與內(nèi)標品配制 精密稱取萬古霉素標準品24.89 mg（經(jīng)鹽酸萬古霉素標準品分子量換算后得出，實際稱取鹽酸萬古霉素標準品25.52 mg）于小燒杯中，加水溶解并多次潤洗轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中稀釋混勻，制備995.6 μg/mL萬古霉素標準儲備液，-20 ℃避光密封保存。分別精密量取不同體積的萬古霉素標準儲備液，加水溶解并稀釋混勻，制備成19.9、49. 8、99.6、199.1、497.8、995.6 μg/mL共6個濃度梯度的萬古霉素標準工作液，4 ℃避光密封保存。精密稱取去甲萬古霉素13.73 mg于小燒杯中，加水溶解并多次潤洗轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中稀釋混勻，加水溶解并稀釋混勻，制備458.0 μg/mL去甲萬古霉素內(nèi)標工作液，4 ℃避光密封保存。

1.3.2 流動相配制 精密稱取磷酸二氫鉀3.4 g，加入1 000 mL Milli-Q水中，置于電動攪拌器上，用磷酸調(diào)節(jié)pH值為2.5，配制成25 mmol/L磷酸二氫鉀緩沖液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜抽濾。

1.3.3 沉淀劑的配制 精密稱取8.63 g七水合硫酸鋅，加水溶解并稀釋混勻，配制成0.3 mol/L硫酸鋅溶液，4 ℃避光密封保存，作為沉淀劑。

1.4 方法

1.4.1 樣本前處理 在室溫下，準確吸取200 μL血清樣本于1.5 mL離心管中，加入458.03 μg/mL內(nèi)標溶液20 μL，旋渦混合1 min后，加入50 μL蛋白沉淀劑（0.3 mol/L硫酸鋅溶液），1 986 r/min水平振蕩5 min，隨后23 000×g高速離心10 min，取上清液進樣。

1.4.2 色譜條件 色譜柱為Phenomenex Kinetex C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，2.6 μm），流動相A為25 mmol/L磷酸二氫鉀緩沖液（pH值為2.5），流動相B為乙腈，流速為0.5 mL/min，柱溫為40 ℃，檢測波長為220 nm；進樣量為10 μL，梯度洗脫（0.01→3.00 min，3%B→9%B；3.00→6.50 min，9%B；6.50→6.75 min，9%B→80%B；6.75→10.25 min，80%B；10.25→10.50 min，80%B→3%B；10.50→15 min，3%B）。

1.5 檢測方法性能評估

1.5.1 標準曲線與線性評價 取健康人空白血清180 μL，加入不同濃度的萬古霉素標準工作液各20 μL，混勻，分別配制成濃度為2.0、5.0、10.0、19.9、49.8、99.6 μg/mL的萬古霉素血清樣本。按上述樣本前處理條件進行處理上樣檢測，每個濃度平分成3份，每份重復檢測3次，取均值。各個濃度的檢測偏移＜15%，且r＞0.99可判斷為呈線性。

1.5.2 檢測限與定量限 采用空白血清加標方式，取適量萬古霉素標準液，制備包括定量限預期濃度在內(nèi)的3個濃度梯度的稀釋樣本，混勻，分別計算出每個濃度梯度樣本的理論值（C1），然后將定量限樣本各一式五份進行處理后檢測，得到實測值（C2），將同時滿足偏移＜20%、變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）＜20%、信噪比（signal-to-noise ratio，RSN）≥10的濃度值定義為定量限，將RSN=3的計算濃度值定義為檢測限。

1.5.3 攜帶污染率 取180 μL血清，分別加入低、中、高3個濃度的萬古霉素標準品工作液20 μL，混勻，配制成3個濃度 [低（L）=2.0 μg/mL，中（M）=19.9 μg/mL，高（H）=79.6 μg/mL）的加標樣本，按照上述樣本前處理條件進行處理，每份樣本一式三份。按L1（低）、L2（低）、M（中）、L3（低）和L1（低）、L2（低）、H（高）、L3（低）的進樣順序來觀察攜帶污染。攜帶污染率（%）=（L3-L2）/（H-L2）×100%，若攜帶污染率低于預定標準（1%），則認為在測定該高值及以下時不存在明顯的攜帶污染。

1.5.4 回收率測定 取3個不同濃度的萬古霉素標準品，分別添加到空白血清中，混勻，配制成2.0、19.9、79.6 μg/mL的加標樣本，分別計算出理論值，然后將各個濃度的加標樣本（各5份）進行處理后進樣檢測，得到實測值，計算加標回收率?；厥章试?0%～110%為可接受。

1.5.5 精密度測定 取3個不同濃度的萬古霉素標準品，分別添加到空白血清中，混勻，配制成2.0、19.9、79.6 μg/mL的混合血清樣本，將混合血清樣本分裝后-70 ℃保存，每個濃度樣本每批次各5份，進行樣本前處理，連續(xù)測定3個批次，每天需要得到3條獨立的標準曲線，分別計算批內(nèi)CV和批間CV。

1.5.6 穩(wěn)定性 以精密度驗證樣本中的低濃度血清樣本為穩(wěn)定性研究樣本，從以下2個方面評估目標分析物的穩(wěn)定性：（1）在生物基質(zhì)中的穩(wěn)定性，包括室溫放置4和8 h的短期穩(wěn)定性、-20 ℃下反復凍融3次的穩(wěn)定性；（2）處理后樣本的穩(wěn)定性，包括處理后室溫放置的穩(wěn)定性、處理后自動進樣器放置的穩(wěn)定性。

1.6 患者樣本測定

取50例患者的血清樣本，分別采用本法和文獻報道的經(jīng)過驗證的HPLC[16]進行檢測，用相應的標準曲線計算樣本中萬古霉素的濃度。每個分析批均測定配制的低濃度（2.0 μg/mL）、中濃度（19.9 μg/mL）、高濃度（79.6 μg/mL）質(zhì)控樣本。每個濃度樣本各5份，分別計算CV和偏移。

1.7 統(tǒng)計學方法

采用Excel 2013軟件和Origin 8.5軟件進行統(tǒng)計分析。以經(jīng)驗證的HPLC[16]作為比對方法，評價本法測定結(jié)果的準確性。并采用Bland-Altman圖形分析法評價2種方法之間的偏移。

2 結(jié)果

2.1 方法專屬性

在本研究建立的前樣本處理方法和色譜分離條件下，測定純標對照品、空白血清、含藥血清加內(nèi)標的色譜圖見圖1。萬古霉素與去甲萬古霉素達到基線分離，且空白血清在萬古霉素和去甲萬古霉素出峰處無明顯雜質(zhì)峰干擾，峰形良好，內(nèi)標去甲萬古霉素和萬古霉素的保留時間分別為4.677 min和5.008 min，檢測時間為15 min。同時對比4份不同來源個體的空白血清和其加標血清，4份空白血清在萬古霉素和去甲萬古霉素出峰處無明顯雜質(zhì)峰干擾，表明不同個體之間的基質(zhì)對本法的檢測結(jié)果無干擾，見圖2。

2.2 標準曲線與線性評價

UPLC檢測血清萬古霉素的線性范圍為2.0～99.6 μg/mL，線性方程為Y=11.389 3X+0.010 110 7（r=0.999 9）。見圖3。

圖1 萬古霉素專屬性色譜圖

圖2 不同血清基質(zhì)下的色譜圖

圖3 UPLC檢測血清萬古霉素的標準曲線

2.3 檢測限與定量限

UPLC檢測血清萬古霉素的定量限為1.0 μg/mL，檢測限為0.1 μg/mL。見表1。

2.4 攜帶污染率

根據(jù)公式計算得中濃度樣本（19.9 μg/mL）的平均攜帶污染率為0.57%，高濃度樣本（79.6 μg/mL）的平均攜帶污染率為0.19%，可認為本法不存在明顯的攜帶污染。見表2。

2.5 加標回收實驗

以標準曲線回歸方程計算樣本濃度，依據(jù)實測值與理論值的具體比值計算回收率。加標后3種濃度的血清樣本平均回收率分別為104.06%、99.80%、100.19%，見表3。

表1 萬古霉素的定量限評估結(jié)果

表2 UPLC檢測萬古霉素的攜帶污染率 %

表3 UPLC檢測萬古霉素的加標回收率結(jié)果

2.6 精密度評價

采用UPLC定量檢測混合血清的萬古霉素濃度，低、中、高濃度樣本的平均批內(nèi)CV分別為3.28%、2.21%、2.59%，批間CV分別為5.73%、2.75%、0.82%，見表4。

表4 精密度評價結(jié)果

2.7 穩(wěn)定性

2.7.1 在生物基質(zhì)中的穩(wěn)定性 低濃度血清樣本在室溫[（23±2）℃]放置4和8 h、-20 ℃反復凍融3次的情況下穩(wěn)定。見表5。

2.7.2 處理后樣本的穩(wěn)定性 樣本處理后在室溫[（23±2）℃]放置24 h和在自動進樣器（溫度為8 ℃）放置24 h均非常穩(wěn)定。見表6。

表5 生物基質(zhì)樣本不同條件放置的穩(wěn)定性結(jié)果

表6 樣本處理后不同條件放置的穩(wěn)定性結(jié)果

2.8 方法比對及患者血清樣本測定結(jié)果的比較

2.8.1 方法比對 2種方法測定質(zhì)控樣本無明顯差異，一致性較好。本法測定3個濃度質(zhì)控樣本的CV分別為6.07%、3.14%和2.53%，偏移分別為1.67%、-0.57%和-0.44%；UPLC法測定的3個濃度質(zhì)控樣本的CV分別為6.92%、5.38%和2.92%，偏移分別為1.00%、-0.85%和-0.90%。見表7。2種方法的比較結(jié)果見表8。

表7 UPLC和HPLC測定質(zhì)控樣本的結(jié)果比較

表8 UPLC和HPLC的比較

2.8.2 患者血清樣本測定結(jié)果的比較 分別采用UPLC和HPLC測定50例患者的血清萬古霉素濃度。以HPLC測定結(jié)果為X，UPLC測定結(jié)果為Y，2種方法的線性擬合方程為Y=0.970 8X+0.471 3（r=0.991 9），見圖4。采用Bland-Altman圖形分析法進行分析，2種方法的測定結(jié)果相關性良好，平均偏移為0.07%，見圖5。

圖4 HPLC與UPLC萬古霉素測定結(jié)果的比較

圖5 HPLC與UPLC萬古霉素測定結(jié)果的Bland-Altman偏移圖

3 討論

近年來，隨著不同種類、不同機制抗菌藥物的不斷面世和臨床濫用抗菌藥物現(xiàn)象的不斷加劇，在過去的10年內(nèi)，關于萬古霉素治療失敗的案例全世界不同地區(qū)頻頻被報道。因此，開發(fā)出快速、精準的萬古霉素濃度檢測方顯得尤為重要。本研究在文獻報道的HPLC法測定萬古霉素血藥濃度的基礎上，基于UPLC技術(shù)建立了一種快速、準確、靈敏的，更適用于臨床常規(guī)血藥濃度監(jiān)測的方法。

本研究在建立方法時主要考慮檢測波長、流動相、蛋白沉淀劑的種類及體積的選擇。在波長的選擇上，本研究對比了280 nm（《中華人民共和國藥典》規(guī)定的檢測波長）和236 nm（國內(nèi)大多數(shù)文獻選擇的波長）。除了這2種技術(shù)外，還有在210 nm 波長下測定的方法學報道[17]。本研究嘗試了不同的波長，綜合考慮，在樣本中雜質(zhì)不干擾檢測的情況下選擇了靈敏度較高的波長（220 nm）作為檢測波長。在流動相的選擇上，本研究進行了適當改進，采用乙腈為有機相，25 mmol/L磷酸二氫鉀緩沖液（pH值為2.5）為水相，使萬古霉素和去甲萬古霉素與血清雜質(zhì)分離完全，且峰形良好，采用梯度洗脫，在萬古霉素和內(nèi)標出峰后提高有機相的比例，盡快將樣本中的雜質(zhì)洗脫出來，保留時間合理，提高了檢測效率。在樣本前處理方面，本研究以0.3 mol/L硫酸鋅（50 μL）為蛋白沉淀劑，對文獻報道的濃度和加入量[18]進行微調(diào)。在預試驗中，我們對7種蛋白沉淀劑及體積進行了對比，分別為甲醇∶乙腈∶6%高氯酸（1∶1∶6）50 μL、100 μL和200 μL，乙腈∶甲醇（1∶1）500 μL，0.3 mol/L硫酸鋅50 μL、100 μL和200 μL，0.3 mol/L硫酸鋅∶乙腈（1∶1）50 μL、100 μL和200 μL，6%高氯酸200 μL，乙腈∶異丙醇（1∶1）200 μL、10%硫酸鋅50 μL和100 μL。從沉淀效果看，除乙腈∶甲醇（1∶1）500 μL、乙腈∶異丙醇（1∶1）200 μL、甲醇∶乙腈∶6%高氯酸（1∶1∶6）50 μL未能得到透明、無色的上清液外，其他相對應體積的蛋白沉淀劑經(jīng)高速離心后均可得到透明、無色的上清液，其中0.3 mol/L硫酸鋅50 μL的沉淀效果最好，操作簡單，響應值最高，峰形最佳。

本研究結(jié)果顯示，UPLC檢測血清萬古霉素濃度的線性范圍為2.0～99.6 μg/mL，定量限和檢測限分別為1.0和0.1 μg/mL，靈敏度和線性范圍完全能夠滿足常規(guī)檢測的要求。精密度評價結(jié)果顯示，UPLC檢測低、中、高濃度樣本的平均批內(nèi)CV分別為3.28%、2.21%、2.59%，批間CV分別為5.73%、2.75%、0.82%；3種濃度（2.0、19.9、79.6 μg/mL）的加標樣本平均加標回收率分別為104.06%、99.80%、100.19%，中濃度樣本的攜帶污染率為0.57%，高濃度樣本的攜帶污染率為0.19%。UPLC與HPLC（比對方法）測定質(zhì)控樣本的結(jié)果差異不大，一致性較好；測定患者樣本的結(jié)果相關性良好，平均偏移為0.07%。HPLC采用的是高比例的水相進行等度洗脫，進行樣本分析時未用高比例有機相沖洗色譜柱，長時間使用時樣本中的脂溶性物質(zhì)易污染色譜柱。的色譜分析時間（15 min）比文獻報道的HPLC（8 min）長，但有利于保護色譜柱，且2個目標峰在6 min內(nèi)全部出峰，適用于批量檢測，文獻報道的HPLC[16]2個目標峰在7.5 min內(nèi)才完全出峰。uPLC前處理采用的是蛋白沉淀，方法快速、簡便，而文獻報道的HPLC[16]采用的是液液萃取，需要在60 ℃條件下蒸干40 min，操作較為繁雜、耗時。

綜上所述，本研究建立的基于UPLC技術(shù)測定血清萬古霉素的方法具有重現(xiàn)性好、快速、簡便、靈敏度高和準確度高等特點，可用于藥物代謝動力學研究和TDM，為臨床合理、安全用藥提供保障。